一种抑制番茄细菌性叶斑病菌生长的化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及化合物的新用途，阐明药物化学结构与细菌的生物活性之间的关系， 更具体的说，是探索化合物对番茄细菌性叶斑病菌的抑菌和杀菌活性。
【背景技术】
[0002] 中国成为继美国、意大利之后世界第=个番茄酱生产及出口大国。2003年1至10 月，新疆生产建设兵团加工番茄酱20万吨，向欧洲、美洲20多个国家出口 6. 14万吨，已占 欧洲市场份额的70%。因此，我国已发展成为世界几个主要种植大国之一。然而，近年来我 国新疆、甘肃发生一种新的病害一一细菌性叶斑病，危害逐年加重，使其产量和品质都受到 极大影响，严重威胁番茄生产。该病害一般发生率在30~40%，严重者达80%，甚至造成全田 绝收，其病原菌不仅侵染叶片，造成叶部大面积焦枯、抑制植株的正常生长发育，同时还可 侵染茎蔓和果实，使果面产生大小不等的斑点，导致果实内部腐烂，极大的影响了番茄的产 量、外销和胆藏，常造成严重的减产。
[0003] 番茄细菌性叶斑病亦称番茄细菌性斑点病或斑疹病，是一种细菌性病害。对于该 病，国外尤其是美国，研究工作开展较早，工作也较深入，已经完成了病原菌鉴定，小种划分 及小种的分布与变异等工作。目前，他们正对世界各地的病原菌进行基因分析，并应用分子 生物学技术对作物抗病性和病原菌致病性进行研究。
[0004] 国内作为检疫对象，对该病的研究一直较少。1991年，报道该病在东北、内蒙古、山 西和北京等地区不断发生和蔓延，造成很大损失。该病在日本、美国、澳大利亚、保加利亚、 原苏联、加拿大及南美等国家和地区都有发生。40年代，±耳其、W色列、希腊、南部非洲、古 己及智利等国家和地区都把该病作为检疫对象。然而后来，该病在运些国家中也迅速蔓延 开来。
[0005] 1939年的报道，番茄、辣椒、曼巧罗、天仙子、构杞、黄花烟草都是该病原菌寄主，后 又报道龙葵、马铃馨等也是其寄主。然而，斑点菌在生产上主要为害番茄和辣椒，包括幼苗、 叶片、茎和果实等。病斑周围有黄色晕圈，是叶组织分泌乙締造成的，最初产生典型水溃斑。 在美国佛罗里达，平均每年所造成的经济损失在10%W上，重者可达100%。而国内病区， 平均每年减产20% -30%。
[0006] 种子带菌是最主要的初侵染来源。该病主要随大风大雨传播引起流行，同时在大 雾结露的情况下，也可造成大发生。所W在佛罗里达，随着雨季的到来往往引起季节性大流 行。据报道，在田间，只要最初有10%的植株发病，就为整块田发病提供了足够的菌量。细 菌一般经由伤口或者气孔入侵叶片。据文献报道，叶表皮的破坏、叶毛擦伤W及细胞间充水 过多都能加重病情。
【发明内容】
[0007] 本发明采用体外抗菌试验，研究化合物对番茄细菌性叶斑病菌的生物活性。
[0008] 本发明的具体技术方案如下： 本发明的创新点是发现化合物对番茄细菌性叶斑病菌有良好的抑菌和杀菌活性，并测 量得到其最小抑菌浓度MIC值和最小杀菌浓度MBC值，属于首次公开。
[0009] 所述化合物结构特征如下式所示：
【具体实施方式】
[0010] 下面结合具体实施实例，进一步详细地说明本发明。应理解下面实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明范围。
[0011] 实施实例1 测量最小抑菌浓度MIC值。
[0012] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000血蒸馈水即得。使用前12rc高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0013] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加lOOOmL蒸馈水即得。使用前 12rC高压蒸汽灭菌20min待用。
[0014] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基lOmU放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养2地，培养溫度为28°C。
[0015] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，采用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将W上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50y以均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养2地，培养溫度为28°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
[0016] 计算公式为：菌液浓度=nX20XlOOcfu/mL (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0017] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小抑菌浓度MIC(MinimalInhibitoiTConcentration)。MIC为最小抑菌浓度，即药物 与一定浓度的菌液作用后，能够抑制可见菌生长的最低浓度。
[0018] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256 ^邑/111以在96孔板上1~10行，每孔加lOOyL不同浓度的药液和lOOyL 菌液，使最终菌液浓度为1~5X105c化/mU第11行W无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第 12行W不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28°C培养2地，W肉眼观察药物最 低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC,每个实验重复=次。
[0019] 测得最小抑菌浓度MIC值为64yg/血。
[0020] 实施实例2 测量最小杀菌浓度MBC值。
[0021] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000血蒸馈水即得。使用前12rc高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0022] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加lOOOmL蒸馈水即得。使用前 12rC高压蒸汽灭菌20min待用。
[0023] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基lOmU放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养溫度为28°C。
[0024] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，采用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将W上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50y以均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养2地，培养溫度为28°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数；计算公式为：菌液浓 度=nX20XlOOcfu/mL。
[00巧](5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存 放于4°C冰箱保存待用。 阳0%] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小杀菌浓度MBC(MinimalBactericidalConcentration)。在MIC基础上，从每管吸取 10化溶液，点于固体培养基上，继续按MIC培养条件下培养，W完全杀灭细菌的最低浓度 为最小杀菌浓度(菌落数小于等于5)。
[0027] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256 ^邑/111以在96孔板上1~10行，每孔加lOOyL不同浓度的药液和lOOyL菌液，使最终菌液浓度为1~5X105c化/111以第11行W无菌生理盐水加菌液作为阳性对照， 第12行W不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28°C培养2地，W肉眼观察药物 最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC。将上述未见生长细菌的各孔中的肉汤取 10化接种于营养琼脂平板上，做好标记，于28°C培养2也W仍无细菌生长的管内药物浓 度记为该药的MBC，每个实验重复S次。 阳02引测得最小杀菌浓度MBC值为128yg/血。
【主权项】
1. 一种抑制番茄细菌性叶斑病菌生长的化合物，其特征在于： (1) 结构特征如下式所示：(2) 其可作为番茄细菌性叶斑病菌的抑制剂和杀菌剂； (3) 其对番茄细菌性叶斑病菌的最小抑菌浓度MIC值为64yg/mL; (4) 其对番茄细菌性叶斑病菌的最小杀菌浓度MBC值为128yg/mL。
【专利摘要】本发明发现对番茄细菌性叶斑病菌具有抑菌和杀菌活性的化合物。其番茄细菌性叶斑病菌的最小抑菌浓度MIC值为64μg/mL，最小杀菌浓度MBC值为128μg/mL。
【IPC分类】A01N43/86, A01P1/00
【公开号】CN105211077
【申请号】CN201510722703
【发明人】不公告发明人
【申请人】许自协
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月31日