本发明属于生物
技术领域：
：，特别涉及一种psr检测耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素的引物、试剂盒与方法。
背景技术：
：：副溶血弧菌是一种重要的食源性致病菌，人们食用受该菌污染的食物后会引起腹泻、呕吐等症状，甚至导致脱水、休克及死亡。目前，副溶血弧菌引起食物中毒的发生规模呈明显扩大趋势。而耐热直接溶血毒素(thermostabledirecthemolysin，tdh)或耐热相关溶血毒素(thermostablerelatedhemolysin，trh)是副溶血弧菌的毒力因子之一，其毒性最强，可以引起红细胞溶血，破坏细胞膜和溶酶体。目前tdh及trh的检测主要有传统的纸片法，以分子生物技术的pcr方法，还有以免疫学为主的酶联免疫试剂盒检测方法，以及最新出现的基因芯片检测手段。常规检测鉴定方法工作量相对较大，且检测结果耗时长，需要根据实验现象判断鉴定结果，很难满足快速鉴定的需要。近年发展起来的基因芯片检测及pcr扩增方法具有较强的特异性、快速、灵敏，但是成本较高。免疫学检测方法，如elisa，免疫层析等，灵敏度高，但是操作过程复杂，成本偏高，不宜于大规模检测样品。目前应用最广泛的恒温扩增技术(lamp)也有它的局限性，如成本高、耗时长、不稳定和易污染等不足。因此，迫切需要一种新型的快速检测副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素的方法。聚合酶螺旋反应(polymerasespiralreaction，psr)技术与其他核酸扩增技术相比，可以在等温条件下快速、高效、特异地扩增靶序列，且操作简便，不需要精准的变温设备，成本较低，在食源性微生物检测领域显示出广阔的发展前景。要实现有效地利用psr技术，合适的引物设计是研发关键；同时，由于psr一般通过显色直接进行结果判读，显色体系对于整个psr扩增反应结果判读具有重要的影响，而在本领域的研发实践中如何通过简单的显色实现准确、快速的结果判读也是目前亟需攻克的技术难题。因此，建立一种针对耐热直接溶血毒素及耐热相关毒素的新型的具有独立知识产权的等温核酸扩增检测方法具有重要的意义。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种psr检测耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素的引物。本发明的另一目的在于提供一种psr检测耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素的试剂盒。本发明的再一目的在于提供一种psr检测耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素的方法。该方法具有灵敏度高、特异性好，操作简便快速，结果准确可靠，检测成本低，适合现场快速检测应用的特点。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种psr检测耐热直接溶血毒素(thermostabledirecthemolysin，tdh)及耐热相关溶血毒素(thermostablerelatedhemolysin，trh)的引物，包括靶点tdh检测引物ft和bt，以及靶点trh检测引物ft和bt，其核苷酸序列如下所示：靶点tdh检测引物ft：5’-agacctttacattgaccgcttccatctgtcccttttcc-3’(seqidno.1)；靶点tdh检测引物bt：5’-gccagttacatttccagatttagtacctgacgttgtga-3’(seqidno.2)；靶点trh检测引物ft：5’-cgtgaaaaccgattgaccgctgtggcggactattggaca-3’(seqidno.3)；靶点trh检测引物bt：5’-gccagttagccaaaagtgcagaaagagctgccatcgtgt-3’(seqidno.4)。所述的耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素为副溶血性弧菌产生的耐热直接溶血毒素和耐热相关溶血毒素。所述的副溶血性弧菌优选为副溶血性弧菌atcc17802或副溶血性弧菌atcc27969。一种psr检测耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素的试剂盒，包括上述psr检测耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素的引物。所述的psr检测耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素的引物中各引物(靶点tdh检测引物ft和bt，以及靶点trh检测引物ft和bt)的浓度均为50μm。所述的psr检测耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素的试剂盒，还包括如下组分：a、2×反应缓冲液：40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)；b、bstdna聚合酶；c、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。组分b中所述的bstdna聚合酶优选为浓度8u/μl的bstdna聚合酶水溶液。组分c中所述的钙黄绿素和氯化锰的混合溶液的钙黄绿素与氯化锰的浓度比(摩尔比)为1:8。所述的黄绿素和氯化锰的混合溶液优选通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配制终浓度为50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制终浓度为1mm的氯化锰水溶液；(ii)取25μl50μm的钙黄绿素溶液与10μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。所述的psr检测耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素的引物或所述的psr检测耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素的试剂盒在检测副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素和耐热相关溶血毒素中的应用。一种psr检测耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素的方法，为利用如seqidno.1～seqidno.4所示的检测引物进行psr等温扩增反应，检测待检样品中的耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素。所述的psr检测耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素的方法，具体包括如下步骤：(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna，并控制模板dna水溶液的od260/od280值在1.8～2.0范围内；(2)于65℃水浴中保温45～60分钟进行聚合酶螺旋扩增反应；其中，聚合酶螺旋扩增反应体系为26μl反应体系：12.5μl的2×反应缓冲液，50μm的靶点tdh检测引物ft和50μm的靶点tdh检测引物bt各0.8μl，50μm的靶点trh检测引物ft和50μm的靶点trh检测引物bt各0.8μl，dna模板2.0μl，8u/μl的bstdna聚合酶1.0μl，加水补足至25μl；最后加入1μl的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液；(3)待反应完成后于80℃水浴中保温2分钟以终止反应，然后用肉眼观察反应颜色变化，若颜色为黄色或反应体系不变色，说明待检样品中不含有耐热直接溶血毒素和耐热相关溶血毒素；若颜色变为绿色，说明待检样品中含有耐热直接溶血毒素和/或耐热相关溶血毒素。步骤(2)中所述的靶点tdh检测引物ft的核苷酸序列如seqidno.1所示，靶点tdh检测引物bt的核苷酸序列如seqidno.2所示，靶点trh检测引物ft的核苷酸序列如seqidno.3所示，靶点trh检测引物bt的核苷酸序列如seqidno.4所示。步骤(2)中所述的聚合酶螺旋扩增反应的时间优选为60分钟。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本发明提供了一组psr等温扩增反应检测副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素的引物，该引物对于副溶血弧菌耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素均可实现快速、准确的检出，适用性好。(2)本发明提供了一种副溶血性弧菌溶血毒素的聚合酶螺旋检测鉴定体系，解决了现有技术中的方法所需周期长，灵敏度低，成本高，现场快速检测困难等缺陷。(3)本发明构建的检测方法可以通过显色剂对结果直接进行肉眼判读，合适显色体系对整个psr扩增反应结果判读具有重要的影响，本发明使用的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液能够进一步实现对结果的准确、直观的判读。(4)本发明的方法可以将检测时间减少到60分钟，同传统环介导等温扩增技术相比缩短了检测周期，对新型恒温扩增技术扩增的开发及微生物的现场检测具有重要的意义。同时，本发明还公开了针对耐热直接溶血毒素阳性的副溶血弧菌的特异性靶序列tdh及trh保守区的特异区域设计了一对检测引物，从而保证了检测结果的可靠性。其次，本发明在等温条件下扩增，不会因温度的改变而造成时间损失，耗时短，在60分钟就可完成结果判读。此外，该技术不需要昂贵的试剂或精密的仪器控制温度变化，扩增产物的确定不需要凝胶电泳，直接用荧光染料显色可凭肉眼判断结果，操作简便快捷，检测成本较低。本发明的试剂盒及方法特别适用中小型单位及现场检测。附图说明图1为耐热直接溶血毒素阳性的副溶血弧菌聚合酶螺旋反应显色结果图(其中，1：副溶血弧菌atcc27969；2：副溶血弧菌atcc17802；3：ng为阴性对照)。图2为检测靶点tdh特异性实验结果图；其中，图a为检测tdh特异性检测结果，图b为trh特异性检测结果；图中，泳道1：副溶血弧菌atcc27969；泳道2：副溶血弧菌atcc17802；泳道3：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌nctc10442；泳道4：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315；泳道5：沙门氏菌atcc29629；泳道6：沙门氏菌atcc19585；泳道7：沙门氏菌atcc14028；泳道8：沙门氏菌atcc13076；泳道9：沙门氏菌atccatcc12176；泳道10：单增李斯特菌atcc19116；泳道11：单增李斯特菌atcc19114；泳道12：单增李斯特菌atcc19115；泳道13：单增李斯特菌atcc15313；泳道14：单增李斯特菌atcc19113；泳道15：铜绿假单胞菌atcc27853；泳道16：大肠杆菌atcc43895；泳道17：大肠杆菌atcc19115；泳道18：大肠杆菌atcc43894；泳道19：大肠杆菌e019；泳道20：肠杆菌e020；泳道21：肠杆菌e043；泳道22：大肠杆菌e044；泳道23：干酪乳杆菌bm-lc14617；泳道24：阴性对照。图3为靶点tdh及trh灵敏度实验检测结果图；其中，图a为靶点tdh检测结果，图b为靶点trh灵敏度检测结果；图中，泳道1：4.08ng/μl；泳道2：408pg/μl；泳道3：40.8pg/μl；泳道4：4.08pg/μl；泳道5：408fg/μl；泳道6：40.8fg/μl；泳道7：4.08fg/μl；ng为阴性对照。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中所涉及部分菌株已在如下文献中公开。如无特殊说明，相关菌株均可通过市售途径购买得到。[1]zhenboxu,linli,jinchu,brianm.peters.m,meganl.harris,bingli,leishi,marke.shirliff.developmentandapplicationofloop-mediatedisothermalamplificationassaysonrapiddetectionofvarioustypesofstaphylococcistrains.foodresearchinternational.47:166-173,2012.[2]周蓉.低温储藏对肠出血大肠杆菌vbnc状态的诱导及毒素表达量的影响研究[d].华南理工大学,2015.[3]junyanliu,linli,bingli,brianm.peters,yangdeng*,zhenboxu*,marke.shirtliff.theviablebutnonculturablestateinductionandgenomicanalysesoflactobacilluscaseibm-lc14617,abeer-spoilagebacterium.microbiologyopen.2017；e506.实施例1基于聚合酶螺旋反应等温扩增技术检测耐热直接溶血毒素阳性的副溶血弧菌的微生物方法1.设计引物(1)根据psr扩增反应原理，使用primerpremier软件针对tdh靶点分别设计如下所示的引物：靶点tdh检测引物ft：5’-agacctttacattgaccgcttccatctgtcccttttcc-3’(seqidno.1)；靶点tdh检测引物bt：5’-gccagttacatttccagatttagtacctgacgttgtga-3’(seqidno.2)；(2)使用primerpremier软件针对trh靶点分别设计如下所示的引物：靶点trh检测引物ft：5’-cgtgaaaaccgattgaccgctgtggcggactattggaca-3’(seqidno.3)；靶点trh检测引物bt：5’-gccagttagccaaaagtgcagaaagagctgccatcgtgt-3’(seqidno.4)。2.建立聚合酶螺旋反应检测方法(1)反应体系①浓度均为50μm的引物对(tdh检测引物ft和bt，以及靶点trh检测引物ft和bt)组合。②2×反应液：由浓度为40.0mm的tris-hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)tween20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)的混合液组成。③浓度为8u/μl的bstdna聚合酶(bstdnapolymerase,largefragment，购自neb公司)水溶液；④钙黄绿素和氯化锰的混合溶液，其通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜(dmso)中，配置终浓度为50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配置终浓度为1mm的氯化锰水溶液；(ii)取25μl50μm的钙黄绿素溶液与10μl1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液(钙黄绿素溶液与氯化锰溶液的浓度比为1:8)。(2)检测方法①提取待检样品的细菌dna作为模板dna：以副溶血性弧菌atcc27969以及副溶血性弧菌atcc17802两株副溶血弧菌为研究对象，采用dna提取试剂盒(购自广东东盛生物科技有限公司，货号n1152)提取细菌dna。实验步骤按照试剂盒说明书操作，实验组所得细菌dna水溶液的od260/od280值(260nm和280nm下吸光光度比值)为1.8；以去核酸水作为空白对照。②耐热直接溶血毒素的聚合酶螺旋扩增反应：针对靶点tdh及trh，分别在反应管中配置总体积为26μl的聚合酶螺旋扩增反应体系；加入2×反应储液12.5μl，对应的ft与bt等体积混合引物混合液1.6μl(即50μm的靶点tdh检测引物ft和50μm的靶点tdh检测引物bt各0.8μl，50μm的靶点trh检测引物ft和50μm的靶点trh检测引物bt各0.8μl)，8u/μl的bstdna聚合酶1μl，dna模板2.0μl，用去离子水补足体积至25μl。此时各物质浓度为：tris-hcl20.0mm，硫酸铵10.0mm，氯化钾10.0mm，硫酸镁8.0mm，tween200.1％(v/v)，甜菜碱0.7m，dntps(each)1.4mm，bstdna聚合酶8u，靶点tdh检测引物及靶点trh检测引物ft、bt各1.6μm。将反应管置于65℃水浴中保温反应60分钟，再置于80℃水浴中保温2分钟终止反应。③显色检测：待反应结束后，用肉眼观察颜色变化。结果如图1所示，图1a为靶点tdh聚合酶螺旋反应等温扩增反应的显色反应。图1b靶点trh聚合酶螺旋反应等温扩增的显色反应。从图1可知，进行了聚合酶螺旋反应等温扩增反应管1、2均呈现绿色，而阴性对照管ng为黄色，即tdh与trh聚合酶螺旋反应等温扩增反应成功进行，且显色反应实现了肉眼的正确判读。实施例2聚合酶螺旋反应检测溶血性弧菌耐热直接溶血毒素阳性的特异性试验将如下菌株的基因组dna按照实施例1的反应体系和条件建立聚合酶螺旋反应检测方法，进行特异性试验：(1)耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素阳性的副溶血弧菌：副溶血弧菌atcc27969，副溶血弧菌atcc17802。(2)非耐热直接溶血毒素阳性的副溶血弧菌：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌nctc10442[1]，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌n315[1]，沙门氏菌atcc29629，沙门氏菌atcc19585，沙门氏菌atcc14028，沙门氏菌atcc13076，沙门氏菌atcc12176，单增李斯特菌atcc19116，单增李斯特菌atcc19114，单增李斯特菌atcc19115，单增李斯特菌atcc15313，单增李斯特菌atcc19113，铜绿假单胞菌atcc27853，大肠杆菌atcc43895，大肠杆菌atcc19115，大肠杆菌atcc43894，大肠杆菌e019[2]，肠杆菌e020[2]，肠杆菌e043[2]，大肠杆菌e044[2]以及干酪乳杆菌bm-lc14617[3]。设置耐热直接溶血毒素的基因组为阳性对照，超纯水为阴性对照，进行2％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示；其中，图2a为检测tdh特异性检测结果，图2b为trh特异性检测结果。结果表明，只有含有耐热直接溶血毒素和耐热相关溶血毒素阳性的副溶血弧菌出现梯形条带，不含有耐热直接溶血毒素和耐热相关溶血毒素基因的非溶血性弧菌则无扩增条带。说明本发明所设计的引物及构建的检测方法具有较高的特异性。实施例3psr检测耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素的灵敏度试验将耐热直接溶血毒素阳性及耐热相关溶血毒素阳性的副溶血弧菌atcc17802的基因组进行10倍浓度梯度稀释，分别为4.08ng/μl，408pg/μl，40.8pg/μl，4.08pg/μl，408fg/μl，40.8fg/μl，4.08fg/μl，同时设置阴性对照(去离子水)，按照上述实施例1的反应体系构建聚合酶螺旋反应扩增方法，以确定检测方法的灵敏度，结果如图3所示；其中，图3a为靶点tdh检测结果，图3b为靶点trh灵敏度检测结果。结果表明：建立的耐热直接溶血毒素阳性的副溶血弧菌tdh靶点及trh靶点聚合酶螺旋反应方法可检测样品中4.08pg/μl的副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素的副溶血性弧菌基因组dna。从上述实验结果可以看出，聚合酶螺旋反应扩增方法与常规pcr和荧光pcr具有如下优点：(1)操作和鉴定简便快捷：常规pcr整个过程在2～4个小时才能出结果，荧光定量pcr需要1～1.5小时，本发明所提供的检测方法可在60分钟出现阳性结果。其次对仪器要求低，仅需要一个普通水浴锅，并可以通过荧光染料直接判读检测结果，省去了传统的电泳检测步骤。在快速检测及现场检测的实践中有广泛的应用前景。(2)特异性强：仅通过是否扩增就可判断目的基因的存在与否，从而完成了细菌的定性检测。(3)灵敏度高：针对耐热直接溶血毒素阳性的副溶血弧菌tdh及trh检测限为4.08pg/μl是常规pcr的10～100倍左右，具有较高的灵敏度。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南理工大学<120>一种psr检测耐热直接溶血毒素及耐热相关溶血毒素的引物、试剂盒与方法<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>靶点tdh检测引物ft<400>1agacctttacattgaccgcttccatctgtcccttttcc38<210>2<211>38<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>靶点tdh检测引物bt<400>2gccagttacatttccagatttagtacctgacgttgtga38<210>3<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>靶点trh检测引物ft<400>3cgtgaaaaccgattgaccgctgtggcggactattggaca39<210>4<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>靶点trh检测引物bt<400>4gccagttagccaaaagtgcagaaagagctgccatcgtgt39当前第1页12当前第1页12