专利名称：吞噬的分析方法
技术领域：
本发明涉及程序性细胞死亡或凋亡领域，尤其涉及凋亡细胞被其它细胞迅速吞噬的现象。本发明提供用于测定凋亡细胞吞噬的分析方法和材料。这些分析可用于确定影响凋亡细胞吞噬并具有潜在药理学活性的化学物质。本发明的分析可适用于用多孔板进行的培养基和高通量筛选。
在组织发育和维持过程中，大量细胞历经程序性死亡或凋亡。在脊椎动物和无脊椎动物中都可观察到。例如，在线虫C.elegans中，131个细胞经历程序性死亡(Lui和Hengartner(1997)1997国际蠕虫会议，摘要371)。凋亡细胞的裂解是潜在有害的，引起内容物可能引起对周围组织的毒性损伤。因凋亡细胞被其他细胞吞噬并随之降解，因此可避免这种有害作用。在哺乳动物中，吞噬细胞为专业性或半专业性吞噬细胞，如嗜中性细胞或吞噬细胞，或吞噬细胞为死亡细胞的邻近细胞。
程序性细胞死亡或凋亡的关键特性之一，是死亡细胞被吞噬细胞识别并吞噬的速度(Sayill,J.等，今日免疫学，14:131-136,1993)。凋亡触发一系列独特的事件，如细胞表面磷脂酰丝氨酸表达，DNA片段化或梯子化和膜结合的细胞片段又称凋亡小泡和小体的释放(Cohen,J.J.等免疫学综述年刊，10:267-293,1992.；Kerr J.F.R.等，英国癌症杂志，26:239,1972.)。凋亡细胞和小体通过识别磷脂酰丝氨酸和其它针对凋亡物质的表面的独特的未确定的配体的不同受体而被吞噬(Savill,J.S.等，临床研究杂志，83:865-875,1989,；Fadok,V.A.等，免疫学杂志,148:2207-2216,1992。Savill,J.等，自然，343:170-173,1990.)。通过此种方式，含有潜在发炎因子的凋亡细胞被半专业性吞噬细胞或巨噬细胞系的邻近细胞迅速清除而不引起炎症反应(Fadok,V.A.等，临床研究杂志，101:890-898,1998)。
凋亡的过程与多种人类疾病相关，包括癌症，自身免疫疾病，多种神经变性疾病，如肌萎缩侧索硬化，遗传性慢性舞蹈病，和老年性痴呆，中风，心肌梗塞和艾滋病(Thompson,CB,科学267,pp1456-1462)。因此，对凋亡机制和控制该机制的基因的研究赢得愈来愈多的关注，人们力图发展对这些疾病的新的治疗方法。
某些疾病与吞噬凋亡小体造成的损伤相关。这样的疾病包括自身免疫疾病如系统性红斑狼疮(Herrmann,M.等，风湿性关节炎，41:1241-1250,1998。),AIDS(Zocchi,M.R.等，AIDS,11:1227-1235,1997.)，急性肺侵染(Cox,G.等，美国呼吸杂志，细胞分子生物学，12:232-237,1995)和过敏反应(Ying,S.等，美国医生联合会会刊，109:42-50,1997)。很明显，通过药物对凋亡细胞吞噬的调节是未来治疗的方向。
脊椎动物中凋亡细胞的吞噬作用是非常复杂的过程，目前尚不清楚死亡细胞产生的信号是如何被吞噬细胞接收并传导的。
在雌雄同体的线虫中观察到凋亡细胞的迅速吞噬，该蠕虫提供了研究吞噬过程的有效手段。例如，在线虫中鉴别的影响吞噬的6个基因，ced-1,ced-2,ced-5,ced-6,ced-7和ced-10。本发明的单独选中ced-6进行特别的研究。已知ced-6在染色体Ⅲ的图谱靠近线虫的daf-4(Lui和Hengartner(1997)；Lui和Hengartner(1996)东海岸蠕虫会议摘要128)。此项工作表明来自此区的两个粘粒，F56D2和F43F12可挽救线虫ced-6(n1813)吞噬缺失。来自F56D2的10kbXhoⅠ的亚克隆具有拯救活性，同时携带ced-6基因。
本发明者鉴别了线虫ced-6的2个人类同源物，(hlced-6和h2ced-6)，h2ced-6是h1ced-6的剪切变体，因此作为线性阴性模型。两种同源物都存在于人细胞系THP-1中。hCED-6和线虫CED-6之间有惊人的序列同源性。hCED-6具有磷脂酰酪氨酸结合区，从氨基酸11-氨基酸190，如图4所示，说明与酪氨酸激酶信号传导通路有关。
H1CED-6和h2CED-6蛋白和它们编码核酸可用于进行本文的分析，鉴定作为促进凋亡细胞吞噬作用的信号传导通路的抑制剂或增强剂的化合物。特别地，它们在鉴别h1CED-6和h2CED-6的抑制剂或增强剂，或其转录的抑制剂或增强剂过程中有效。这些抑制剂或增强剂可作为有用的治疗剂用于对前述的疾病的治疗。
本发明的第一方面提供了一种能够表达h1CED-6或h2CED-6表达载体，该载体包括编码图4或图5的氨基酸序列或与图4或图5的氨基酸相比仅仅发生生物功能保守性的变化的氨基酸序列的脱氧核苷酸序列。
本文定义的术语“生物功能”指调节或影响凋亡细胞吞噬作用的能力。“保守的”氨基酸变化是那些虽然比野生型人CED-6蛋白的生物功能水平高或低，但可保持生物功能的变化。这些保守的变化包括一个或更多氨基酸插入或缺失或一个或更多氨基酸被其它氨基酸或具有相似化学特性的酸取代。使氨基酸发生保守性变化的方法为本领域技术人员所熟知。
在一个优选的实施方案中，表达载体为包括图2或图3所示的从转录起始密码子到转录终止密码子的脱氧核苷酸序列和任意的包括图2或图3中所示的脱氧核苷酸序列的载体。
在一个尤其优选的实施方案中，本发明的表达载体包括编码报告基因的核苷酸序列，h1CED-6或h2CED-6的表达可导致该报告基因的表达。此报告基因可置于h1ced-6或h2ced-6的3’或5’端，可作为与h1CED-6或h2CED-6的融合蛋白表达。合适的报告基因是可以表达荧光产物如绿色荧光蛋白(GFP)基因。其它适当的报告基因有酶，如β-半乳糖苷酶或荧光素酶，这些酶能过作用于底物产生可检测的产物，例如荧光产物或发光产物。根据本发明表达产物的例子有分别在图29和10中显示的pGA3103和pGA3104。
在另一个优选的实施方案中，本发明的表达载体在h1CED-6和h2CED-6蛋白的氨基和/或羧基末端表达表位标签。例如质粒pBAD/HisA-h1ced-6，其序列如
图17中所示。
上述的表达载体不仅包括编码h1CED-6和h2CED-6或其功能变体的序列，还包括可操作的与核酸相连的调节序列，如能影响DNA片段表达的启动子区。术语“可操作的连接”指一种并列的关系，其中描述的组分允许序列以预期的方式发挥功能。
表达所需的调节元件包括与RNA多聚酶结合，指导转录起始的适当水平和的启动子序列和与核糖体结合的翻译起始序列。例如，细菌表达载体可包括启动子如lac启动子和翻译起始的核糖体结合序列和起始密码子AUG。相似的，真核表达载体可包括RNA聚合酶Ⅱ的异源或同源启动子，下游聚腺苷酸化信号，起始密码子AUG，和核糖体脱离的终止密码子。这些载体可从商业渠道获得或运用本领域熟知的方法装配描述的序列。用于表达载体的启动子序列包括ΔHSP,CMV,SV40,EF-1α,UbC,SG,RSV,TRE/minCMV,HSV TK,5’,LTR和QBISP136增强的CMV。
本文描述的表达载体的实施例为质粒，但也可为病毒或噬菌体载体。这些载体通常具有一个复制起点和一或更多选择标记物如抗生素抗性的基因。尤其优选本发明的表达载体适于哺乳动物细胞转染，从而为载体提供相应的选择标记。
本发明的第二方面提供了用上述的表达载体转染的哺乳动物细胞系。转染哺乳动物细胞的方法众所周知。该细胞系可在单层培养或悬浮培养中生长。适当的细胞系为成纤维细胞系或上皮细胞系如COS1,BHK21,L929,pc12,CV1,SWISS3T3,HT144,IMR32,HEPG2,MDCK,MCF7,293,Hela,A549,SW48或G361。也可用原代细胞系如人皮肤FIBs，皮肤角质形成细胞，白细胞，单核细胞，淋巴细胞，树突细胞或巨噬细胞。在本发明的吞噬分析中，尤其优选表达h1CED-6和h2CED-6的哺乳动物专业性或半专业性吞噬细胞，如鼠巨噬细胞系J774或人单核细胞系THP1(见实施例3和图6)。以上两种细胞系可作为单核细胞系，因单核细胞系能分化为本发明分析所用的巨噬细胞。
本发明第三方面提供了测定化合物为促进凋亡细胞吞噬的信号传导通路的增强剂或抑制剂的方法，该方法包括使转染有上述的h1ced-6或h2ced-6的哺乳动物细胞暴露给凋亡颗粒，在化合物存在或缺失时测定颗粒的吞噬速率。待测化合物优选在凋亡颗粒前加入。
适当的凋亡颗粒是发生凋亡并视需要而定在血清中调理的细胞，如嗜中性粒细胞，淋巴细胞，红细胞，或树突细胞。适于形成凋亡颗粒的细胞包括细胞系L929和PC12。一种特别优选用作凋亡颗粒的细胞系是生长因子依赖的鼠细胞系Ba/F3。它们可在标准培养基中生长如实施例5所述，可在生长因子IL-3缺失适当时间(例如约20小时)时生长，诱导凋亡。细胞凋亡状态可用，例如，BoeringherMannheim(布鲁塞尔，比利时)的膜联蛋白/碘化丙啶标记的试剂盒测定。如果约20％膜联蛋白阳性，而不少于5％碘化丙啶阴性，则认为细胞为早期凋亡的。
PC12细胞系可在神经生长因子缺失的标准培养基中生长诱导凋亡。
除上述细胞外，凋亡颗粒可为非活物质，如染料标记的乳胶颗粒。带有一个氨基或羧基的0.1μM,1μM,4μM和10μM颗粒可购自Sigma-Aldrich,Bornem，比利时，或Molecular Probes,Eugene，美国。
为使所述的分析适于高通量的化合物筛选，优选凋亡颗粒携带某种可探测的标记，则当该颗粒被转染的哺乳动物细胞吸收时，非常明显，可量化。发明者发现可通过用包括报告基因的表达载体稳定转染包含凋亡颗粒的细胞，从而实现上述目的。一个特别合适的报告基因编码β-半乳糖苷酶，它能裂解荧光底物荧光素双-b-D-吡喃型半乳糖苷为可用标准荧光探测设备检测的荧光化合物。其它荧光底物也可用于β-半乳糖苷酶。质粒pcDNA3.1/HIS/lacZ，表达β-半乳糖苷酶且适于转染用作凋亡颗粒的细胞，例如Ba/F3，如图11所示。其它合适的报告基因是编码荧光蛋白如绿色荧光蛋白或能产生发光信号如荧光素酶的蛋白的基因。质粒pEGFP-N3或pEGFP-C2(Clontech)，适于转染GFP到用作凋亡颗粒的细胞，如图7,8,26和27所示。Promega的质粒“PGL对照”适于转染编码荧光素酶的基因到用作凋亡颗粒的细胞如Ba/F3细胞。“PGL对照”的DNA序列如图19所示。
优选对凋亡颗粒的报告基因的选择由转染的哺乳动物细胞报告基因的存在控制。例如，在转染h1或h2ced-6的哺乳动物细胞核凋亡细胞中相同报告基因的存在，因信号重叠而不被优选，尽管这种情况不多。
更优选可检测多种化合物，测其为促进凋亡细胞吞噬的信号传导通路的增强剂或抑制剂。化合物可为任意化学式，聚合体或单体。例如检测的化合物可为基因组DNA,cDNA,RNA,PNA,蛋白或多肽，氨基酸，核苷或核苷酸。化合物可为已知生物或药理活性的，未知活性的已知化合物或在化合物组合库中存在的新分子。
当任何化合物的存在导致凋亡颗粒被转染的哺乳动物细胞吞噬的量减少或不发生吞噬时，应检测细胞的生存力。活细胞的存在确认吞噬的缺乏缘于所测化合物对吞噬活性的影响而非其非特异性毒性。
进一步的，任何经上述分析鉴定为凋亡细胞吞噬的抑制剂或增强剂的化合物，都将进一步检测该影响是否通过CED-6介导。鉴定一种化合物为凋亡细胞吞噬的抑制剂或增强剂后，可通过进行上述的吞噬分析，但哺乳动物细胞未转染h1ced-6或h2ced-6。如果该化合物在为转染的细胞中能诱导与转染h1ced-6的细胞相同的表型，说明该化合物不一定通过CED-6或CED-6信号传导通路发挥作用。
相似的，如果一种上述分析鉴定为凋亡细胞吞噬的抑制剂的化合物，通过鉴定暴露给该化合物的未转染的哺乳动物细胞的表型确认其作用是否通过CED-6或CED-6信号传导通路。向野生型表型的恢复意味着反应通过CED-6或CED-6信号传导通路。
本发明第四方面提供确定用于检测一种化合物是否为促进吞噬凋亡细胞的信号传导通路的的促进物或抑制剂的方法，该方法包括下列步骤(1)向哺乳动物细胞显微注射包括图4或图5所示的氨基酸序列或与图4或图5所示的氨基酸序列仅有功能的保守性的氨基酸改变的序列的人CED-6蛋白，和(2)将步骤1制备的哺乳动物细胞暴露给凋亡颗粒，在化合物存在和缺失时测量颗粒被细胞的吞噬速率。
优选的，向哺乳动物细胞显微注射包括h1Ced-6或h2CED-6和报告基因的融合蛋白，报告基因可为上述的任意报告基因。优选的融合蛋白通过表达图9或28所示的质粒的GFP和h1ced-6编码序列获得。
上述所有的周转染的哺乳动物细胞系分析的特征和实施方案可用于上述的以h1Ced-6或h2CED-6或其融合蛋白显微注射的细胞。
本发明第五方面提供用于检测一种化合物是否为促进吞噬凋亡细胞的信号传导通路的的促进物或抑制剂的方法，该方法包括下列步骤(1)向哺乳动物细胞显微注射或转染表达图2或图3所示的核苷酸序列的所有或部分反义的RNA的载体；(2)将步骤1制备的哺乳动物细胞暴露给凋亡颗粒，在化合物存在和缺失时测量颗粒被细胞的吞噬速率。
优选的，该反义RNA包括能与图2或图3所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，杂交的严格性条件高于2×SSC；0.1％SDS；25℃到50℃。
上述所有用转染的哺乳动物细胞系的分析的所有优选的特点和实施方案可应用到反义RNA注射的细胞系。
优选用于上述分析的转染的哺乳动物细胞转染h1ced-6或h2ced-6。因h2ced-6被视为h1ced-6的显性的隐性形式，具有相反的生物学作用，细胞对转染的选择取决于希望鉴别作为凋亡细胞吞噬的抑制剂或增强剂的化合物。例如转染h1ced-6的细胞特别适合鉴别凋亡细胞吞噬的抑制剂，而转染h2ced-6的细胞特别适合鉴别增强剂。
因此阐明本发明也涉及根据本文描述的任意分析方法，鉴定为促进凋亡细胞吞噬信号传导通路的抑制剂或增强剂的任何化合物。
h1ced-6和h2ced-6的核苷酸序列分别如图2和3所示。此外，编码可变剪接h2CED-6的cDNAs和从h2ced-6重组h1ced-6的插入片段根据布达佩斯条约于1998年6月8日保藏于比利时微生物协调保藏中心(BCCM)分子生物学实验室-质粒保藏(LMBP)B9000,Gent，比利时，保藏号分别为3868和3869。
从使用T2或T7引物可从存放物种获得序列(可用一个或同时用2个引物，在不同的实际插入位点)。引物可购自Clontech(～1227和～1228)，序列如下T7引物5’(TAATACGACTCACTATAGGGAGA)3’T3引物5’(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)3’在发展基于过表达或低表达人CED-6蛋白的哺乳动物细胞的分析之外，本发明者鉴定h1CED-6的表位并制备了它有用的抗体。
本发明第六方面包括具有图4所示的氨基酸序列的人Ced-6蛋白片段，其中片段包括氨基酸序列HRAFSRKKDKTC,FLGSTEVEQPKGTE或TRNGTQPPPVPSRST。制备包括上述一或更多表位的抗体。按实施例6描述的方法获得抗体制备物，它们的特异性如实施例7使用WesternBlots证实(图20到25)。
上述的抗体可用于在与吞噬细胞过表达或低表达人Ced-6相关的患者中诊断疾病的方法。特别地，本文提供一种方法用于诊断在个体中与吞噬细胞过表达或低表达人Ced-6的相关的疾病，包括(a)从个体获得吞噬细胞的样品；(b)暴露吞噬细胞给如上所述的抗体制备物；(c)定量测量任何在抗体和Ced-6蛋白间形成的免疫复合物的存在；并(d)与使用来自对照个体的吞噬细胞形成的免疫复合物比较形成的免疫复合物的量。
上述的抗体可进一步用于测定一种化合物是促进凋亡细胞吞噬信号传导通路的抑制剂或增强剂的分析。特别地，本文提供一种方法，用于测定一种化合物是否为促进凋亡细胞吞噬信号转到通路的抑制剂或增强剂，该方法包括(a)暴露转染如上所述的表达载体哺乳动物细胞给待测化合物；(b)暴露哺乳动物细胞给上述的一种抗体制备物；(c)定量测量在抗体和细胞表达的蛋白见形成的任何免疫复合物的存在；并(d)与未暴露给化合物的、如步骤(a)描述的转染的哺乳动物细胞中探测的免疫复合物的量比较探测的免疫复合物的水平。
在上述方法中，哺乳动物细胞可选自COS1,BHK21,L929,CU1,SWISS 3T3,HT144,IMR32,HEPG2,MDCK,MCF7,293,Hela,A549,SW48或G361,COS1细胞尤其优选。哺乳动物细胞也可为人皮肤FIB，人角质形成细胞，白细胞，单核细胞，淋巴细胞，树突细胞或巨噬细胞。优选专业性吞噬细胞如鼠巨噬细胞细胞系J774或人单核细胞细胞系THP-1。
本发明抗体的其它应用包括h1CED-6的纯化和与CED-6相互作用的蛋白的鉴别，则信号传导通路可特征化，还包括探测hCED-6的过表达或低表达、细胞内定位或翻译后修饰，表位作图和活化位点和在适当载体或稀释剂中包括所述抗体的药理学组合物的鉴定。
本发明第七方面包括一种用于诊断与在个体的吞噬细胞中人CED-6过表达或低表达相关的疾病的方法，该方法包括(a)从个体获得吞噬细胞样品，(b)从吞噬细胞分离RNA，(c)从RNA制备cDNA，(d)在cDNA中进行一级PCR反应，(e)在一级PCR反应的反应产物上进行二级(嵌套式)PCR，(f)通过分析一级和二级PCR的产物定性和定量测量人ced-6 RNA的存在，并(g)将在一级和二级PCR中形成的反应产物与使用对照个体的吞噬细胞形成的反应产物比较产物的量和类型。
优选的，使用本文定义的h1ced-6或h2ced-6的序列衍生的引物或从cDNA产生使用的载体的衍生的引物进行PCR。特别地，所述一级PCR可用具有以下核苷酸序列的引物1)cgcaaggatccccatgaaccgtgcttttagcaggaag2)gatctactaggtactggag二级PCR可用具有以下核苷酸序列的引物1)cgcaaggatccccatgaaccgtgcttttagcaggaag2)gcggatggtaccgtcgactgctgatacttgagttattctcag本文描述的分析方法，由本发明者改进用于测定是否化合物为人CED-6的增强剂或抑制剂，可通用于鉴定在任何机制下影响凋亡细胞吞噬的化合物，而不仅涉及人CED-6或由其充当组分的信号传导通路。
Liu等。(Liu,Y.等，美国免疫学家协会，1:1999)描述了一种鉴定影响凋亡细胞吞噬的化合物，其中不同浓度的化合物加入到吞噬细胞，随后向吞噬细胞中接入凋亡细胞。为量化凋亡细胞的吞噬，作者对吞噬的显微量化，其中对凋亡细胞的吸收由电子显微镜显示，并用光学显微镜计数计算的每块玻片的最少细胞(Sayill,J.S.Wyllie,A.H.Henson,J.E.Walport,M.J.Henson,P.M.Haslett,C.,J Clin Inyest,83:865-875,1989)。
已知用于量化凋亡细胞吞噬的技术不容易对化合物进行高物料通过量筛选潜在的药物学活性。主要因为已知的分析技术依赖于在暴露给检测化合物时，对摄取凋亡细胞的吞噬细胞的比例显微计数。但是，本发明克服该缺点，因它们可在多孔分析板中进行，并提供不需显微镜的探测系统。
因此，本发明进一步提供一种方法，鉴定一种化合物是否为凋亡细胞吞噬的增强剂或抑制剂，它包括a)在待测化合物存在或缺失时，向稳定转染能产生非显微镜探测的信号的报告基因凋亡的哺乳动物细胞暴露哺乳动物专业性或半专业性吞噬细胞，
b)去除未被吞噬细胞吞噬的任何凋亡细胞并c)探测任何来自吞噬细胞的报告基因的信号；其中在化合物存在时与化合物缺失时的任何信号差异说明化合物是凋亡细胞吞噬的增强剂或抑制剂。
通常，在上述方法中优选先将吞噬细胞与所测化合物温育，然后加入凋亡细胞。适当的温育时间为15-30分钟。
使用本发明的方法的适当的吞噬细胞为鼠J774细胞或人THP-1细胞，如本文所述。这些细胞为单核细胞系，但在加入凋亡细胞前经培养使之分化为巨噬细胞。
用于上述方法的凋亡细胞可为凋亡的嗜中性细胞，凋亡的淋巴细胞或凋亡的红细胞。凋亡细胞可任选通过暴露给血清进行调理。优选的凋亡细胞为贴壁细胞系L929或PC12和，本文描述的生长因子依赖的鼠细胞系Ba/F3。
运用上述方法稳定转染报告基因到凋亡细胞。运用报告基因会遇到的一个特别问题是在有效死亡的凋亡细胞中基因的表达，比完全活细胞中弱很多。如果或细胞处于加入到吞噬细胞的凋亡颗粒中，不充分洗未吞噬的颗粒，来自活细胞的信号会掩盖来自凋亡吞噬的细胞的任何信号。虽然可以随后洗涤，本发明者改进了一种特别的实施方案避免此问题。
特别地，它包括使用表达在细胞中转换低的蛋白，优选酶的报告基因，则活细胞和凋亡颗粒具有约相同的蛋白浓度或酶活性。从而克服了上述的缺点。几种可能的报告蛋白和底物在荧光探针和研究化学药品手册，P.Haugland编(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)中都有描述。本发明者还发现β-半乳糖苷酶(lacZ)是特别合适的报告基因。此酶相对低更新，细胞和凋亡颗粒具有相对相同量的活性。此外存在几种适于β-半乳糖苷酶的底物(见Molecular Probes,Eugene，或USA)，本发明者使用上述的FDG。它使发展一种高物料通过量筛选改变凋亡颗粒吞噬的化合物成为可能。
本发明的方法使用的吞噬细胞可为野生型细胞或转基因或突变细胞。突变的细胞与野生型相比，可减少或增加吞噬活性。转基因细胞可稳定转染表达时影响凋亡细胞吞噬活性的速率的基因。例如，哺乳动物细胞转染上述的h1ced-6或h2ced-6，优选使用任何在描述或附图中提到的载体。
在本发明的另一实施方案中，吞噬细胞可转染编码细胞表面抗原CD36的DNA。运用磷脂酰丝氨酸受体或玻联蛋白受体的人巨噬细胞吞噬凋亡细胞需要CD36的表达。(Fadok V.A.等，免疫学杂志1998 Dec1.161(11):6250-7)。转染可采用本文描述的任何方法进行，优选使用包括编码如图31所示的CD36的DNA序列的载体或图31的完整载体。
本发明的方法都在多孔板中进行，因此特别适合中-高通量筛选。在一个优选的实施方案中，使用96孔板，但本发明也可使用其它数的孔板，包括但不限于6,12,24,384,864,1536孔板。
本发明的所有方法需要对量化凋亡细胞吞噬的信号在待测化合物存在时进行探测。本发明的方法的关键特点在于该信号(也称示值)使用非视觉探测方法检测。本文使用的术语‘非视觉探测方法’指任何检测一种不需人眼包括显微镜视觉检查的信号的方法。非视觉探测系统的运用是主要的优点，超越已知的需要对细胞通过眼睛进行视觉检查检测凋亡细胞被吞噬细胞的吸收的筛选方法。
为能在吞噬分析的高-中物料通过量筛选中对凋亡细胞进行非视觉探测，报告基因必须能产生可被自动平板计数器，如victor2(Wallac,Turku，芬兰)检测的信号。最优选检测荧光信号的自动平板计数器。
通过产生自动多孔板计数器读数的信号，可进行量化测量，从而能够一次估价多种化合物的作用，并比较化合物的作用。
需进一步指出，待测化合物可为上述的任何类型的化合物，当特定的化合物导致吞噬细胞降低或消失的信号，将检测吞噬细胞的活力，从而排除化合物的非特异性毒性原因。
在以下非限制性的实施例中，参考下1从EST,RACE和集落杂交获得的2416bp的共有序列的结构(见实施例1)。序列如下装配，以aa159394为模板，引物如多重序列所示。rcc代表逆转的补足物。在多种序列中可见ced-6和hced-6；pGA101由集落杂交挑选。
图2示h1ced-6的共有DNA序列(2416bp)。启示和终止密码子为黑体并下划线。可变剪接区也下划线。
图3示h2ced-6的可变剪接的DNA序列。启示和终止密码子为黑体并下划线。
图4示h1CED-6的氨基酸序列。残基数304，分子量34.4kDa。可变剪接区也下划线。
图5示h2CED-6的氨基酸序列，可变剪接区。
图6示对实施例3中描述的嵌套式PCR产物的凝胶分析；泳道分别为(1)100bp标记物，(2)初级活嗜中性细胞，(3)初级凋亡嗜中性细胞，(4)初级巨噬细胞，(5)与凋往嗜中性细胞作用的初级巨噬细胞，(6)J774,(7)COS-1,(8)THP-1图7示实施例4和8中使用的包括报告基因GFP的Clonetech载体pEGFP-N3的DNA序列；图8示pEGFP-N3的质粒图谱；图9示图4和8中使用的质粒pGA3104的DNA序列，在pEGFP-N3的多克隆位点包括h1ced-6；图10示质粒pGA3104的质粒图谱；图11示用于稳定转染Ba/F3细胞的可从商业渠道获得的质粒pcDNA3.1/His/LacZ的DNA序列(见实施例4)；图12示荧光强度，当β-半乳糖苷酶与荧光底物荧光素-b-D-吡喃型半乳糖苷(FDG)反应时，荧光强度作为转染的细胞百分比；
图13示FDG浓度对实施例5的分析的读数的影响；图14示温育时间对实施例5的分析的读数的影响；图15示Ba/F3细胞培养中血清浓度对实施例5的分析的影响；图16示用于产生多克隆抗体的在h1CED-6中的表位的定位；图17示实施例7所用的质粒pGA1028的DNA序列(pBAD/HisA/-hced-6)；图18示pGA1028的质粒图谱；图19示适于转入Ba/F3细胞的报告基因荧光素酶的商业质粒pGL2的DNA序列；图20到25示实施例7中免疫引迹的结果。在所有图中，泳道如下泳道1预染色的SDS-PAGE低分子量标准(Bio Rad-Hercules,CA,USA)，泳道2pBAD/His A(Invitrogen,Leek,The Netherlands)泳道3pGA1028(pBAD/HisA/-h1CED-6)图20示用针对实施例7中鉴定的表位EP 990044的抗体和对照抗体Anti-Xpress抗体(Invitrogen,Leek,The Netherlands)和鼠Ig，辣根过氧化物酶联的完整抗体(绵羊)染色的凝胶(ECL Western印迹检测试剂和分析系统，Amersham Pharmacia Biotech,UK,England)图21示用如实施例7描述的对表位990044的抗体和免疫血清染色的凝胶；
图22示用如实施例7中鉴定的表位990045的抗体和如图20描述的对照抗体染色的凝胶；图23示如实施例7中描述的表位990045和免疫血清染色染色的凝胶；图24示如实施例7中描述的表位990046和对照抗体染色的凝胶；图25示如实施例7中描述的表位990046和免疫血清染色的凝胶图26示如实施例8所用的包括报告基因GFP的商业Clonetech载体pEGFP-C2的DNA序列；图27示pEGFP-C2的质粒图谱；图28示如实施例8所用的质粒pGA3103的DNA序列，其中在pEGFP-C2的多克隆位点包括h1ced-6；图29示pGA3103的质粒图谱；图30示来自转染MOCK(转染的阴性对照)，pEGFP-N3,pGA3103和pGA3104的COS-1细胞的细胞裂解物；与一抗或未与一抗温育的Ba/F3细胞的有效免疫共沉淀的对照裂解物；来自EGF刺激的A431细胞的阳性对照裂解物的Western印迹；，使用抗-磷脂酰酪氨酸抗体。印迹A用鼠单抗IgG2检测细胞裂解物中酪氨酸-磷脂酰化的蛋白；印迹B用抗绿色荧光蛋白的多克隆抗体探查；印迹C用h1Ced-6的兔抗血清探查。H1CED-6的分子量为34435.39；GFP的分子量为26886.32；融合蛋白GFP-CED-6或CED-6-GFP的分子量为62385.95；图31示质粒pGA1058的DNA序列，其中包括编码细胞表面受体CD36的DNA序列插入导pEGFP-N3的多克隆位点；图32示pGA1059的质粒图谱；图33示在IL3撤退后膜联蛋白和碘化丙啶阳性细胞在Ba/F3细胞中的细胞群体中百分比；图34示温度对FDF温育的影响，活的和凋亡的Ba/F3细胞加入巨噬细胞细胞系J774中。吞噬分析后，FDG(10μM)在4℃，20℃温育1小时，在37℃温于10和20分钟。
实施例1用ced-6序列(图2hced-6的共有区DNA序列)对公共区域数据库(EST,Genbank,EMBL,Swissport和PIR)的广泛研究显示了在蛋白的羧基末端区的某些ESTS的统计学显著的同源物(AA443368,AA431995,R33389,R53881)。一种Est(T48513)显示与PTB区的羧基端和带电区的起始区同源。Marathonready 5’RACE分析，cDNA结肠腺癌库来自Clontech。RACE和测序中运用的引物的位置如图1所示。通过随后的克隆和序列分析，获得额外的序列信息。运用此额外的序列信息，在数据库中搜索，揭示额外的EST，使我们得以构建约2400bp的共有序列。该序列可通过集落杂交和额外的RACE产物测序进一步扩大和变化。
实施例2RNA印迹人多种组织Northern(MTN-1,Clontech)，每泳道分别包括来自8种不同人组织(心，脑，胎盘，肺，肝，骨骼肌，肾和胰腺)的2mg聚腺苷酸化RNA和MTN-Ⅱ人多种组织Northern，每泳道分别包括来自脾，胸腺，前列腺，睾丸，卵巢，小肠，结肠和外周白细胞的的2mg聚腺苷酸化RNA，根据生产商说明进行杂交，在0.1×SSC，0.2％SDS在55℃洗。同样来自Clontech，检测人癌症细胞系(黑色素瘤G361，肺癌A549，结肠癌SW480，伯基特氏淋巴瘤Raji，淋巴母细胞白血病Molt-4，慢性髓细胞性白血病62,Hela S3和原髓细胞性白血病HL60)的聚腺苷酸化RNA。
HCED-6在正常人组织和癌细胞中的表达模式经Northern印迹如表1所示A)人多种组织Northern(MTN)印迹B)人多种组织Northern(MTN)印迹ⅡC)人癌细胞系多组织Northern(MTNTM)印迹。
表ⅠA) B) C) 实施例3在吞噬细胞系中CED-6(h1CED-6)及其剪接变体(h2CED-6)的检测细胞系THP-1(美国典型培养物保藏中心ATCC号TIB-202)，一种人单核细胞细胞系，可使用PMA(Sigma-Aldrich,St-Louis,MO,USA)使之分化为巨噬细胞，细胞在标准条件下、含2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氢钠，4.5g/L葡萄糖，10mM HEPES,1mM丙酮酸钠，0.05mM β-巯基乙醇的RPMI1640培养基中培养。(药物均购自gibcoBRL，Life Technologies,Merelbeke,Belgium)。
依据生产商说明，或略作改动，使用Rneasy mini试剂盒(Westburg,Leusden,the Netherlands)从此细胞系分离RNA。
依据生产商说明，或略作改动，使用Ready-To-Go T-primed第一链试剂盒(Pharmacia Biotech Piscataway,NJ,USA)产生第一链cDNA。
产生的cDNA在PCR步骤中用于产生DNA片段，使用引物oGA131:5’-CGCAAGGATCCCCATGAACCGTGCTTTTAGCAGGAAG-3’445-10934-13R:5’-GATCTACTAGGTACTGGAG-3’,PCR使用TaKaRa ex Taq试剂盒(Takara Shuzo Co.,LTD,Shiga，日本)进行，依据生产商说明，或略作改动，质粒pGA1025，包括h1ced-6基因，用作阳性对照。
小结PCR产生第一链cDNA，使用Ready-To-Go T-primed第一链试剂盒，得到的第一链cDNA包括完整的cDNA，其它材料为0.4μloGA131(100pmol/μl),0.4μl 445-10934-13R(100pmol/μl),0.5μl exTaq 5U/μl,65.7μl水。
对阳性对照进行PCR，包括10μl缓冲液exTaq 10×,10μl dNTP混合exTaq 10×,0.4μl oGA131(100pmol/μl),0.4μl 445-10934-13R(100pmol/μl),2μl pGA1025,76.2μl水。
PCR程序 2μl每个PCR反应产物和1μl阳性对照PCR反应的产物用于进行嵌套式PCR，采用下列引物
oGA131同上oGA1415’-GCGGATGGTACCGTCGACTGCTGATACTTGAGTTATTCTCAG-3’PCR使用TaKaRa ex Taq试剂盒(Takara Shuzo Co.,LTD,Shiga，日本)进行，依据生产商说明，或略作改动。
主要混合物5μl缓冲液exTaq 10×,5μl dNTP混合exTaq 10×,0.2μl oGA131(100pmol/μl),0.2μl oGA141(100pmol/μl),0.5μl exTaq 5U/μl,37.1μl水。
程序 根据标准方法对10μl嵌套式PCR产物进行凝胶分析(分子克隆实验指南，Sambrook等，1989,CSHL出版社)。
在初级活嗜中性细胞，初级凋亡嗜中性细胞，初级巨噬细胞，与凋亡嗜中性细胞相互作用的初级巨噬细胞，鼠单核细胞细胞系J774和COS-1细胞中重复上述步骤。结果如图6所示。显著的，仅在细胞系THP-1中能测得h1ced-6和其剪接变体h2ced-6(见图6的泳道8)。
实施例4人CED-6的稳定细胞系J774鼠单核细胞肿瘤细胞系(Morland和Kaplan,1978，实验细胞学研究.115:53-61；Morland和Kaplan,1978,实验细胞学研究.115:63-72 ATCC登记号TIB67，又称为J774.1)在DMEM中培养，加glutamaxI,10％myclone血清(均购自GIBCoBRL,LifeTechnologies,Merelbeke，比利时)，电穿孔法转染质粒pEGFP-N3(Clonetech,Palo Alto,CA,USA)，(图7和8)，模拟转染，pGA3104,h1CED-6/GFP融合物(图9和10)，鲑鱼精子DNA；阴性对照。
电穿孔用Easyject Plus电穿孔系统(Equibio Ltd,Immunosource,Halle-Zoersel，比利时)，按以下步骤3×106细胞置于800μl细胞培养基中，加入30μg DNA.EasyjectPlus电穿孔仪设为双脉冲电压I=750V，电容I=25μF，电阻I=99R，脉冲间延迟=0电压I=150V，电容I=1500μF，电阻I=99R,Optipulse任选每3500μl电穿孔的细胞接种到175cm2培养瓶中，G418抗性选择(400μg/ml)(Duchefa,Haarlem,The Netherlands)72小时。获得并检测GFP表达的克隆的亚克隆。
实施例5吞噬作用分析制备吞噬细胞稳定转染pEGFPn3或pGA3104或pGA1058的单核细胞细胞系J774以1×105密度接种在黑色96孔板中37℃,5％CO2，进行吞噬分析前培养36小时。
凋亡细胞的制备稳定转染β-半乳糖苷酶作为报告基因的生长因子依赖的细胞系Ba/F3,用作凋亡细胞的源。转染Ba/F3的适当质粒为pcDNA3.1/His/LacZ，如图11所示。Ba/F3细胞为IL-3依赖的鼠克隆(Palacios和Steinmetz,1985，细胞41:727-734；Palacios等，1984，自然309:126-131)，在加glutamazI,10％FCS,1％抗生素(均购自GIBCOBRL,ibid.)，10％WEHI-3培养物的上清中培养。
WEHI-3(ATCC号:TIB-68)在培养基RPMI 1640,glutamaxI,1O％FCS,3.6μlβ-巯基乙醇/升中生长，产生IL-3。
Ba/F3细胞在相互作用分析两天前传代(指数生长期)，Ba/F3细胞(5×106细胞/ml)在无生长因子IL-3条件下培养20小时，而后进行分析。凋亡的Ba/F3细胞使用膜联蛋白/碘化丙啶标记试剂盒(Boeringher Mannheim,Brussels，比利时)检测。如20％膜联蛋白阳性而少于5％的碘化丙啶阴性，Ba/F3细胞为早期凋亡。加有生长因子IL-3的Ba/F3细胞用作阴性对照。膜联蛋白/碘化丙啶检测的结果如图33所示。
向吞噬细胞加入凋亡细胞200μl Ba/F3细胞(1×107细胞/ml)加入到含稳定转染的J774和阴性对照的孔中，37℃温育，时间从20分钟到5小时，之后从所有孔中去除凋亡细胞。吞噬细胞在PBS缓冲液(GIBCOBRL,ibid)中洗3次，注意不要移去细胞。
读数J774细胞吞噬的凋亡小体检测通过检测Ba/F3细胞中表达的β-半乳糖苷酶而实现。检测采用荧光底物，荧光素双-b-D-吡喃型半乳糖苷(FDG)(Molecular Probes,Eugene,OR，美国)。向孔中加入10μM FDG，黑暗中室温温育1小时。FDG因β-半乳糖苷酶活性水解为FMG和荧光素，在标准平板计数器计数，480mm激发光，520mm发射光，适当敏感度，检测绿色荧光。
为校准之目的，荧光读数依赖于不同Ba/F3浓度。作为细胞浓度的荧光读数如图12所示。
进一步的实验运用不同FDG浓度，不同分析的温育时间，不同分析的温度和Ba/F3培养基中血清的浓度。结果分别如图13,14,15和34。
化合物筛选上述的吞噬分析用于筛选化合物，判断其影响凋亡细胞被专业性吞噬细胞吞噬的水平。所测化合物可加到检测孔中，约30分钟，后加入Ba/F3细胞。因为分析的多孔板形式，及自动荧光读数使用标准设备，该分析典型适合高物料通过量的化合物筛选。
当任何化合物的存在导致无荧光或与未暴露给化合物的吞噬细胞相比，荧光减弱，则应对该孔中的细胞进行活力检测，实用商业试剂如Live/Dead Viability/Cytotoxicity试剂盒(MolecularProbes,Eugene,USA)。该试剂盒提供两种颜色荧光细胞活性分析，对活和死细胞同时用两种探针确定，钙黄绿素AM和溴化乙啶同型二聚体。从而测定细胞活力的双参数，细胞内酯酶活性和质膜完整性。该试剂盒适于荧光多孔板扫描仪。活细胞的存在将确认荧光的缺失缘于化合物对吞噬活性的影响，而非仅非特异性的毒性。
进一步的，任何经本分析鉴定为凋亡细胞吞噬的抑制剂或增强剂的化合物，将进一步检测此作用通过CED-6的调节。当化合物鉴定为凋亡细胞吞噬的增强剂时，通过进行如上述的用为转染h1ced-6或h2ced-6的J774细胞进行吞噬细胞分析。如果化合物能在J774细胞中诱导与转染hced-6的细胞中相同的表型，说明化合物不一定通过CED-6或CED-6信号传导通路作用。
相似的，如果化合物鉴定为凋亡细胞吞噬的抑制剂时，通过检测暴露给化合物的转染的J774的表型，确认该作用通过CED-6或CED-6信号传导通路作用。对野生型表型的逆转说明反应通过CED-6信号传导通路。
实施例6抗人CED-6得多克隆抗体多克隆抗体在兔中培养，抗下列ced-6表位EP990044 H2N-NRA FSR KKD KTC CONH2EP990045 H2N-CFL GST EVE QPK GTE CONH2EP990046 H2N-CTR NGT QPP PVP SRS T CONH2这些表位在ced-6蛋白中的定位如图16所示。
多克隆抗体通过Eurogentec Bel(Herstal，比利时)制备，按照下列步骤第0天去免疫前血清，第一次免疫接种第14天第二次免疫接种第28天第三次免疫接种第38天采血样(取血2ml)第56天第4次免疫第66天采血样(取血2+20ml)第80天完成取血实施例7Western印迹检测抗体在TOP10感受态细胞中转化质粒pGA1028(pBAD/His A-hCED-6)(见图17和18)。用pBAD/His转化相同的大肠杆菌细胞作为阴性对照。pBAD/His A和大肠杆菌TOP10购自Invitrogen(Leek,TheNetherlands)。
使用pBAD-载体表达系统，它为一种已知的高效表达系统。当阿拉伯糖存在时，pbAD的表达开始，而缺乏阿拉伯糖时，pBAD转录水平极低。根据生产商说明进行先导表达，其中阿拉伯糖的量不同，确定蛋白的最高表达所需的阿拉伯糖的量。方法依据生产商(Invitrogen,Lekk,The Netherlands)。用同样方法进行大量表达。
蛋白的纯化在转化pGA1028的大肠杆菌细胞中进行5ml裂解缓冲液(10ml TE 1×pH9,0.5mg./ml溶菌酶，0.1mg/ml DNAse,100μl 1M CaCl2400μl蛋白酶抑制剂25×)加入到50ml诱导表达的培养物沉淀物，沉淀在裂解缓冲液中重悬。重悬物在冰上放置30分钟，超声3次，每次5秒(高密度)，随后重悬物经过3个冻融循环(液氮-42℃)，在37℃放置30分钟。重悬物以最大转速离心5分钟。沉淀包括不可溶部分和hCED-6融合蛋白，在1ml 2M尿素中重悬，1200rpm振摇5分钟。重悬物以最大转速离心5分钟，上清用于凝胶电泳和Western印迹。25μl上清和25μl预混SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳样品缓冲液(Bio Rad-Hercules,CA，美国)混合。
来自阴性对照的蛋白不纯化。pBAD/His转化的大肠杆菌如下制备，沉淀1ml诱导的大肠杆菌培养物，沉淀在1ml预混SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳样品缓冲液(Bio Rad-Hercules,CA，美国)中重悬。重悬物用于PAGE凝胶电泳。
制备的样品加入到凝胶样品煮沸5分钟，加样前置于冰上。向制备的凝胶TrisHCl,4-15％(Bio Rad-Hercules,CA，美国)50μl加样孔加25μl样品，电泳依照生产商说明进行。使用MiniTransBlot electrophoresis cell(Bio Rad-Hercules,CA，美国)将胶上的蛋白转到硝酸纤维素膜(Trans-blot Transfermedim,Bio Rad-Hercules,CA，美国)，依照生产商说明进行(BioRad-Hercules,CA，美国)。
根据抗体的供应商和检测试剂盒进行Western印迹。一抗，兔的免疫血清或免疫前血清在PBST(1.44g/L KH2P04,90g/LNaCl,7.75g/L Na2HPO4.7H20,0.1％Tween)中按1/2000稀释。二抗抗兔，辣根过氧化物酶偶联的完整抗体(donkey)在PBST(0.1％)中按1/4000稀释(ECL Western印迹检测试剂和分析系统，AmershamPharmacia Biotech，UK,England)。
温育按生厂商说明进行，稍做改动。第一抗体在PBST而不是在TBST中温育过夜。抗体的检测根据生产商的教导进行(ECL Western印迹检测试剂和分析系统，Amersham PharmaciaBiotech,UK,England)。在ECL试剂盒检测，根据生产商的教导刮去和再标记膜。
根据生产商的教导进行抗HisA抗体(Invitrogen,Leek，荷兰)的Western印迹，同时有对照抗体。以1/5000稀释在PBST(0.1％)(Invitrogen,Leek，荷兰)中抗-Xpress抗体用作第一抗体。二抗小鼠Ig，辣根过氧化物酶偶联的全长抗体(来源于绵羊)，以1/4000稀释于PBST中(0.1％)(ECL Western印迹检测试剂和分析系统，Amersham Pharmacia Biotech,UK,England)。
实验中抗体染色依据依照生产商说明进行(ECL Western印迹检测试剂和分析系统，Amersham Pharmacia Biotech,UK,England)。
结果如图20到25所示。
实施例8H-CED-6与酪氨酸磷酸化蛋白免疫共沉淀抗h1CED-6的3个表位的抗体用于Western印迹，检测CED-6与酪氨酸磷酸化蛋白的相互作用，鉴定CED-6相互作用蛋白。
转染质粒pGA3103(见图26-29)和pGA3104(见图7-10)转染175cm2方瓶中的COS-1细胞(1×107细胞)。阴性对照MOCK和pEGFP-N3。调查全长人ced-6(处于GFP阅读框中，N端和C端融合，内部控制)。COS-1细胞用脂质转染胺Plus试剂(GIBCO-BRL)转染。下附LifeTechnologies的方法，体积如表2所示。
MOCK转染的蛋白为转染的阴影对照。向细胞中仅加入DNA的溶剂而不加DNA。DNA的溶剂为TE缓冲液，pH=8:1M Tris(ICN)ph=8和0.5 M EDTA(Merck-Belgolabo)pH=8溶于水中。
表2 175cm2方瓶中脂质转染胺转染(Life Technologies)COS-1细胞
磷酸化的Ba/F3细胞的IL-3受体的β-链作为磷酸化的阳性对照。
使用毛地黄毒苷制备COS-1细胞裂解物(尽量轻柔，不要破坏相互作用)，向裂解缓冲液中加入磷酸酶抑制剂(蛋白酶抑制剂，优选混合物或pefablock)。
以低严紧型毛地黄毒苷为基础的缓冲液10ml bidi中毛地黄毒苷的缓冲液1％毛地黄毒苷(Serva 19551，分子量1229.3)SERVA2％母液=250mg溶于12.5ml10mM三羟乙基胺pH7.8(Sigma-Aldrich；Bornem,Belgium 10×母液100mM=185.7mg溶于10ml pH7.8(5ml稀释为50ml)O.15M NaCl(MW 58.44) 87.66 mg/ml2mM EDTA(Titriplex Ⅲ) 分子量372.24)(Darmstadt，德国)7.444mg每10ml200U/ml抑酶肽-Trazilol(Sigma-Aldrich,Bornem,Belgium)1mg=11TIU=9900KU200x母液10mg溶于2ml PBS中=49500KU(10ml中含50μl)1mM Pefabloc(Merck,Darmstadt，德国)2.4mg每10ml细胞的裂解转染细胞在falcon中Dulbeccco氏PBS(GIBCOBRL)洗2次刮细胞，沉淀在300μl裂解缓冲液中重悬所有操作在4℃进行制备物4000rpm离心，上清转移到新管中预清除蛋白G琼脂糖CL-4B珠(Amersham Pharmacia,Roosendaal,theNetherlands)以冻干的添加剂形式提供。这些添加物可在中性pH洗去，由乙醇替代裂解缓冲液。
50％v/v蛋白G琼脂糖悬液吸取1ml 50/50/v/v蛋白G琼脂糖并以最高转速离心5秒钟，随后在等体积裂解缓冲液中重悬。洗3次。
向300μl裂解液中加入50μl蛋白G琼脂糖CL-4B珠(AmershamPharmacia,ibid.)，作用1小时。
4℃14000rpm离心10秒，上清转入新管。
免疫共沉淀COS-1裂解物加入5μl抗-绿色荧光蛋白(GFP)多克隆兔抗(Immunosource,Halle-Zoersel，比利时)冻干形式溶于100μl蒸馏水中，-20℃冻存。
Ba/F3裂解物5号加入5μl抗IL-3受体的β-链的兔抗(Vander heyden J.,Devos R.,Plaetinck G.,Fache I.,Fiers W.,Tavernier J.1991.运用系列单克隆抗体对鼠IL-5受体复合物的鉴定，该复合物与鼠IL-3受体的关系。免疫学杂志。147:3412-3418)Ba/F3裂解物6号不加抗体样品在4℃温育4小时和24小时(过夜)，旋转加入50μl蛋白A珠，4℃温育1小时样品4℃3000rpm离心3分钟珠子重悬在800μl裂解缓冲液中，倒转几次或旋转几分钟，4℃3000rpm离心3分钟。重复3此，最后用毛细管去除清洗缓冲液珠子在20μl SDS加样缓冲液(含巯基)中重悬。
裂解液7号=EGF-刺激的A431细胞裂解液(抗磷酸酪氨酸)(Upstate Biotechnology,Cat.No.12-302)2.5μl β-巯基乙醇加入到煮沸的100μl裂解液和样品中。
样品离心3000rpm，3分钟(4℃),SN加到SDS PAGE中，使用预染的SDS-PAGE低分子量标准(BioRad cat.no161-0305)Western印迹细胞裂解物转移到硝酸纤维素膜上转移缓冲液=4BmM Tris，39 mM甘氨酸，20％甲醇，pH9.2(5.82g Tris,2.93g甘氨酸，200ml甲醇，溶于1升水中)封闭缓冲液1×PBS,0.1％Tween,5％奶粉，温育过夜抗磷酸酪氨酸标记Gel(cat.05-321,Upstate Biotechnology):1μg/ml 3小时，PBS 0.1％Tween洗2次，每次5分钟蛋白显色，使用1:4000山羊抗鼠辣根过氧化物酶(cat.No RPN2108,Amersham Pharmacia biotech)二抗，室温1小时。
PBS 0.1％Tween洗膜2次，每次5分钟，封闭液洗膜2次，每次5分钟，水洗膜2次，每次5分钟。
ECL Western印迹分析系统ECL Western印迹检测试剂购自Amersham PharmaciaBiotech(cat.no RPN 2108)。
ECL检测试剂盒检测后洗去结合抗体并重标记膜ECL检测试剂盒检测后洗去结合抗体并重标记膜。每次免疫检测后，膜在4℃保鲜膜中保持湿润。
膜浸入剥离缓冲液中(100mM β-巯基乙醇，2％SDS,62.5mM Tris-HCl pH6.7)，50℃温育30分钟，偶尔搅拌。
膜在PBS，0.1％Tween中洗2×10分钟，室温下使用大体积洗膜缓冲液。
膜在封闭缓冲液中室温封闭1小时。
使用抗绿色荧光GFP免疫检测，用抗人CED-6重复结果所有细胞裂解物的Western印迹用抗磷酸酪氨酸，抗-绿色荧光蛋白(GFP)或抗CED-6的兔血清标记，如图30印迹(A),(B)和(C)。抗磷酸酪氨酸染色的，一条49和74KD间的条带出现在专染GFP和CED-6的融合蛋白的COS-1细胞裂解物中，而在对照COS-1细胞裂解物中不出现。抗-GFP和抗-CED-6的Western印迹也染色相同的49和74KD间的条带。
结论融合蛋白CED-6-GFP和GFP-CED-6都为酪氨酸磷酸化的。它们的分子量为62385.95，表明在49和74KD间的条带为抗磷酸酪氨酸，抗绿色荧光蛋白(GFP)和抗-CED-6的阳性染色。
实施例9稳定细胞系用人细胞表面受体CD36转染。
J774鼠单核细胞肿瘤细胞系通过电穿孔用质粒pGA1058转染，如图31和32所示。方法如实施例4转染人ced-6描述的。
转染的细胞系用作使用实施例5方法的吞噬分析的阳性对照。
实施例10从PC12产生凋亡颗粒。
PC-12细胞系(ATCC号:CRL-1712)(Mesner P.W.,Winters T.R.,Green S.H.，(1992)细胞生物学杂志.119:1669-1680)趋于成团生长。加入神经生长因子β(50ng/ml终浓度，Sigma)，PC-12细胞分化为神经元细胞。神经生长因子撤除5天后，诱导神经元大鼠PC12细胞程序性细胞死亡。细胞在含2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氢钠，4.5g/L葡萄糖，10mM HEPES和1mM丙酮酸钠，10％马血清，5％胎牛血清的RPMI1640(Life Technologies)中培养。
这些细胞可使用上述的膜联蛋白/PI试剂盒检测其凋亡特性。
序列表本文如图所示的核苷酸和氨基酸序列对应下列SEQ ID NOs。
SEQ ID NO:1图1SEQ ID NO:2图2SEQ ID NO:3图3SEQ ID NO:4图4SEQ ID NO:5图5SEQ ID NO:6图7SEQ ID NO:7图9SEQ ID NO:8图11
SEQ ID NO:9 图17SEQ ID N0:10图19SEQ ID N0:11图26SEQ ID N0:12图28SEQ ID N0:13图31
序列表<110>DEVGEN NV<120>吞噬分析方法<130>SCB/50784/023<140><141><160>15<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2416<212>DNA<213>人类<220><221>CDS<222>(430)..(1344)<400>1ggtgatgagc ccttgggttc tcgctccgac tgctaaattc gcttggccgg gtccaccttc 60tcgtggcctc actcgccaca cggatcagaa tccggagcag gcagttctct ctattctgag 120gctcctgcgg ctgccgcgct gacttccctg tgtggnggag ggaactctgg gcaggctggt 180tttcttggaa tgtgtttacg atgttgaatg ggacttgaac aggaagctgg acgctgcagc 240tggaactagc gtgccaagtt atttatgatt ccatctgata tacataggag agaaactgat 300agaagaattc tgatggcaac tgtatgatag aagctatata aagtcaagtg tccattttct 360ttcaactata tttgagcata cccaggattt aagtcgtgga actgaacatt tatttggctg 420atcctcatc atg aac cgt gct ttt agc agg aag aaa gac aaa aca tgg atg 471Met Asn Arg Ala Phe Ser Arg Lys Lys Asp Lys Thr Trp Met1 5 10cat aca cct gaa gct tta tca aaa cat ttc att ccc tat aat gca aag 519His Thr Pro Glu Ala Leu Ser Lys His Phe Ile Pro Tyr Asn Ala Lys15 20 25 30ttt ctt ggc agt aca gaa gtg gaa cag cca aaa gga aca gaa gtt gtg 567Phe Leu Gly Ser Thr Glu Val Glu Gln Pro Lys Gly Thr Glu Val Val35 40 45aga gat gct gta agg aaa cta aag ttt gca aga cat atc aag aaa tct 615Arg Asp Ala Val Arg Lys Leu Lys Phe Ala Arg His Ile Lys Lys Ser50 55 60gaa ggc cag aaa att cct aaa gtg gag ttg caa ata tca att tat gga 663Glu Gly Gln Lys Ile Pro Lys Val Glu Leu Gln Ile Ser Ile Tyr Gly65 70 75gta aaa att cta gaa ccc aaa aca aag gaa gtt caa cac aat tgc cag 711Val LVs Ile Leu Glu Pro Lys Thr Lys Glu Val Gln His Asn Cys Gln
80 85 90ctt cat aga ata tct ttt tgt gca gat gat aaa act gac aag agg ata759Leu His Arg Ile Ser Phe Cys Ala Asp Asp Lys Thr Asp Lys Arg Ile95 100 105 110ttc act ttc ata tgc aaa gat tct gag tca aat aaa cat ttg tgc tat807Phe Thr Phe Ile Cys Lys Asp Ser Glu Ser Ash Lys His Leu Cys Tyr115 120 125gta ttt gac agc gaa aag tgt gct gaa gag atc act tta aca att ggc855Val Phe Asp Ser Glu Lys Cys Ala Glu Glu Ile Thr Leu Thr Ile Gly130 135 140caa gca ttt gac ctg gca tac agg aaa ttt cta gaa tca gga gga aaa903Gln Ala Phe Asp Leu Ala Tyr Arg Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Lys145 150 155gat gtt gaa aca aga aaa cag atc gca ggg tta caa aaa aga atc caa951Asp Val Glu Thr Arg Lys Gln Ile Ala Gly Leu Gln Lys Arg Ile Gln160 165 170gac tta gaa aca gaa aat atg gaa ctt aaa aat aaa gta caa gat ttg999Asp Leu Glu Thr Glu Asn Met Glu Leu Lys Asn Lys Val Gln Asp Leu175 180 185 190gaa aac caa ctg aga ata act caa gta tca gca cct cca gca ggc agt1047Glu Asn Gln Leu Arg Ile Thr Gln Val Ser Ala Pro Pro Ala Gly Ser195 200 205atg aca cct aag tcg ccc tcc act gac atc ttt gat atg att cca ttt1095Met Thr Pro Lys Ser Pro Ser Thr Asp Ile Phe Asp Met Ile Pro Phe210 215 220tct cca ata tca cac cag tct tcg atg cct act cgc aat ggc aca cag1143Ser Pro Ile Ser His Gln Ser Ser Met Pro Thr Arg Asn Gly Thr Gln225 230 235cca cct cca gta cct agt aga tct act gag att aaa cgg gac ctg ttt1191Pro Pro Pro Val Pro Ser Arg Ser Thr Glu Ile Lys Arg Asp Lcu Phe240 245 250gga gca gaa cct ttt gac cca ttt aac tgt gga gca gca gat ttc cct1239Gly Ala Glu Pro Phe Asp Pro Phe Asn Cys Gly Ala Ala Asp Phe Pro255 260 265 270cca gat att caa tca aaa tta gat gag atg cag gag ggg ttc aaa atg1287Pro Asp Ile Gln Ser Lys Leu Asp Glu Met Gln Glu Gly Phe Lys Met275 280 285gga cta act ctt gaa ggc aca gta ttt tgt ctc gac ccg tta gac agt1335Gly Leu Thr Leu Glu Gly Thr Val Phe Cys Leu Asp Pro Leu Asp Ser290 295 300agg tgc tga catcaagaac aagaaatcct gattcatgtt aaatgtgttt1384Arg Cys305gtatacacat gtcatttatt attattactt taagataggt attattcatg tgtcaatgtg 1444tttgaatatt ttaatatttt gaaaattttc tcagttaaat ttcctcacct tcactattga 1504tctgtaattt ttattttaaa aacagcttac tgtaaagtag atcatacttt tatgttcctt 1564tctgtttcta ctgtagatga atttgtaatt gaaagacata ttatacaaat acctgccttg 1624tgtctgagtt ctatttagtt agcatcttga aatttgtatt cattttccag atggctagtt 1684tattaatgat ttcccaaaag ccatacctta aagataactt tttaaattct gaagagacat 1744gccaatgtca aactaaacat gttctgtttt taaaccaaca aacatgttac tattcattgg 1804acagatstca ttttatgtat aaatactgtt cacatcactg ggaaaatgta aactttaaac 1864staatgccac aaggtcacta atttctagca ggtaasatta taaggatata aattccaata 1924staaaccaaa tgtatttags gtatttatta gtaaatgcaa ggtgatgtta gttatgatca 1984gttatactct aaatatttaa tttgttttat aaaggtagtg aaaaaatgaa aatttgctat 2044ttattaaaaa acattaaatt tcattccaaa tgagataagt gatattacta taacatctaa 2104gcatcatctg atttgatatt ccctaaaaaa catttggaat atatgctatc tatagattca 2164gtatctacta cccatattta ctttaccaaa tatatttctc ctcactgcat aaggactsct 2224cttctcatat tttcttcttt gatgaagata tttttcacca aagtttattt tgtgatgccc 2284tcttggtttt gatactttaa aatctgtggc acccgttcta catgaattat caatatttgg 2344taaattcaat ctgtatttgt tttgttaaag tcaaaaatct cattttccaa aaaaaaaaaa 2404aaaaaactcg ag 2416<210>2<21l>304<212>蛋白质<213>人类<400>2Met Asn Arg Ala Phe Ser Arg Lys Lys Asp Lys Thr Trp Met His Thr1 5 10 15Pro Glu Ala Leu Ser Lys His Phe Ile Pro Tyr Asn Ala Lys Phe Leu20 25 30Gly Ser Thr Glu Val Glu Gln Pro Lys Gly Thr Glu Val Val Arg Asp35 40 45Ala Val Arg Lys Leu Lys Phe Ala Arg His Ile Lys Lys Ser Glu Gly50 55 60Gln Lys Ile Pro Lys Val Glu Leu Gln Ile Ser Ile Tyr Gly Val Lys65 70 75 80Ile Leu Glu Pro Lys Thr Lys Glu Val Gln His Asn Cys Gln Leu His85 90 95Arg Ile Ser Phe Cys Ala Asp Asp Lys Thr Asp Lys Arg Ile Phe Thr100105 110Phe Ile Cys Lys Asp Ser Glu Ser Asn Lys His Leu Cys Tyr Val Phe115 120 125Asp Ser Glu Lys Cys Ala Glu Glu Ile Thr Leu Thr Ile Gly Gln Ala130 135 140Phe Asp Leu Ala Tyr Arg Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Lys Asp Val145 150 155 160Glu Thr Arg Lys Gln Ile Ala Gly Leu Gln Lys Arg Ile Gln Asp Leu165 170 175Glu Thr Glu Ash Met Glu Leu Lys Ash Lys Val Gln Asp Leu Glu Ash180 185 190Gln Leu Arg Ile Thr Gln Val Ser Ala Pro Pro Ala Gly Ser Met Thr195 200 205Pro Lys Ser Pro Ser Thr Asp Ile Phe Asp Met Ile Pro Phe Ser Pro210 215 220Ile Ser His Gln Ser Ser Met Pro Thr Arg Asn Gly Thr Gln Pro Pro225 230 235 240Pro Val Pro Ser Arg Ser Thr Glu Ile Lys Arg Asp Leu Phe Gly Ala245 250 255Glu Pro Phe Asp Pro Phe Asn Cys Gly Ala Ala Asp Phe Pro Pro Asp260 265 270Ile Gln Ser Lys Leu Asp Glu Met Gln Glu Gly Phe Lys Met Gly Leu275 280 285Thr Leu Glu Gly Thr Val Phe Cys Leu Asp Pro Leu Asp Ser Arg Cys290 295 300<210>3<211>2278<212>DNA<213>人类<220><221>CDS<222>(430)..(1206)<400>3ggtgatgagc ccttgggttc tcgctccgac tgctaaattc gcttggccgg gtccaccttc 60tcgtggcctc actcgccaca cggatcagaa tccggagcag gcagttctct ctattctgag 120gctcctgcgg ctgccgcgct gacttccctg tgtggnggag ggaactctgg gcaggctggt 180tttcttggaa tgtgtttacg atgttgaatg ggacttgaac aggaagctgg acgctgcagc 240tggaactagc gtgccaagtt atttatgatt ccatctgata tacataggag agaaactgat 300agaagaattc tgatggcaac tgtatgatag aagctatata aagtcaagtg tccattttct 360ttcaactata tttgagcata cccaggattt aagtcgtgga actgaacatt tatttggctg 420atcctcatc atg aac cgt gct ttt agc agg aag aaa gac aaa aca tgg atg 471Met Asn Arg Ala Phe Ser Arg Lys Lys Asp Lys Thr Trp Met1 5 10cat aca cct gaa gct tta tca aaa cat ttc att ccc tat aat gca aag 519His Thr Pro Glu Ala Leu Ser Lys His Phe Ile Prc Tyr Asn Ala Lys15 20 25 30ttt ctt ggc agt aca gaa gtg gaa cag cca aaa gga aca gaa gtt gtg 567Phe Leu Gly Ser Thr Glu Val Glu Gln Pro Lys Gly Thr Glu Val Val35 40 45aga gat gct gta agg aaa cta aag ttt gca aga cat atc aag aaa tct 615Arg Asp Ala Val Arg Lys Leu Lys Phe Ala Arg His Ile Lys Lys Ser50 55 60gaa ggc cag aaa att cct aaa gtg gag ttg caa ata tca att tat gga 663Glu Gly Gln Lys Ile Pro Lys Val Glu Leu Gln Ile Ser Ile Tyr Gly65 70 75gta aaa att cta gaa ccc aaa aca aag gct gaa gag atc act tta aca 711Val Lys Ile Leu Glu Pro Lys Thr Lys Ala Glu Glu Ile Thr Leu Thr80 85 90att ggc caa gca ttt gac ctg gca tac agg aaa ttt cta gaa tca gga 759Ile Gly Gln Ala Phe Asp Leu Ala Tyr Arg Lys Phe Leu Glu Ser Gly95 100 105 110gga aaa gat gtt gaa aca aga aaa cag atc gca ggg tta caa aaa aga 807Gly Lys Asp Val Glu Thr Arg Lys Gln Ile Ala Gly Leu Gln Lys Arg115 120 125atc caa gac tta gaa aca gaa aat atg gaa ctt aaa aat aaa gta caa 855Ile Gln Asp Leu Glu Thr Glu Asn Met Glu Leu Lys Asn Lys Val Gln130 135 140gat ttg gaa aac caa ctg aga ata act caa gta tca gca cct cca gca 903Asp Leu Glu Asn Gln Leu Arg Ile Thr Gln Val Ser Ala Pro Pro Ala145 150 155ggc agt atg aca cct aag tcg ccc tcc act gac atc ttt gat atg att 951Gly Ser Met Thr Pro Lys Ser Pro Ser Thr Asp Ile Phe Asp Met Ile160 165 170cca ttt tct cca ata tca cac cag tct tcg atg cct act cgc aat ggc 999Pro Phe Ser Pro Ile Ser His Gln Ser Ser Met Pro Thr Arg Asn Gly175 180 185 190aca cag cca cct cca gta cct agt aga tct act gag att aaa cgg gac 1047Thr Gln Pro Pro Pro Val Pro Ser Arg Ser Thr Glu Ile Lys Arg Asp195 200 205ctg ttt gga gca gaa cct ttt gac cca ttt aac tgt gga gca gca gat 1095Leu Phe Gly Ala Glu Pro Phe Asp Pro Phe Asn Cys Gly Ala Ala Asp210 215 220ttc cct cca gat att caa tca aaa tta gat gag atg cag gag ggg ttc 1143Phe Pro Pro Asp Ile Gln Ser Lys Leu Asp Glu Met Gln Glu Gly Phe225 230 235aaa atg gga cta act ctt gaa ggc aca gta ttt tgt ctc gac ccg tta 1191Lys Met Gly Leu Thr Leu Glu Gly Thr Val Phe Cys Leu Asp Pro Leu240 245 250gac agt agg tgc tga catcaagaac aagaaatcct gattcatgtt aaatgtgttt 1246Asp Ser Arg Cys255gtatacacat gtcatttatt attattactt taagataggt attattcatg tgtcaatgtt 1306tttgaatatt ttaatatttt gaaaattttc tcagttaaat ttcctcacct tcactattga 1366tctgtaattt ttattttaaa aacagcttac tgtaaagtag atcatacttt tatgttcctt 1426tctgtttcta ctgtagatga atttgtaatt gaaagacata ttatacaaat acctgccttg 1486tgtctgagtt ctatttagtt agcatcttga aatttgtatt cattttccag atggctagtt 1546tattaatgat ttcccaaaag ccatacctta aagataactt tttaaattct gaagagacat 1606gccaatgtca aactaaacat gttctgtttt taaaccaaca aacatgttac tattcattgg 1666acagatatca ttttatgtat aaatactgtt cacatcactg ggaaaatgta aactttaaac 1726ataatgccac aaggtcacta atttctagca ggtaaaatta taaggatata aattccaata 1786ataaaccaaa tgtatttaga gtatttatta gtaaatgcaa ggtgatgtta gttatgatca 1846gttatactct aaatstttaa tttgttttat aaaggtagtg aaaaaatgaa aatttgctat 1906ttattaaaaa acattaaatt tcattccaaa tgagataagt gatattacta taacatctaa 1966gcatcatctg atttgatatt ccctaaaaaa catttggaat atatgctatc tatagattca 2026gtatctacta cccatattta ctttaccaaa tatatttctc ctcactgcat aaggactact 2086cttctcatat tttcttcttt gatgaagata tttttcacca aagtttattt tgtgatgccc 2146tcttggtttt gatactttaa aatctgtggc acccgttcta catgaattat caatatttgg 2206taaattcaat ctgtatttgt tttgttaaag tcaaaaatct cattttccaa aaaaaaaaaa 2266aaaaaactcg ag 2278<210>4<211>258<212>蛋白质<213>人类<400>4Met Asn Arg Ala Phe Ser Arg Lys Lys Asp Lys Thr Trp Met His Thr1 5 10 15Pro Glu Ala Leu Ser Lys His Phe Ile Pro Tyr Asn Ala Lys Phe Leu20 25 30Gly Ser Thr Glu Val Glu Gln Pro Lys Gly Thr Glu Val Val Arg Asp35 40 45Ala Val Arg Lys Leu Lys Phe Ala Arg His Ile Lys Lys Ser Glu Gly50 55 60Gln Lys Ile Pro Lys Val Glu Leu Gln Ile Ser Ile Tyr Gly Val Lys65 70 75 80Ile Leu Glu Pro Lys Thr Lys Ala Glu Glu Ile Thr Leu Thr Ile Gly85 90 95Gln Ala Phe Asp Leu Ala Tyr Arg Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Lys100 105 110Asp Val Glu Thr Arg Lys Gln Ile Ala Gly Leu Gln Lys Arg Ile Gln115 120 125Asp Leu Glu Thr Glu Asn Met Glu Leu Lys Asn Lys Val Gln Asp Leu130 135 140Glu Asn Gln Leu Arg Ile Thr Gln Val Ser Ala Pro Pro Ala Gly Ser145 150 155 160Met Thr Pro Lys Ser Pro Ser Thr Asp Ile Phe Asp Met Ile Pro Phe165 170175Ser Pro Ile Ser His Gln Ser Ser Met Pro Thr Arg Asn Gly Thr Gln180 185 190Pro Pro Pro Val Pro Ser Arg Ser Thr Glu Ile Lys Arg Asp Leu Phe195 200 205Gly Ala Glu Pro Phe Asp Pro Phe Asn Cys Gly Ala Ala Asp Phe Pro210 215 220Prc Asp Ile Gln Ser Lys Leu Asp Glu Met Gln Glu Gly Phe Lys Met225 230 235 240Gly Leu Thr Leu Glu Gly Thr Val Phe Cys Leu Asp Pro Leu Asp Ser245 250 255Arg 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780ttttgaccca tttaactgtg gagcagcaga tttccctcca gatattcaat caaaattaga 840tgagatgcag gaggggttca aaatgggact aactcttgaa ggcacagtat tttgtctcga 900cccgttagac agtaggtgcg tcgacggtac cgcgggcccg ggatccatcg ccaccatggt 960gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga 1020cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa 1080gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt 1140gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca 1200cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa 1260ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa 1320ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct 1380ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat 1440caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca 1500ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct 1560gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct 1620ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaaagcgg 1680ccgcgactct agatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa 1740aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac 1800ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat 1860aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttaa 1920ggcgtaaatt gtaagcgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag 1980ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac 2040cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga 2100ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc 2160accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg 2220gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa 2280gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac 2340caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tcaggtggca cttttcgggg 2400aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 2460catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtcctgaggc 2520ggaaagaacc agctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 2580gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc 2640ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata 2700gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg 2760ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag 2820ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa agatcgatca 2880agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc 2940ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc 3000tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga 3060cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac 3120gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct 3180gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa 3240agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc 3300attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct 3360tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc 3420caggctcaag gcgagcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg 3480cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct 3540gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct 3600tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca 3660gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa 3720atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc 3780tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc 3840ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac cctaggggga ggctaactga aacacggaag 3900gagacaatac cggaaggaac ccgcgctatg acggcaataa aaagacagaa taaaacgcac 3960ggtgttgggt cgtttgttca taaacgcggg gttcggtccc agggctggca ctctgtcgat 4020accccaccga gaccccattg gggccaatac gcccgcgttt cttccttttc cccaccccac 4080cccccaagtt cgggtgaagg cccagggctc gcagccaacg tcggggcggc aggccctgcc 4140atagcctcag gttactcata tatactttag attgatttaa 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180tatcaagaaa tctgaaggcc agaaaattcc taaagtggag ttgcaaatat caatttatgg 240agtaaaaatt ctagaaccca aaacaaagga agttcaacac aattgccagc ttcatagaat 300atctttttgt gcagatgata aaactgacaa gaggatattc actttcatat gcaaagattc 360tgagtcaaat aaacatttgt gctatgtatt tgacagcgaa aagtgtgctg aagagatcac 420tttaacaatt ggccaagcat ttgacctggc atacacgaaa tttctagaat caggaggaaa 480agatgttgaa acaagaaaac agatcgcagg gttacaaaaa agaatccaag acttagaaac 540agaaaatatg gaacttaaaa ataaagtaca agatttggaa aaccaactga gaataactca 600agtatcagca cctccagcag gcagtatgac acctaagtcg ccctccactg acatctttga 660tatgattcca ttttctccaa tatcacacca gtcttcgatg cctactcgca atggcacaca 720gccacctcca gtacctagta gatctactga gattaaacgg gacctgtttg gagcagaacc 780ttttgaccca tttaactgtg gagcagcaga tttccctcca gatattcaat caaaattaga 840tgagatgcag gaggggttca aaatgggact aactcttgaa ggcacagtat tttgtctcga 900cccgttagac agtaggtgct gagtcgacgg taccatatgg gaattcgaag cttggctgtt 960ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc 1020tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga 1080actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag 1140ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt 1200atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg 1260aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg 1320catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt 1380tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 1440aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 1500ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 1560aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 1620acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 1680ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg 1740gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 1800atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 1860acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 1920tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 1980ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 2040aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 2100aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 2160ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 2220atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 2280aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 2340accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 2400tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 2460tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 2520tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 2580cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 2640caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 2700cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 2760cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 2820gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 2880acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 2940atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 3000cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 3060gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 3120tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 3180tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 3240agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgcct gatgcggtat tttctcctta 3300cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 3360ccgcatagtt aagccagtat acactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc 3420ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc 3480ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc 3540accgaaacgc gcgaggcagc agatcaattc gcgcgcgaag gcgaagcggc 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构建包括克隆到载体pEGFP-C2多克隆位点的人hlced-6 cDNA<400>7tcgacggtac cgcgggcccg ggatccaccg gatctagata actgatcata atcagccata 60ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga 120aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 180aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 240gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt aacgcgtaaa ttgtaagcgt taatattttg 300ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc 360ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt 420tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc 480tatcagggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg 540tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga 600aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg 660ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg 720ctacagggcg cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta 780tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt 840caataatatt gaaaaaggaa gagtcctgag gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc 900agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc 960tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc 1020aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc 1080ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt 1140atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt 1200ttggaggcct aggcttttgc aaagatcgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg 1260attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc 1320tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg 1380caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa 1440gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc 1500gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat 1560ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg 1620cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc 1680gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag 1740catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc 1800gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc 1860cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata 1920gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc 1980gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac 2040gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc 2100catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt 2160tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc 2220accctagggg gaggctaact gaaacacgga aggagacaat accggaagga acccgcgcta 2280tgacggcaat aaaaagacag aataaaacgc acggtgttgg gtcgtttgtt cataaacgcg 2340gggttcggtc ccagggctgg cactctgtcg ataccccacc gagaccccat tggggccaat 2400acgcccgcgt ttcttccttt tccccacccc accccccaag ttcgggtgaa ggcccagggc 2460tcgcagccaa cgtcggggcg gcaggccctg ccatagcctc aggttactca tatatacttt 2520agattgattt 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权利要求
1．一种表达载体，包括编码人CED-6蛋白的脱氧核苷酸序列，其中人CED-6蛋白包括图4或图5的氨基酸序列或其与图4或图5的氨基酸序列的差异仅有功能保守性的氨基酸变化的氨基酸序列。
2．权利要求1的表达载体，包括图2或图3所示的从转录起始密码子到转录终止密码子的脱氧核苷酸序列。
3．权利要求1或2的表达载体，它包括编码位于所述载体中的报告基因的脱氧核苷酸序列，结果是人CED-6蛋白或其功能保守的变体的表达导致该报告基因表达报告蛋白。
4．权利要求3的表达载体，其中报告基因位于编码人CED-6蛋白或其功能保守的变体的脱氧核苷酸序列的5’端。
5．权利要求3的表达载体，其中报告基因位于编码人CED-6蛋白或其功能保守的变体的脱氧核苷酸序列的3’端。
6．权利要求3到5中任意一项的表达载体，其中报告基因编码绿色荧光蛋白(GFP)。
7．权利要求4的表达载体，它为在多克隆位点插入了编码人CED-6蛋白的脱氧核苷酸序列的pEGFP-C2，其中人CED-6蛋白包括如图4或图5所示的氨基酸序列或其功能保守的变体。
8．权利要求5的表达载体，它为在多克隆位点插入了编码人CED-6蛋白的脱氧核苷酸序列的pEGFP-N3，其中人CED-6蛋白包括如图4或图5所示的氨基酸序列或其功能保守的变体。
9．权利要求4或7的表达载体，其中所述的载体包括图28的核苷酸序列(pGA3103)。
10．权利要求5或8的表达载体，其中所述载体包括图9的核苷酸序列(pGA3104)。
11．权利要求1或2的表达载体，其中所述载体表达人CED-6蛋白或其功能保守的变体，且在载体的氨基和/或羧基端包括表位标记。
12．权利要求11的表达载体，其中表位标记为HisA。
13．权利要求11的表达载体，它为pBAD/HisA，插入有编码人CED-6蛋白的脱氧核苷酸序列，人CED-6蛋白包括如图4或图5所示的氨基酸序列，或其功能保守的变体。
14．权利要求12的表达载体，它具有图17所示的脱氧核苷酸序列(pGA1028)。
15．用权利要求1到13中任一项的表达载体转染的哺乳动物细胞系。
16．权利要求15的哺乳动物细胞系，其中所述细胞选自成纤维细胞细胞系或上皮细胞细胞系。
17．权利要求16的哺乳动物细胞系，其中所述细胞系选自COS1,BHK21,L929,CV1,SWISS 3T3,HT144,IMR32,HEPG2,MDCK,MCF7,293,Hela,A549,SW48，或G361。
18．权利要求15的哺乳动物细胞系，其中所述细胞系为初级细胞系。
19．权利要求18的哺乳动物细胞系，其中所述细胞系选自人皮肤FIBs，皮肤角质细胞，白细胞，单核细胞，淋巴细胞，树突细胞或巨噬细胞。
20．权利要求19的哺乳动物细胞系，它为鼠巨噬细胞系J774或人单核细胞细胞系THP-1。
21．一种方法，该方法用于确定一种化合物是否是促进凋亡细胞吞噬的信号传导通路的抑制剂或增强剂，该方法包括将权利要求15到20中任意一项的转化的哺乳动物细胞暴露给凋亡颗粒，并测定在化合物存在或缺乏时，颗粒被转染细胞吞噬的速率。
22．权利要求21的方法，其中在加入凋亡颗粒前将转染的细胞暴露给化合物。
23．权利要求21或22的方法，其中凋亡颗粒选自凋亡嗜中性细胞，凋亡淋巴细胞或视需要而定经过调理的红细胞。
24．权利要求21到23中任意一项的方法，其中凋亡颗粒包括贴壁细胞系PC12。
25．权利要求21到23中任意一项的方法，其中凋亡颗粒包括生长因子依赖性的小鼠细胞系Ba/F3。
26．权利要求25的方法，其中Ba/F3细胞通过在缺乏生长因子IL-3时培养以发生凋亡。
27．权利要求23到26中任意一项的方法，其中包括凋亡颗粒的细胞稳定转染了报告基因。
28．权利要求27的方法，其中报告基因选自编码β-半乳糖苷酶的基因，编码荧光蛋白的基因或编码能够产生荧光的蛋白的基因。
29．权利要求28的方法，其中能发光的蛋白为荧光素酶。
30．权利要求28的方法，其中所述的荧光蛋白为绿色荧光蛋白。
31．权利要求26的方法，其中凋亡颗粒包括稳定转染了β-半乳糖苷酶或荧光素酶的Ba/F3细胞。
32．权利要求26的方法，其中吞噬作用的水平通过添加一种能够被β-半乳糖苷酶转化为荧光化合物的底物进行检测的。
33．权利要求21到32中任意一项的方法，其中如果在暴露给待测化合物时，没有观察到吞噬作用或吞噬的量减少，应检测哺乳动物转染细胞的活力。
34．权利要求33的方法，其中如果细胞有活力，将哺乳动物转染的细胞的表型与相同细胞系的未转染的哺乳动物细胞表型相比。
35．权利要求21到32中任意一项的方法，其中如果在待测化合物存在时，观察到吞噬的量的增加，该方法包括进一步将所述的化合物暴露给未转染的相同细胞系的哺乳动物细胞，并观察化合物是否诱导与转染哺乳动物细胞表现的表型相同的表型。
36．通过权利要求21到35任意一项的方法鉴定的化合物，它被鉴定为促进凋亡细胞吞噬的信号传导通路的抑制剂或增强剂。
37．一种方法，该方法用于确定一种化合物是否为促进凋亡细胞吞噬的信号传导通路的抑制剂或增强剂，该方法包括以下步骤(1)向哺乳动物细胞显微注射包括图4或图5的氨基酸序列或其与图4或图5的氨基酸序列的差异仅有功能保守性的氨基酸变化的氨基酸序列的人CED-6蛋白；(2)将步骤(1)产生的哺乳动物细胞暴露给凋亡颗粒并测定颗粒被细胞在化合物存在或缺乏时吞噬的速率。
38．权利要求37的方法，其中显微注射的哺乳动物细胞在加入凋亡颗粒前被暴露给化合物。
39．权利要求38的方法，其中凋亡颗粒选自凋亡嗜中性细胞，凋亡淋巴细胞或视需要而定经调理的凋亡红细胞。
40．权利要求37或38中的方法，其中凋亡颗粒包括贴壁细胞系PC12。
41．权利要求37到39中任意一项的方法，其中凋亡细胞包括生长因子依赖的小鼠细胞系Ba/F3。
42．权利要求41的方法，其中Ba/F3细胞通过在生长因子IL-3缺乏时培养产生凋亡。
43．权利要求39到42中任意一项的方法，其中包括凋亡颗粒的细胞稳定转染了报告基因。
44．权利要求27的方法，其中报告基因选自编码β-半乳糖苷酶的基因，编码荧光蛋白的基因或编码能发光的蛋白的基因。
45．权利要求44的方法，其中所述的蛋白能产生的荧光为荧光素酶。
46．权利要求44的方法，其中荧光蛋白是绿色荧光蛋白。
47．权利要求42的方法，其中凋亡颗粒包括稳定转染了β-半乳糖苷酶的Ba/F3细胞。
48．权利要求47的方法，其中吞噬作用的水平通过加入能够被β-半乳糖苷酶转换化荧光化合物的底物进行探测。
49．权利要求37到48中任意一项的方法，其中哺乳动物细胞是成纤维细胞或上皮细胞。
50．权利要求49的方法，其中哺乳动物细胞选自COS1,BHK21,L929,CV1,SWISS 3T3,HT144,IMR32,HEPG2,MDCK,MCF7,293,Hela,A549,SW48或G361。
51．权利要求37到48中任意一项的方法，其中哺乳动物细胞为一种初级细胞。
52．权利要求51的方法，其中所述的哺乳动物细胞选自人皮肤FIBs，皮肤角质细胞，白细胞，单核细胞，淋巴细胞，树突细胞或巨噬细胞。
53．权利要求52的方法，其中哺乳动物细胞是小鼠巨噬细胞J774或人单核细胞THP-1。
54．权利要求37到53中任意一项的方法，如果在暴露给待测化合物时，没有观察到吞噬作用或吞噬的量减少，应检测哺乳动物转染细胞的活力。
55．权利要求54的方法，其中如果细胞有活力，将哺乳动物转染的细胞的表型与相同细胞系的未转染的哺乳动物细胞表型相比。
56．权利要求21到32中任意一项的方法，其中如果在待测化和物存在时，观察到吞噬的量的增加，该方法包括进一步暴露化合物给未转染的相同细胞系的哺乳动物细胞，并观察化合物是否诱导与转染哺乳动物细胞表现的表型相同的表型。
57．通过权利要求37到56任意一项的方法鉴定的化合物，它被鉴定为促进凋亡细胞吞噬的信号传导通路的抑制剂或增强剂。
58．一种方法，该方法用于确定一种化合物是否为促进凋亡细胞吞噬的信号传导通路的抑制剂或增强剂，该方法包括以下步骤(1)向哺乳动物细胞显微注射或转染一种载体，该载体表达与如图2或图3所示的核苷酸序列的所有或一部分反义的RNA序列；(2)向凋亡颗粒暴露步骤1制备的哺乳动物细胞并测量当化合物存在或缺失时颗粒被细胞吞噬的速率。
59．权利要求58的方法，其中反义RNA包括在高于2×SSC；0.1％SDS；25℃-50℃严格条件下能与图2或图3的所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
60．权利要求58或59的方法，包括权利要求38到56任意一项的特征。
61．通过权利要求58到60任意一项的方法确定的化合物，其中的方法可以确定所述化合物是否是促进凋亡细胞吞噬的信号传导通路的抑制剂或增强剂。
62．一种肽，它包括具有如图4的氨基酸序列的人CED-6同源物的片段，其中所述片段包括氨基酸序列NRAFSRKKDKTC,FLGSTEVEQPKGTE或TRNGTQPPPVPSRST。
63．权利要求62的肽，由氨基酸序列NRAFSRKKDKTC,FLGSTEVEQPKGET或TRNGTQPPPVPSRST组成。
64．一种抗体制备物，它包括抗下列如图4的人CED-6同源物的一或更多表位的抗体NRAFSRKKDKTC,FLGSTEVEQPKGTE或TRNGTQPPPVPSRST。
65．一种抗体制备物，包括抗人CED-6同源物表位NRAFSRKKDKTC的抗体。
66．一种抗体制备物，包括抗人CED-6同源物表位FLGSTEVEQPKGTE的抗体。
67．一种抗体制备物，包括抗人CED-6同源物表位TRNGTQPPPVPSRST的抗体。
68．权利要求63到66中任意一项的抗体制备物，其中所述抗体为多克隆抗体。
69．一种方法，用于诊断与个体吞噬细胞中人CED-6蛋白的过表达或低表达相关的疾病，包括(a)从所述个体获得吞噬细胞样品；(b)向权利要求64到68中任意一项的抗体制备物暴露吞噬细胞；(c)定量测定在抗体和所述CED-6蛋白之间形成的任意的免疫复合物的存在；(d)与来自对照个体的吞噬细胞比较形成免疫复合物的量。
70．一种方法，用于确定一种化合物是否是促进凋亡细胞吞噬的信号转导通路的抑制剂或增强剂，包括(a)向检测的化合物暴露转染了权利要求1到14中任意一项的表达载体的转染的哺乳动物细胞；(b)向哺乳动物细胞暴露权利要求64到68中任意一项的抗体制备物；(c)定量测量抗体和所述细胞表达的蛋白之间形成的免疫复合物的存在；(d)将检测的免疫复合物量与未暴露给化合物的如步骤(a)转染的哺乳动物细胞中检测的免疫复合物的量的水平进行比较。
71．权利要求70的方法，其中哺乳送物细胞选自COS1,BHK21,L929,CU1 SWISS 3T3,HT144,IMR32,HEPG2,MDCK,MCF7,293,Hela,A549,SW48或G361。
72．权利要求71的方法，其中哺乳动物细胞是COS1细胞。
73．权利要求70的方法，其中哺乳动物细胞是人皮肤FIB，皮肤角质细胞，白细胞，单核细胞或巨噬细胞。
74．权利要求73的方法，其中所述细胞是小鼠单核细胞J774或人单核细胞THP-1。
75．一种融合蛋白，包括(1)一种图4或图5的氨基酸序列或其与图4或图5的序列的差异仅仅有功能保守型的氨基酸变化的氨基酸序列；和(2)一种为报告基因的表达产物的蛋白。
76．权利要求75的融合蛋白，它由表达GFP和图9或28所示的h1ced-7编码序列而获得。
77．一种融合蛋白，包括(1)一种如图4或图5的氨基酸序列或其与图4或图5的氨基酸序列的差异仅在功能保守性上发生氨基酸变化的序列，和(2)一种表位标记。
78．权利要求77的融合蛋白，它通过表达HisA和图17所示的hlced-6编码序列而获得。
79．一种方法，该方法用于确定一种化合物是否是促进凋亡细胞吞噬的信号转导通路的抑制剂或增强剂，该方法包括(a)在待测化合物存在或缺乏时，向凋亡的哺乳动物细胞暴露哺乳动物专业性或半专业性吞噬细胞，该凋亡的哺乳动物细胞稳定转染了能够产生无需显微镜探测的信号的报告基因，(b)移除未被所述吞噬细胞吞噬的凋亡细胞(c)探测任何来自吞噬细胞的信号；其中在化合物存在时与化合物缺乏时相比任何信号的差异说明该化合物是凋亡细胞吞噬作用的抑制剂或增强剂。
80．权利要求79的方法，其中吞噬细胞是小鼠细胞系J774或人单核细胞系THP-1。
81．权利要求80的方法，其中单核细胞系经培养使之在暴露给凋亡颗粒前分化为巨噬细胞。
82．权利要求79到81中任意一项的方法，其中吞噬细胞是转基因细胞。
83．权利要求82的方法，其中吞噬细胞用权利要求1到14的任意一项的表达载体转染。
84．权利要求82的方法，其中吞噬细胞用编码细胞表面受体CD36的表达载体转染。
85．权利要求84的方法，其中吞噬细胞用图31的载体转染。
86．权利要求79到85的方法，其中凋亡细胞包括贴壁细胞PC12。
87．权利要求79到85的方法，其中凋亡细胞包括生长因子依赖的小鼠细胞系Ba/F3。
88．权利要求26的方法，其中Ba/F3细胞在生长因子IL-3缺乏条件下培养时发生凋亡。
89．权利要求88的方法，其中在约20％膜联蛋白阳性且少于5％碘化丙啶阴性时，细胞被认为是凋亡。
90．权利要求79的方法，其中报告基因选自编码β-半乳糖苷酶的基因，编码荧光蛋白的基因或编码能够产生荧光的蛋白的基因。
91．权利要求90的方法，其中能够产生荧光的蛋白是荧光素酶。
92．权利要求91的方法，其中凋亡细胞被稳定转染了表现图19的PGL2对照的表达特性的质粒。
93．权利要求92的方法，其中凋亡细胞被稳定转染了包括图19的脱氧核糖核苷酸序列的质粒。
94．权利要求79-89中任意一项的方法，其中荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。
95．权利要求94的方法，其中凋亡细胞被稳定转染了表现表达特性的质粒或如图10或29的质粒。
96．权利要求95的方法，其中所述的凋亡细胞被稳定转染了包括图9或28的脱氧核糖核苷酸序列的质粒。
97．权利要求79-89中任意一项的方法，其中凋亡细胞被稳定转染了表达β-半乳糖苷酶的质粒。
98．权利要求97的方法，其中所述质粒具有图11所示的质粒的表达特性。
99．权利要求98的方法，其中所述质粒包括图11所示的脱氧核糖核苷酸序列。
100．权利要求79-89中任意一项的方法，其中凋亡颗粒包括稳定转染了β-半乳糖苷酶的细胞系Ba/F3。
101．权利要求100的方法，其中吞噬的水平通过加入一种能够被β-半乳糖苷酶转换为荧光化合物的底物而被检测。
102．权利要求79-101中任意一项的方法，其中如果在暴露给待测化合物时，未观察到吞噬作用或吞噬的量减少，应检测哺乳动物转染细胞的活力。
103．权利要求79-102中任意一项的方法，其中吞噬细胞在多孔板中培养，向其中每个孔加入凋亡细胞和待测化合物。
104．前述任一项权利要求的方法，其中来自报告基因的信号通过自动平板读数仪检测。
105．权利要求101的方法，其中来自报告基因的信号通过能检测荧光信号的自动平板读数仪检测。
106．一种化合物，经过权利要求79-105中任意一项的方法鉴定为凋亡细胞吞噬的抑制剂或增强剂。
107．权利要求22-35,39-56,58-60中任意一项的方法，其中吞噬通过非显微镜方式测量。
108．权利要求107的方法，其中非显微镜方式为多孔平板读数仪。
109．权利要求108的方法，其中多孔平板读数仪测量发光，荧光或进行分光光度检测。
110．权利要求79-105中任意一项的方法，具有权利要求108和109的特点。
111．一种方法，用于诊断与个体中吞噬细胞的人CED-6过表达或低表达相关的疾病，包括(a)从所述个体中获得吞噬细胞样品，(b)从吞噬细胞分离RNA，(c)从RNA制备DNA(d)在所述cDNA上进行第一次PCR反应，(e)在所述第一次PCR反应的反应产物上进行第二次(嵌套式)PCR，(f)通过分析第1次和第2次PCR的反应产物，定量和定性测量CED-6RNA的存在，(g)与来自对照个体的吞噬细胞形成的反应产物比较在第1次和第2次PCR形成的反应产物的量和类型。
112．权利要求111的方法，其中PCR使用从人CED-6的序列衍生的引物，或从cDNA产生时使用的载体衍生的引物。
113．权利要求111或112的方法，其中第1次PCR使用的引物具有核苷酸序列1)cgcaaggatccccatgaaccgtgcttttagcaggaag2)gatctactaggtactggag
114．权利要求111,112或113的方法，其中第2次PCR使用的引物具有核苷酸序列1)cgcaaggatccccatgaaccgtgcttttagcaggaag2)gcggatggtaccgtcgactgctgatacttgagttattctcag。
全文摘要
本发明提供分析方法,该方法用于检测一种化合物是否是促进吞噬凋亡细胞的信号传导通路的的促进物或抑制剂。此方法包括将吞噬细胞暴露给视需要而定,转染有报告基因的凋亡细胞,在待测化合物存在或缺失时测量吞噬的程度。使用表达载体转染DNA序列到哺乳动物细胞中,该DNA序列表达时影响凋亡细胞被吞噬的速率,DNA序列例如线虫C.elegansced－6基因。
文档编号C07K16/18GK1305525SQ99807222
公开日2001年7月25日 申请日期1999年6月10日 优先权日1998年6月11日
发明者E·斯米茨, W·M·R·范克里金格, T·A·O·E·波格尔特 申请人:德福根有限公司