专利名称：转录本的分析方法
相关申请本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2003年7月2日提交的美国临时申请60/484，849的优先权。该‘849申请在此处引入作为参考。本申请也是2003年12月19日提交的美国专利申请10/741,193的继续并要求其优先权，其也在此处引入作为参考。
本申请得到由国立卫生研究院的国家癌症研究所提供的合同号为N01-CO-12400的政府资助。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术：
本发明涉及生物检验，微阵列以及生物信息学。
先前获得全长cDNAs需要利用cDNA克隆或5’以及3’RACE方法的精细技术方法。cDNA的产物以及RACE产物任选需要为独特的分子种类(即凝胶上的单一谱带或文库中绝大部分的克隆)。因此，本领域非常需要对全长转录本进行表征的其它方法。
发明概述在本发明的一个方面，高密度阵列与5’以及3’RACE(cDNA末端的快速扩增)或RAGE(基因组DNA的快速扩增)串联检测以及表征转录本或基因组结构。RACE可以是3’或者5’RACE。RACE或RAGE的产物可以利用寡核苷酸探针进行分析，所述探针优选地固定在基质上形成高密度寡核苷酸探针阵列。阵列可能是基因组嵌合阵列，重排阵列及其他适合的阵列。
本发明方法的示范性应用包括1)鉴定转录本的5’以及3’末端的位置(检测以及表征可变的5’以及3’末端)；2)确定全长cDNAs的结构；3)检测以及表征相关转录本的可变剪接同种型；4)确定转录本的链或起点；5)组合多个(＞2)RACE反应发现基因以及以高通量方式表征的能力；6)由PCR扩增RACE反应的产物利用低拷贝数转录本实施上述5个任务的能力；7)检测源自于与另一转录本较远距离开始的转录的转录本(外显子)的结合的能力；以及8)利用基因组DNA作为模板由RACE-类反应鉴定(通过延伸)独特的缺失，易位以及重排。
说明书中包括的并且作为其一部分的附解了本发明的实施方案并且连同
用来解释本发明的原则图1显示了本发明的示范性的分析方法。
图2显示了染色体22上较好表征的基因DGSI的结构。该基因由10个外显子组成并且从右到左(即，5’末端在右侧)转录。
图3显示了染色体22的区域，其中利用RACE以及阵列实验表征新的基因。
发明详述本发明具有许多优选的实施方案，并且依赖于许多专利、申请及本领域技术人员公知的其它参考文献。因此，当引用或在下面重复引用专利、申请或其它参考文献时，应该理解为将其全部引入作为通用的参考以及用于提出所列举的陈述。
I.概要在本申请中，单数形成的“一，”“一个”以及“这个”包括除上下文清楚限定之外的多个参考文献。例如，术语“试剂”包括包含其混合物的多种试剂。
个体不局限于人还可能为其它生物体，包含但不限于哺乳动物、植物、细菌、或来源于任何上述生物体的细胞。
贯穿这个公开，本发明的多个方面可以一个范围的形式出现。应该清楚范围形式的描述仅仅为了方便以及简短起见并且将不会被认为是死板的限制本发明的范围。因此，范围的说明应该被理解为具体地描述了所有可能的子范围以及在那个范围内的单个数值。例如，诸如从1到6的范围描述应该被理解为具有具体公开的子范围，诸如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等等，以及在那个范围内的单个数字，例如，1、2、3、4、5和6。这种理解适用于无论多么宽泛的范围。
本发明的实际应用除非另有陈述可以使用本领域技术人员公知的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包含重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的传统技术和描述。这样的传统技术包含聚合物阵列合成、杂交、连接、和利用标记检测杂交。适用技术的具体说明可以参考下列的实施例。然而，当然还可以使用其它等同的常规程序。这样的传统技术和说明可以在标准实验手册中发现，诸如GenomeAnalysisA Laboratory Manual Series(Vols.I-IV)，Using AntibodiesALaboratory Manual，CellsA Laboratory Manual，PCR PrimerALaboratory Manual，and Molecular CloningA Laboratory Manual(所有都来自Cold Spring Harbor Laboratory Press)，Stryer，L.(1995)Biochemistry(第四版)Freeman，New York，Gai，“Olignonucleotide SynthesisA Practical Approach”1984，IRL Press，London，Nelson and Cox(2000)，Lehninger，Principles of Biochemistry第三版，W.H.Freeman Pub，New York，NY和Berg等人的(2002)Biochemistry，5th Ed.，W H.Freeman Pub.，New York，NY，所有都在此处全部引入作为通用的参考。
本发明可以使用固体基质，包含一些优选实施方案中的阵列。适用于聚合物(包含蛋白质)阵列合成的方法和技术已经描述在下列专利申请中美国专利09/536,841，WO 00/58516，美国专利5,143,854，5,242,974，5,252,743，5,324,633，5,384,261，5,405,783，5,424,186，5,451,683，5,482,867，5,491,074，5,527,681，5,550,215，5,571,639，5,578,832，5,593,839，5,599,695，5,624,711，5,631,734，5,795,716，5,831,070，5,837,832，5,856,101，5,858,659，5,936,324，5,968,740，5,974,164，5,981,185，5,981,956，6,025,601，6,033,860，6,040,193，6,090,555,6,136,269,6,269,846和6,428,752，PCT申请PCT/US99/00730(国际公布号为WO 99/36760)和PCT/US01/04285，其全部引入作为通用的参考。
在具体实施方案中描述合成技术的专利包含美国专利5,412,087，6,147,205，6,262,216，6,310,189，5,889,165和5,959,098。核酸阵列描述在多个上述专利中，但是相同的技术被用于也被描述的多肽阵列。
用于本发明的核酸阵列包含从Affymetrix(Santa Clara，CA)以商品名GeneChip市售获得的产品。示范性阵列显示在affymetrix.com的网址上。本发明还涉及附着于固体基质的聚合物的多个应用。这些应用包含基因表达监控，作图，文库筛选，基因分型和诊断。基因表达监控，和作图的方法显示在下列专利申请中美国专利5,800,992，6,013,449，6,020,135，6,033,860，6,040,138，6,177,248和6,309,822。基因分型和其应用显示在USSN 60/319,253，10/013,598，和美国专利5,856,092，6,300,063，5,858,659，6,284,460，6,361,947，6,368,799和6,333,179中。其它应用概括在美国专利5,871,928,5,902,723,6,045,996，5,541,061和6,197,506中。
本发明在某些优选实施方案中还涉及样品制备方法。在基因分型之前或者同时，基因组样品可以通过多种机理进行扩增，其中一些可以使用PCR。参见，例如PCR TechnologyPrinciples and Applicationsfor DNA Amplification(Ed.H.A.Erlich，Freeman Press，NY，NY，1992)；PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications(Eds Innis，等人，Academic Press，San Diego，CA，1990)；Mattila等人的，Nucleic Acids Res19，4967(1991)；Eckert等人的，PCR Methods and Applications 1，17(1991)；PCR(Eds.McPherson等人，IRL Press，Oxford)；和美国专利4,683,202，4,683,195，4,800,159，4,965,188和5,333,675，并且每个都全部引入作为通用的参考。样品可以在阵列上扩增。参见，例如美国专利6,300,070以及美国专利申请09/513,300，其在此处引入作为参考。
其它合适的扩增方法包含连接酶链式反应(LCR)(例如，Wu和Wallace，Genomics 4，560(1989)，Landegren等人的，Science 241，1077(1988)和Barringer等人的Gene 89117(1990)，转录扩增(Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1173(1989)和WO88/10315)，自动维持的序列扩增(Guatelli等人，Proc Nat.Acad.Sci.USA，87，1874(1990)和WO90/06995，靶聚核苷酸序列的选择性扩增(美国专利6,410,276)，共有序列引物聚合酶链式反应(CD-PCR)(美国专利4,437,975)，任意引物聚合酶链式反应(AP-PCR)(美国专利5,413,909，5,861,245)和基于核酸的序列扩增(NABSA)。(参见美国专利5,409,818，5,554,517和6,063,603，每个都在此处引入作为参考)。其它可以使用的扩增方法描述在美国专利5,242,794，5,494,810，4,988,617以及美国专利09/854,317中，其中每个在此处引入作为参考。
其它的样品制备方法和减少核样品复杂性的技术描述在Dong等人的，Genome Research 11 1418(2001)，美国专利6,361,947，6,391,592和美国专利申请09/916,135，09/920,491，09/910,292，和10/013,598中。进行多核苷酸杂交分析的方法已经在本领域中得到了很好的发展。杂交分析程序和条件将依赖于应用而改变，并且根据已知的常规结合方法进行选择，所述常规结合参考Maniatis等人的分子克隆实验指南(第二版，Cold Spring Harbor，N.Y，1989)；Berger和Kimmel的Methodsin Enzymology，Vol.152，Guide to Molecular CloningTechniques(Academic Press，Inc.San Diego，CA，1987)；Young和Davism，P.N.A.S，801194(1983)。进行重复和控制杂交反应的方法和装置描述在wu美国专利5,871,928，5,874,219，6,045,996和6,386,749，6,391,623中，每个都在此处引入作为参考。
在某些优选实施方案中，本发明还涉及检测配体之间的杂交信号。参见美国专利5,143,854；5,578,832；5,631,734；5,834,758；5,936,324；5,981,956；6,025,601；6,141,096；6,185,030；6,201,639；6,218,803；和6,225,625，美国专利申请60/364,731以及PCT申请PCT/US99/06097(公布为WO 99/47964)，每个都全部引入作为通用的参考。
信号检测以及处理大量数据的方法和装置公开在，例如美国专利5,143,854，5,547,839，5,578,832，5,631,734，5,800,992，5,834,758；5,856,092，5,902,723，5,936,324，5,981,956，6,025,601，6,090,555，6,141,096，6,185,030，6,201,639；6,218,803；和6,225,625中，美国专利申请60/364,731和PCT申请PCT/US99/06097中(
发明者托马斯·R·金杰拉斯, 菲利普·V·卡普拉诺夫 申请人:阿菲梅特里克斯公司