一种基于DNA混合池检测早胜牛CAPN1基因单核苷酸多态性的方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于dna混合池检测早胜牛capn1基因单核苷酸多态性的方法。

背景技术：

随着分子生物学技术的发展，rapd、rflp、ssr、pcr-sscp等技术已广泛应用于畜禽主要经济性状标记与开发领域，但这些技术在应用过程中都需要进行大样本筛选，工作量大，成本较高。dna混合池作为一种快速高效的检测技术，适用于基因型分型、突变检测、连锁分析、基因定位等，且不同建池方法对snps检测精准度具有一定影响，检测中的反应条件也直接影响试验效果。

早胜牛作为甘肃省陇东地区特有的畜种资源，经过多年改良，较好的继承了秦川牛生长发育快、脂肪沉积好、肉质细嫩的优点，其肉用开发潜力巨大。capn1作为钙蛋白酶基因家族成分之一，是影响肉品质的重要候选基因，与牛肉嫩化、脂肪沉积等过程密切相关。早胜牛capn1基因exon5-exon6区pcr扩增质量及snps检出率与dna混合池紧密相关，但目前并未见关于dna混合池与早胜牛capn1基因扩增质量及snps检出率关系的相关报道，因此，研究筛选出适宜的dna混合池建池方法，能够为进一步开展早胜牛肉用性状关联基因多态位点快速筛查与遗传多样性研究提供参考。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于dna混合池检测早胜牛capn1基因单核苷酸多态性的方法，为进一步开展早胜牛肉用性状关联基因多态位点快速筛查与遗传多样性研究提供参考。

本发明的技术方案是，一种基于dna混合池检测早胜牛capn1基因单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：

(1)以包含capn1基因的待测早胜牛全基因组dna为模板，以引物对p为引物，进行pcr扩增早胜牛capn1基因，扩增区域为exon5-exon6，即3594～4094bp，产物大小500bp，所述引物对p的序列为：

上游引物p1：5′-gctgtggcagtttggtgagtgg-3′，

下游引物p2：5′-tgaggcaaaggacagggt-3′；

(2)构建dna混合池：采用2因子×n水平设计正交试验，以dna混合样本数量和混合后dna终浓度分别为a因子和b因子，所述a因子中按照dna混合样本的数量递增设计a1、a2、a3…an因子，n为试验水平个数，所述a2因子含a1因子个体，a3因子含a1和a2因子个体，an因子含a1、a2、a3…an-1因子个体，以a因子和b因子为组合因子建立dna混合池，以每个dna混合池作为单一模板同时进行3次pcr扩增，扩增产物进行测序分析；采用琼脂糖凝胶电泳检测dna纯度，采用分光光度计检测od260/od280值。

优选地，所述dna混合池为dna混合样本数量150个，dna终浓度100ng/μl。

优选地，所述pcr扩增的反应体系为：总体积25μl，其中2×taqmastermix混合液12μl，上游引物和下游引物浓度均为10pmol/μl各1μl，dna模板浓度为100ng/μl1μl，ddh2o10μl；反应条件：94℃预变性5min，94℃变性50s，65℃退火35s，72℃延伸35s，30个循环，72℃延伸8min，4℃保存。

本发明进一步提供了构建dna混合池的方法在快速筛查早胜牛肉用性状关联基因snps位点的应用。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明采用2因子×3水平试验设计，以dna混合样本数量和dna终浓度为组合因子，分析比较了不同混合池对pcr扩增质量及snps检出率的影响。获得了pcr扩增质量及snps检出率最佳的dna混合池，为进一步开展早胜牛肉用性状关联基因多态位点快速筛查与遗传多样性研究提供参考。

附图说明

图1是本发明实施例提供的不同dna混合池扩增的pcr产物；图中，m：dl2000分子量标准；1～3：分别是a1b3、a2b3、a3b3扩增pcr产物；4～6：分别是a1b2、a2b2、a3b2扩增pcr产物；7～9：分别是a1b1、a2b1、a3b1扩增pcr产物。

图2是本发明实施例提供的a3因子下dna混合池扩增序列多态性测序结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

1、材料与方法

1.1血样采集

采集早胜牛血样150份，均采自庆阳市宁县富春牧业有限责任公司。每头牛颈静脉采血6ml，柠檬酸葡萄糖抗凝后，于-20℃保存备用。

1.2主要试剂

d3392-01型血液dna提取试剂盒购自omegabiotek公司，2×taqmastermix混合液、dl2000marker购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.3引物设计与pcr扩增

根据普通牛capn1基因核苷酸序列(genbankid：ah009246)，应用prime5.0软件设计特异性引物，由北京天一辉远生物科技有限公司合成。引物对p的序列为：

上游引物p1：5′-gctgtggcagtttggtgagtgg-3′，

下游引物p2：5′-tgaggcaaaggacagggt-3′；

以包含capn1基因的待测早胜牛全基因组dna为模板，以引物对p为引物，进行pcr扩增早胜牛capn1基因，扩增区域为exon5-exon6，即3594～4094bp，产物大小500bp。

pcr扩增的反应体系为：总体积25μl，其中2×taqmastermix混合液12μl，上游引物和下游引物浓度均为10pmol/μl各1μl，dna模板浓度为100ng/μl1μl，ddh2o10μl；反应条件：94℃预变性5min，94℃变性50s，65℃退火35s，72℃延伸35s，30个循环，72℃延伸8min，4℃保存。采用琼脂糖凝胶电泳检测dna纯度，采用分光光度计检测od260/od280值。

1.4构建dna混合池及测序分析

以dna混合样本数量和混合后dna终浓度为2因子，dna混合样本数量设计3种，采用2因子×3水平正交试验设计，分别建立9种dna混合池，如表1所示，为提高试验数据可靠性和减少统计误差，每个dna混合池设3个重复，以每个重复dna混合池为单一模板同时进行3次pcr扩增，以3次pcr扩增产物作为pcr扩增效果的评价依据。

表1不同dna混合池

表1中，dna混合样本数量记为a因子，混合后dna终浓度记为b因子，a因子分别为a1(20个)、a2(60个)、a3(150个)，且a2因子含a1因子个体，a3因子含a1和a2因子个体。经检测合格的pcr产物取5μl，送至北京天一辉远生物科技有限公司测序，应用dnaman7.0软件比对分析序列变异情况。

2、结果与分析

2.1不同dna混合池对pcr扩增质量的影响

pcr扩增产物的结果如图1所示，检测发现，在b1因子(dna终浓度50ng/μl)水平下，pcr扩增产物a1b1、a2b1、a3b1条带较亮，od260/od280值依次为1.6、1.6、1.7；在b2因子(dna终浓度100ng/μl)水平下，a1b2、a2b2、a3b2条带清晰，且大小与目的片段大小一致，od260/od280值分别为1.9、2.0、1.9；在b3因子(dna终浓度150ng/μl)水平下，a1b3、a2b3、a3b3出现非特异性片段。

2.2不同dna混合池对snps检出率的影响

对不同dna混合池扩增的pcr产物直接测序，测序结果表明，在a1因子(dna混合样本20个)水平下，a1b1、a1b2均在4085bp处检测到c-t的单碱基突变；在a2因子(dna混合样本60个)水平下，a2b1、a2b2均在4091bp、4093bp处发生c-g、t-c的单碱基突变；a3b1和a3b2的dna混合池扩增的pcr产物直接测序结果如图2所示，图2a为cspn1基因核苷酸原序列图，图2b为a3因子下dna混合池扩增的pcr产物序列图。由图2可知，在a3因子(dna混合样本150个)水平下，a3b1、a3b2均在4085bp、4090bp、4091bp、4093bp、4094bp处发生c-t、g-t、c-g、t-c、c-t的单碱基突变。因a1b3、a2b3、a3b3扩增的pcr产物杂带较多，不符合试验要求。

2.3结论

在同一dna混合样本数量下，以100ng/μl终浓度建立的dna混合池，扩增的pcr产物条带纯度和od260/od280值均优于50ng/μl终浓度，但对测序结果无显著影响；以150ng/μl样本浓度建立的dna混合池，由于模板dna浓度过大，导致pcr扩增反应中错配机率增加，从而出现非特异性片段，不符合试验要求，未进行测序分析。表明在适宜的样本终浓度范围下，dna混合池对样本混合数量依赖性较低，少到几十个、多则几百个不等。在同一dna混合样本终浓度下，以20个样本建立的dna混合池，在capn1基因exon5-exon6区检测到1处单碱基突变；以60个和150个样本建立的dna混合池，分别检测到2处和5处单碱基突变；说明混合池样本数量越多，更能准确筛选突变样本，snps检出率越高。综上，从pcr扩增质量、snps检出率和实验成本来分析，在本实验条件下，以150个混合样本和100ng/μl终浓度为组合建立的dna混合池效果最好。

应用本研究建立的dna混合池法，可快速筛查影响早胜牛肉用性状关联基因snps位点，从而确定优势基因型，对早期选留优良个体开展选种选配具有重要意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。