瓜类细菌性果斑病菌与叶斑病菌的双重PCR检测引物及检测方法与流程

本发明属于农业科学技术领域，具体涉及瓜类细菌性果斑病菌与叶斑病菌的双重pcr检测引物及检测方法。

背景技术：

瓜类细菌性果斑病(bacterialfruitblotch，bfb)的病原为西瓜嗜酸菌(acidovoraxcitrulli)(简称a.citrulli)，是西甜瓜等葫芦科作物上重要的细菌性病害，是一种重要的检疫性病害。该病害是一种典型的种传病害，能导致作物的叶片、果实和种子带病，严重影响果实的品质和质量，甚至带来毁灭性灾害。上世纪90年代，首次在我国报道发生，随后新疆、海南等多地有报道发生。

瓜类细菌性叶斑病的病原为丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)(简称p.syringae)，也是西甜瓜上一种重要的细菌性病害，或被称为叶枯病，属于非检疫性病害。李亚利等2004年，在甘肃、新疆等发现的与果斑病症状非常类似的细菌性病害，发生率为30-100％，后检测出引起病害的病原是p.syringaepv.lacharymans(smith&bryan1915)。

这两种病害在西甜瓜生产的苗期、成株期、挂果期及收获期均能引起病害，严重威胁葫芦科产业发展，且两种病害引起的病害症状十分相似，肉眼难于辨别，亟待寻找一种快速、简便方法来区分这两种细菌性病害。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供瓜类细菌性果斑病菌与叶斑病菌的双重pcr检测引物及检测方法，实现一次性pcr扩增就能对田间症状易混淆的瓜类细菌性果斑病与叶斑病样品进行鉴别与诊断，且该检测方法具有快速、简便、高效、特异性强等特点。

为达到上述目的，本发明的技术方案是：

本发明利用生物信息学方法在瓜类细菌性果斑病菌与叶斑病菌各自的全基因组中寻找特异基因，根据特异核苷酸序列设计了这两种病害特异性的双重pcr检测引物，建立了这两种病害的可靠的双重pcr检测方法。

本发明所述瓜类细菌性果斑病菌与叶斑病菌的双重pcr检测引物，其包括瓜类细菌性果斑病菌检测引物对ac12m-534和瓜类细菌性叶斑病菌检测引物对psh-254，其中，引物对ac12m-534包括引物ac12m-534f和引物ac12m-534r，具体核苷酸序列如下：

引物ac12m-534f：5'-cgatgcctatgcccgtttct-3'；

引物ac12m-534r：5'-tccgcgatccagccttctt-3'；

引物对psh-254包括引物psh-254f和引物psh-254r，具体核苷酸序列如下：

引物psh-254f：5'-atgaacactaaatacrctcgtacg-3'；

引物psh-254r：5'-tactgtarcgcggtaaaaccg-3'。

进一步，所述瓜类细菌性果斑病菌检测引物对ac12m-534的pcr扩增产物大小为534bp，所述瓜类细菌性叶斑病菌检测引物对psh-254的pcr扩增产物大小为254bp。

本发明还提供上述瓜类细菌性果斑病菌与叶斑病菌的双重pcr检测引物在同时检测瓜类细菌性果斑病菌与叶斑病菌中的应用，以及在制备同时检测瓜类细菌性果斑病菌与叶斑病菌的检测试剂盒中的应用。

再，本发明还提供了利用上述双重pcr检测引物进行双重pcr检测的方法，包括如下步骤：

1)提取待测样品dna或在待测样品中加入无菌水，充分研磨制得待测样品研磨汁液；

2)以待测样品dna或待测样品研磨汁液为模板、利用引物ac12m-534f、引物ac12m-534r、引物psh-254f、引物psh-254r进行双重pcr扩增；

3)扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测及判断

pcr反应终止后，取5μlpcr产物，用1％琼脂糖电泳检测扩增结果：扩增得到534bp大小产物则判定为待测样品中检测出瓜类细菌性果斑病菌，扩增得到254bp大小产物则判定为待测样品中检测出细菌性叶斑病菌。

进一步，步骤1)中，所述待测样品为植物叶片或果实等植物组织。

再，步骤2)中，所述双重pcr扩增的pcr反应体系为：taqmastermix10.0μl，10μm引物ac12m-534f、10μm引物ac12m-534r、10μm引物psh-254f和10μm引物psh-254r各0.5μl，模板1.0μl，无菌去离子水补足至20.0μl；pcr反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性20s，54-61.3℃退火20s，72℃延伸30s，运行30个循环；72℃延伸5min。

本发明所设计的瓜类细菌性果斑病菌检测引物对ac12m-534和瓜类细菌性叶斑病菌检测引物对psh-254也可分别用于单重pcr扩增以分别检测瓜类细菌性果斑病、瓜类细菌性叶斑病，具体单重pcr扩增方法如下：按常规提取植物dna方法或制备待测样品研磨汁液，将待测样品dna或待测样品研磨汁液为待测模板dna，分别按照表1或表2的pcr体系和如下pcr反应条件进行瓜类细菌性果斑病菌单重pcr扩增、或瓜类细菌性叶斑病菌单重pcr扩增。

表1

表2

pcr反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性20s，54-61.3℃退火20s，72℃延伸30s，运行30个循环；72℃延伸5min。

本发明中，所述瓜类细菌性果斑病菌单重pcr扩增终止后，取5μlpcr产物，用1％琼脂糖电泳检测扩增结果：扩增得到534bp大小产物则判定为待测样品中检测出瓜类细菌性果斑病菌。

本发明中，所述瓜类细菌性叶斑病菌单重pcr扩增终止后，取5μlpcr产物，用1％琼脂糖电泳检测扩增结果：扩增得到254bp大小产物则判定为待测样品中检测出细菌性叶斑病菌。

本发明根据a.citrulli和p.syringae的全基因组序列，与ncib的nr数据库进行blast，分析获得各自的特异性序列。再根据获得的瓜类细菌性果斑病菌和细菌性叶斑病菌的特异基因序列，设计了两对可特异性扩增目的基因的专用引物，建立了瓜类细菌性果斑病菌和叶斑病菌的双重pcr检测方法，克服了当前仅采用一种pcr进行检测不能全面掌握病原种类，从而无法正确指导农业生产的不足。

本发明的有益效果：

灵敏度高：本发明设计的引物对ac12m-534对瓜类细菌性果斑病菌的检测灵敏度达到2.5×10⁴cfu/ml，引物对psh-254对瓜类细菌性叶斑病菌的检测灵敏度达到2.5×10⁶cfu/ml，两引物对进行双重pcr时检测灵敏度达到2.5×10⁷cfu/ml，且无需提取dna。

特异性好：本发明设计的引物对ac12m-534和引物对psh-254可直接对待测样品的研磨汁液进行pcr检测，该pcr检测方法中模板无需提取dna，不受植物组织影响，特异性好。

本发明建立了一种快速鉴别瓜类细菌性果斑病菌和细菌性叶斑病菌的双重pcr检测方法，实现了一次性pcr扩增就能对田间症状易混淆的瓜类细菌性果斑病与瓜类细菌性叶斑病样品进行鉴别与诊断，可为单独或混合感染的病原快速、准确诊断及大规模流行病学调查提供有效方法，从而迅速区分检疫性细菌病害与普通细菌性病害，省时省力省钱，是一种快速、特异性好、灵敏性高的检测方法，对检疫性病害的控制具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1在不同退火温度下pcr扩增效果图之只扩增a.citrulli，其中：m为2kplusⅱmarker，第1-8列退火温度为：54.0℃、54.8℃、56.3℃、58.6℃、61.3℃、63.6℃、65.1℃、66.0℃。

图2为本发明实施例1在不同退火温度下pcr扩增效果图之只扩增p.syringae，其中：m为2kplusⅱmarker，第1-8列退火温度为：54.0℃、54.8℃、56.3℃、58.6℃、61.3℃、63.6℃、65.1℃、66.0℃。

图3为本发明实施例1在不同退火温度下pcr扩增效果图之同时扩增两种病原菌，其中：m为2kplusⅱmarker，第1-8列退火温度为：54.0℃、54.8℃、56.3℃、58.6℃、61.3℃、63.6℃、65.1℃、66.0℃。

图4为本发明实施例2对两种瓜类细菌性病害的病原菌pcr扩增的引物特异性检测图，其中：m为2kplusⅱmarker；第1-15列的dna样品分别为erwiniacarotovora(大白菜软腐病)，e.chrysanthemi(水稻基腐病)，microbacteriumarborescens(树状微杆菌)，ochrobactrumsp.(苍白杆菌)，pantoeasp.(泛菌)，xanthomonassp.(黄单胞菌)，escherichiacoli(大肠杆菌)，agrobacteriumsp.(农杆菌)，acinetobactersp.(不动杆菌)，curtobacteriumflaccumfaciens(萎蔫短小杆菌)，xanthomonasoryzae(水稻黄单胞菌)，p.fluorescens(荧光假单胞菌)，p.putida(恶臭假单胞菌)，p.punonensis(假单胞菌)，p.argentinensis(阿根廷假单胞菌)；16-17：p.syringae；18-19：a.citrulli；20-21：p.syringae+a.citrulli；22:健康甜瓜叶片dna，23：ddh2o对照；a为特异性检测图，b为16s引物扩增图。

图5为本发明实施例3的两对引物对的pcr扩增灵敏度检测图之a.citrulli扩增图，其中：m为2kplusⅱmarker；1-7为浓度为2.5×10⁹-2.5×10³cfu/ml的a.citrulli菌液；nc为阴性对照。

图6为本发明实施例3的两对引物对的pcr扩增灵敏度检测图之p.syringae扩增图，其中：m为2kplusⅱmarker；1-7为浓度为2.5×10⁹-2.5×10³cfu/ml的p.syringae菌液；nc为阴性对照。

图7为本发明实施例3的两对引物对的pcr扩增灵敏度检测图之p.syringae+a.citrulli扩增图，其中：m为2kplusⅱmarker；1-7为浓度为2.5×10⁹-2.5×10³cfu/ml的a.citrulli+p.syringae的菌液；nc为阴性对照。

图8为本发明实例4的人工接种的瓜类细菌性果斑病和叶斑病样品的pcr检测图，其中：m为2kplusⅱmarker；1-4为接种p.syringae甜瓜样品；5-8为接种a.citrulli甜瓜样品；9为p.syringae阳性对照；10为a.citrulli阳性对照；11为p.syringae+a.citrulli阳性对照；12为健康甜瓜汁液；13为无菌水对照。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1特异性引物退火温度试验

1)本研究组分离纯化的瓜类细菌性果斑病菌和叶斑病菌，按常规方法提取dna备用；

2)将引物对ac12m-534及psh-254分别配置成浓度为10μm的溶液；

3)以提取的dna为模板进行pcr检测：

pcr反应体系为：2×taqmastermix10.0μl，10μm引物ac12m-534f、引物ac12m-534r、引物psh-254f和引物psh-254r各0.5μl，模板1.0μl，无菌去离子水补足至20.0μl；pcr反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性20s，54-66℃退火20s，72℃延伸30s，运行30个循环；72℃延伸5min。

分别以瓜类细菌性果斑病菌dna、瓜类细菌性叶斑病菌dna、瓜类细菌性果斑病菌dna+瓜类细菌性叶斑病菌dna为模板，在退火温度分别为54.0℃、54.8℃、56.3℃、58.6℃、61.3℃、63.6℃、65.1℃、66.0℃下进行pcr扩增，pcr扩增结果如图1-图3所示。

由图1可知，退火温度在54-66℃时，出现534bp的特异性片段，扩增效率良好。

由图2可知，退火温度在54-61.3℃时，出现254bp的特异性片段，退火温度在63.3-66℃时，扩增得不到254bp的特异性片段。

由图3可知，退火温度在54-61.3℃时，出现534bp和254bp的特异性片段，退火温度在63.3-66℃时，254bp片段开始模糊，不适合双重pcr检测。

试验表明：退火温度在54-61.3℃时，引物对ac12m-534及psh-254有较好的扩增效率，适合单独pcr反应和双重pcr反应。

实施例2两种瓜类细菌性病害病原菌pcr检测引物的特异性试验

1)本研究组纯化的瓜类细菌性果斑病菌和叶斑病菌及其他各参考细菌，按常规方法提取dna备用；

2)将引物对ac12m-534及psh-254分别配置成浓度为10μm的溶液；

3)以提取的dna为模板进行pcr检测：

dna模板分别来自参考细菌：erwiniacarotovora，e.chrysanthemi，microbacteriumarborescens，ochrobactrumsp.，pantoeasp.，xanthomonassp.，escherichiacoli，agrobacteriumsp.，acinetobactersp.，curtobacteriumflaccumfaciens，xanthomonasoryzae.，p.fluorescens，p.putida，p.punonensis，p.argentinensis，以及p.syringae，a.citrulli，p.syringae+a.citrulli。

pcr反应体系为：2×taqmastermix10.0μl，10μm引物ac12m-534f、10μmac12m-534r、10μmpsh-254f和10μmpsh-254r各0.5μl，模板1.0μl，无菌去离子水补足至20.0μl；pcr反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s，运行30个循环；72℃延伸5min。

pcr扩增终止后，取5μlpcr产物，用1％琼脂糖电泳检测扩增结果，pcr扩增检测图参见图4。

由图4b可知，这些真菌dna都能被通用引物its1/its4所扩增出来，说明dna质量良好。

由图4a可知，样品1-15的pcr扩增产物中无534bp和254bp的特异性片段出现，样品16-17的pcr扩增产物中出现534bp的特异性片段，样品18-19的pcr扩增产物中出现254bp的特异性片段，样品20-21的pcr扩增产物中同时出现534bp和254bp的特异性片段。

试验表明：本发明设计的引物对ac12m-534及psh-254对各自的目标病原菌均可以进行特异扩增，对用于其他参考细菌无特异性扩增，因此，引物对ac12m-534及引物对psh-254可用于对瓜类细菌性果斑病菌和叶斑病菌的检测。

实施例3两种瓜类细菌性病害的病原菌pcr检测引物的灵敏度试验

1)本研究组纯化的瓜类细菌性果斑病菌和叶斑病病菌，培养后用无菌水配制成2.5×10⁹-2.5×10³cfu/ml的菌液悬浮液；

2)将引物对ac12m-534及psh-254分别配置成浓度为10μm的溶液；

3)以步骤1)制备的菌液悬浮液为模板进行pcr检测，pcr反应体系为：2×taqmastermix10.0μl，10μm引物ac12m-534f、10μm引物ac12m-534r、10μm引物psh-254f和10μm引物psh-254r各0.5μl，模板1.0μl，无菌去离子水补足至20.0μl；pcr反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s，运行30个循环；72℃延伸5min。

pcr扩增终止后，取5μlpcr产物，用1％琼脂糖电泳检测扩增结果，pcr扩增检测图参见图5-图7。

由图5可知，浓度2.5×10⁹-2.5×10⁴cfu/ml的瓜类细菌性果斑病菌的悬浮液中吸取1μl能特异的扩增出534bp大小的条带。

由图6可知，2.5×10⁹-2.5×10⁶cfu/ml的瓜类细菌性果斑病菌的悬浮液中吸取1μl能特异的扩增出254bp大小的条带。

由图7可知，2.5×10⁹-2.5×10⁷cfu/ml的瓜类细菌性果斑病菌的悬浮液中吸取1μl能特异的扩增出534bp和254bp大小的条带。

试验表明：本发明中的ac12m-534引物对瓜类细菌性果斑病菌的检测灵敏度达到2.5×10⁴cfu/ml，psh-254引物对检测瓜类细菌性叶斑病菌的检测灵敏度达到2.5×10⁶cfu/ml，两对引物进行双重pcr时检测灵敏度达到2.5×10⁷cfu/ml，可用于对菌液的pcr检测和双重pcr检测，无需提取dna。

实施例4瓜类细菌性果斑病和叶斑病病样的特异性检测

1)本研究组纯化的瓜类细菌性果斑病菌和叶斑病病菌接种感病甜瓜植株，植株发病后采集有症状叶片，按质量体积比1:10比例，在病叶组织中加入无菌水，充分研磨，得到研磨汁液；

2)将引物对ac12m-534(引物ac12m-534f和引物ac12m-534r)及引物对psh-254(引物psh-254f和引物psh-254r)分别配置成浓度为10μm的溶液；

3)以样品研磨汁液为模板进行pcr检测：

pcr反应体系为：2×taqmastermix10.0μl，10μm引物ac12m-534f、10μm引物ac12m-534r、10μm引物psh-254f和10μm引物psh-254r各0.5μl，模板1.0μl，无菌去离子水补足至20.0μl；pcr反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s，运行30个循环；72℃延伸5min。

图8为人工接种的瓜类细菌性果斑病和叶斑病样品的pcr检测图，由图8可知，样品1-4的pcr扩增产物中出现254bp的特异性片段，样品5-8的pcr扩增产物中出现534bp的特异性片段，样品11的pcr扩增产物中同时出现254bp和534bp的特异性片段，可见本发明提供的双重pcr方法对接种的瓜类细菌性果斑病和叶斑病的pcr都能扩增出相应大小的片段，能方便的用于直接对病害样品的检测。

试验表明：本发明中的ac12m-534引物对和psh-254引物对及pcr检测方法能用于感病叶片研磨汁液的直接检测，无需提取dna，且特异性好，不受植物组织影响，是一种快速、便捷的检测方法。