一种副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法

专利名称：：一种副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法一种副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法和应用
技术领域：
：本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法和应用。
背景技术：
：副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)是兼性厌氧的革兰氏阴性嗜盐菌，普遍存在于近海岸海水和海产食物中，根据致病性可分为致病菌和非致病菌。致病性菌是造成美国，日本，中国以及很多沿海地区腹泻和食物中毒的首要病原菌。环境中菌株95%为非致病菌，5%为致病菌。我国每年经上海口岸进出口的海产品达13万吨，总值2.26亿美元。如果仅根据副溶血性弧菌的检出作为关口控制标准，将无法进行正常海产品进出口贸易。因此需要建立准确鉴定其中5%致病性副溶血性弧菌的方法作为关口控制海产品质量，保障食品安全的检疫技术手段。致病性副溶血性弧菌的毒力因子目前已知的主要是溶血毒素，包括耐热性溶血毒素(Thermostabledirecthemolysin,TDH)和耐热性溶血毒素相关的溶血毒素(TDHrelated-hemolysin,TRH)。TDH由tdh基因编码，现有检测TDH或tdh的方法主要有胶乳凝集试验(KAP-RPLA)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，聚合酶链式反应(PCR)，tdhDNA杂交等。免疫学检测方法无法检测出环境或临床分离的因环境，代谢改变而暂无TDH表达或表达量较低的致病性副溶血性弧菌；普通PCR法及DNA杂交法不能测定tdh基因的表达量，因此难于对致病性进行定量分析。我们希望建立一个可以测定tdh基因拷贝水平的实时荧光定量PCR反应体系以定量反映副溶血性弧菌的致病能力。以此为依据作为区分致病性和非致病性副溶血性弧菌的现场检测的一个快速高效的方法。副溶血性弧菌在我妻氏培养基(Wagatsumabloodagar)上37°C培养18-24小时后菌落周围呈现出的透明0溶血环称为神奈川现象(KanagawaPhenomenomKP)，无透明溶血环或无明显溶血为KP—，曾据此将副溶血性弧菌区分为致病性和非致病性菌株，但神奈川溶血反应在多种实践环境中反应不典型，不易判断结果。一些(16%)KPlfiTDH+的副溶血性弧菌或KP—且TDH—却可检出tdh基因的副溶血性弧菌也有致病性。因此tdh基因比KP反应更适宜作为副溶血性弧菌的致病性标志物。Nishibuchi认为tdh基因低表达可能是副溶血性弧菌携带tdh基因但KP_的原因，定量tdh基因的表达水平是对神奈川现象的重要修正。此外，TRH作为一种溶血因子，也被视为副溶血性弧菌主要的致病因子之一，但是检出率远小于TDH的检出率，其编码基因trh可被纳入为第二个致病性标志基因；不耐热溶血毒素(Thermolabilehemolysin,TLH)虽然可以表征副溶血性弧菌的种属特异性，但不是副溶血性弧菌主要的毒力因子，因此由该基因表达产物形成的KP阳性菌株不代表该菌株的致病性。目前，对于细菌的检测通常使用荧光定量PCR技术。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中，通常以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光闽值的缺省设置是6-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，而将每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数设为Ct值。研究表明，每个模板的ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量PCR扩增过程中在加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针，目前常用的为Taqman荧光探针，该探针为寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光；在PCR扩增过程中，Taq酶的5’_3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。每个循环过程结束检测一次荧光强度，反应结束后，便可得到一条工作曲线。中国专利文献CN101038254公开了“一种检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒”，该试剂盒能快速准确地检测出常见的多种致病曲霉菌，用于临床诊断侵袭性曲霉菌感染具有很好的敏感度和特异度。中国专利文献CN1680597公开了“一种用于定量检测丙型肝炎病毒(HCV)的荧光定量PCR试剂盒”。但是，关于副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测试剂盒和检测方法未见报道。
发明内容本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测试剂盒。本发明的再一的目的是，提供一种副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测方法。本发明的另一的目的是，提供副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测试剂盒的用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测试剂盒，包括dNTP混合物、PCR反应液、探针、扩增引物，所述探针的序列为5，-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3，(见SEQIDNO1所示)所述扩增引物，正向序列为5，-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3，(见SEQIDNO2所示)，反向序列为5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3，(见SEQIDNO3所示)。所述探针5，-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3，的位置在517-541bp处，所述扩增引物，正向序列5’-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3，的位置在467-487bp处，反向序列5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3，的位置在571_551bp处为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是一种副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤(a)、细菌复苏(b)、副溶血性弧菌0D_值的测定和相差显微镜下绝对计数4(c)、细菌基因组DNA的定量提取(d)、引物和探针设计(e)、tdh基因扩增(f)、定量tdh基因标准DNA模板的制备(g)、实时荧光定量PCR反应。所述，步骤(d)中的探针序列为5，-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3，(见SEQIDNO1所示)所述扩增引物，正向序列为5，-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3，(见SEQIDNO2所示)，反向序列为5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3，(见SEQIDNO3所不)。所述探针5，-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3，的位置在517-541bp处，所述扩增引物，正向序列5’-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3，的位置在467-487bp处，反向序列5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3，的位置在571_551bp处。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测试剂盒在制备检测致病副溶血性弧菌性疾病药物中的应用。副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测试剂盒在出入境海产品的检疫质量控制中的应用。本发明优点在于本发明建立了快速检测副溶血性弧菌tdh基因的real-timePCR方法，可做为副溶血性弧菌致病性评判体系的方法之一，用于对出入境海产品的检疫质量控制。试验中我们建立了用副溶血性弧菌0D_值计算菌群绝对数量浓度的公式，可替代繁琐的显微镜下计数法，简化了定量时间。根据real-timePCR的定量结果与绝对计数可计算得到菌群中tdh基因的平均拷贝水平，可反映菌体中TDH的可能表达水平。测定的17株试验菌中其tdh拷贝水平各不相同，对判断各菌株的致病性有潜在参考价值，可作为我国出入境检验检疫标准的基本数据。本发明的引物、探针以及检测结果，可以为荧光定量PCR检测试剂盒的开发提供可靠的依据。图1.菌液0D600值与显微镜下绝对计数值的相关性，注对应方程为y=2.0452x+6.2845，R2=0.6128,R=0.7828(P<0.001),y显微镜下绝对计数log值(个/ml)，x:0D600值。数据来源于43株不同的副溶血性弧菌的菌液测定值。图2.PCR扩增副溶血性弧菌tdh基因结果，1分子量标记(D2000，天根生化科技有限公司，北京)；2空白对照；3:tdh-菌株的阴性扩增结果；4:tdh+菌株的阳性扩增结果。图3A.标准定量tdh基因DNA模板(101-107拷贝/yl)实时定量PCR扩增曲线，分别代表标准定量tdh基因DNA模板107-101拷贝/yl，Taqman探针采用FAM(6-fluoresein)标记，所用仪器为iCycleriQ(Bio-Rad)，测定通道为FAM490nm。图3B.tdh基因起始拷贝数的对数值与Ct值的标准曲线，对应的方程为y=-3.1441ogx+43.229，R=0.997，(P<0.001),y:Ct值，x模板DNA起始拷贝数(lOn拷贝数/Pi)。具体实施方式下面结合附图对本发明提供的一种副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法和应用的具体实施方式作详细说明。实施例1副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测方法1.材料1.1菌株来源副溶血性弧菌2006年11月至2007年9月之间分别从上海市金山区，浦东新区和舟山渔场的食物中毒和胃肠炎腹泻患者，水产品及陆地环境水，养殖用水样本中分离得到，由上海市出入境检验检疫局提供。将腹泻患者分离的副溶血性弧菌视为临床来源菌株，水产品和水样分离的菌株视为环境来源菌株。1.2材料和试剂1.硫代硫酸盐-枸橼酸盐-胆汁酸盐-蔗糖琼脂粉(TCBS)(上海市疾病预防控制中心试剂研究中心提供)2.LB液体培养基(Sigma公司)3.UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)4.dNTP,10XEx缓冲液(含MgC12)，ExTaq热启动酶(TAKRATaqTM，宝生物工程有限公司，大连)5.引物合成(上海生工生物工程技术服务有限公司)6.探针合成(上海生工生物工程技术服务有限公司)7.琼脂糖粉8.UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)1.3仪器1.血细胞计数板2.相差显微镜ECLIPSETS100(尼康公司)3.Thermo436型落地式恒温摇床(ThermoFisherScientific公司)4.EppendorfBioPhotometer紫外分光仪(Eppendorf公司)5.PCR仪MyCycler(Bio-Rad公司)6.实时荧光定量PCR仪iCycleriQ(Bio-Rad公司)2.方法2.1细菌复苏取43株副溶血性弧菌的保存菌株在硫代硫酸盐_枸橼酸盐_胆汁酸盐_蔗糖琼月旨(ThiosulfateCitrateBileSucroseAgar,TCBS)平板划线，37°C培养18-24小时。2.2副溶血性弧菌0D_值的测定和相差显微镜下绝对计数挑取适量在TCBS平板上形成的副溶血性弧菌菌落，接种于LB液体培养基。37°C震荡培养，使细菌处于对数生长期。以空白LB液调零，测定菌液0D600值。菌液经适度稀释，使用血细胞计数板在相差显微镜下进行绝对计数。2.3细菌基因组DNA的定量提取将2ml已测定0D6QQ值的菌液离心取沉淀物，混于200u1TE溶液(10mMTris-CI,ImMEDTA，pH8.0)，使用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)依照操作说明提取细菌基因组DNA。简述为依次加入400yl裂解液和3yl蛋白酶K溶液，裂解细菌释放基因组DNA，离心，取上清液加入UNIQ-10吸附柱，使用洗涤液去除杂质，用ddH20洗脱，获得30-50yl细菌基因组DNA，浓度约为0.02-0.05ug/u102.4引物和探针设计tdh基因的普通聚合酶链式反应(PCR)扩增引物根据LynchT,LivingstoneS,BuenaventuraE,etal.Vibrioparahaemolyticusdisruptionofepithelialcelltightjunctionsoccursindependentlyoftoxinproduction.InfectImmunJT-Infectionandimmunity,2005,73(3):1275-83(副溶血性弧菌裂解上皮细胞紧密连接的作用不依赖于毒素产生，《感染与免疫》，2005，73(3)1275-83)合成。tdh基因的位置依据GenBank号为M10069的基因序列，正向引物为5，-CCATCTGTCCCTTTTCCTGCC-3，(位置在330_350bp处)，反向引物为5，-CCACTACCACTCTCATATGC-3，(位置在754_735bp处)。tdh保守序列来源于17条已报道的序列的Consensus序列(GenBank序列号分别为M10069，M55316,AY044107-AY044114,S76724,S67841,S67850和X54340-X54343)，根据保守区域设计TaciMan探针，序列为5，-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3，(位置在517-541bp处)。因上述扩增tdh基因的引物与探针组合不能有效进行实时荧光定量PCR反应，因此使用primerpremier5.0软件另行设计实时荧光定量PCR适用的扩增引物，正向序列为5，-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3，(位置在467_487bp处)，反向序列为5，_ACCGCTGCCATTGTATAGTCT_3，(位置在571_551bp处)，目的片段长度为105bp。2.5tdh基因扩增使用的扩增引物为正向引物5，-CCATCTGTCCCTTTTCCTGCC-3，，反向引物5，-CCACTACCACTCTCATATGC-3，。PCR条件为50yl反应体系，模板使用4yl细菌基因组DNA，20iiM正反向引物各liil，4iil2.5mMdNTP,5u110X缓冲液(含MgCl2)，0.25u15U/ulrTaq酶(TAKRATaq，宝生物工程有限公司，大连)，ddH20补足体积。扩增条件为起始94°C变性4分钟；之后反应30个循环(94°C30秒；55°C30秒；72°C1分钟)；终末72°C延伸5分钟。以ddH20做空白对照。产物取5iU作琼脂糖凝胶电泳(0.8%，5V/cm，40分钟)。2.6定量tdh基因标准DNA模板的制备使用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)依据说明书将电泳分离的tdh基因扩增片段从琼脂糖凝胶中回收。用ddH20以10拷贝为量级从107copies/u1依次稀释至lO'copies/u102.7实时荧光定量PCR反应使用的扩增引物为正向序列5，-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3’，反向序列5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT_3，。25yl反应体系检测了17株经普通PCR筛出的tdh+副溶血性弧菌。模板2u1，分别为tdh基因标准DNA模板(lO^lOWies/u1)和待测的副溶血性弧菌基因组DNA。tdh基因标准DNA模板各拷贝梯度均平行5个复管作为定量基准，3iiM正反向tdh基因荧光定量PCR引物各2iil,6uMTaqMan探针2ii1,2.5u12.5mMdNTP,2.5illlOXEx缓冲液(含MgCl2),5U/u1ExTaq热启动酶0.2ill(TAKRATaq,宝生物工程有限公司，大连)，ddH20补足体系。反应条件为开始一个循环95°C预变性3分30秒，接着40个循环(95°C30秒；52°C45秒)，52°C采集荧光。荧光采集通道为FAM，490nm。ddH20作为空白对照。2.8统计分析使用OfficeExcel整理数据并绘制细菌0D_值与菌液绝对计数值的标准曲线。3.实验结果3.1副溶血性弧菌的培养及计数43株处于对数生长期的副溶血性弧菌株0D_值在0.138-0.694之间，相应的显微镜下菌液的绝对计数值为106-107个/ml。两者的线性关系为y=2.0452x+6.2845(r=0.7828，P<0.001)(图1)。按此计算式可根据0D_值推算出待测副溶血性弧菌菌液的绝对计数值。3.2tdh基因的扩增使用普通PCR方法对腹泻患者，水产品和水样三种来源分离的副溶血性弧菌(n=172)扩增tdh基因，共有91株为tdh+菌，水样中无tdh+株。91株tdh+株均扩增出长度为425bp的目的片段，位置在330-754bp处(图2)。3.3实时荧光定量PCR反应结果17株tdh+副溶血性弧菌定量tdh基因拷贝水平。5个复管的tdh基因标准DNA浓度测定的重复性符合要求(图3A)。空白对照在40个循环内不能检测到Ct值，显示该反应的检测灵敏度小于10个拷贝/yl。其拷贝数(lOMO7拷贝/yl)的对数与Ct值呈线性关系y=-3.1441ogx+43.229(R=0.997，P<0.001)(图3B)。从17株试验菌的定量结果可看出，根据待测菌株的Ct值可计算tdh基因的拷贝数，与待测菌液的绝对计数值比较可计算tdh基因的群体拷贝水平(表1)。表1.十七株tdh+副溶血性弧菌的tdh基因平均拷贝浓度样本原始样编号本编号菌液浓度(10"个/ml)Ct值模板基因定量值(10"拷贝数/lU)t劝基因拷贝水平(拷贝数/菌)需要说明的是本发明尝试用经典文献报道的做常规PCR的引物对建立实时焚光定量PGR反应，这样有助于历史实验数据的对比。但由于real-timePCR反应对扩增区域有一定的二级结构要求，我们用这些引物未能建立理想的实时荧光定量PCR体系。因此修改的反应条件为采用467_571bp的扩增区段，和517_541bp的正向TaqMan探针。之前Blackstone曾采用real-timePCRTaqMan探针法检测牡蛎中致病性副溶血性弧菌的tdhS基因，使用针对tdhS基因(GenBank序列号D90101)的高度特异TaqMan探针。Kp+的副溶血性弧菌具有tdhl(或tdhS)和tdh2(或tdhA)两种类型的基因。tdh2(或tdhA)为优势表达(>90%)，由{此1(或{(1115)表达的TDH为TDH总量的0.5-9.4%。因此Blackstone的方法检出的tdhS基因可能无法反映TDH的总表达水平。我们设计的TaqMan探针源于17种tdh基因来源，高度保守，可同时检出tdhl和tdh2。Linda曾采用多重实时荧光定量PCR法检测副溶血性弧菌的0RF8，tlh，tdh和trh基因，其中关于tdh基因的检测反映其417-645bp区间的234bp扩增片段，探针位置在590_612bp处，除该反应的引物设计同样源于单一序列以外，在反应参数上也逊于本发明的条件(扩增长度105bp)，反应效率特异性都较低。实施例2一种副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测试剂盒本发明试剂盒包含细胞裂解液I、细胞裂解液II、RNA洗涤缓冲液I、RNA洗涤缓冲液II、无RNA酶的水、RNA分离柱、反转录缓冲液、逆转录酶储存液、dNTP混合物、PCR反应液、探针、标准品、对照品。以上各种溶液均为水溶液。(1)、细胞裂解液I包含()lmol/1Tris-HCI(三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH7.6，25°C)、0.lmol/1氯化钠、0.05mol/l氯化镁、水。(2)、细胞裂解液II包含3mol/l异硫氰酸胍、2mol/l盐酸胍、0.3mol/l醋酸钠(pH5.2),0.2%(ff/V)SDS(十二烷基硫酸钠)、水。(3)、RNA洗涤缓冲液I包含0.2mol/l醋酸钠(pH5.2)、0.lmol/1氯酸钠、0.lmol/LTris-HCl(pH7.5)(4)、RNA洗涤缓冲液II包含1.2mol/l柠檬酸钠、0.5mol/lTris-HCl(pH7.5，25°C)、水。(5)、无RNA酶的水制备方法为向去离子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至终浓度为0.05%(V/V)，室温(22-25°C)放置10-12小时后，121°C，20min高压，室温放置备用。(6)、RNA分离柱是一种硅胶柱，可以特异性结合RNA，并可用水洗脱RNA，达到分离纯化RNA的目的。(7)、反转录缓冲液包含9.lumol/1oligo(dT)12_18、3.6U/ulRnaselnhibitor、72.7mmol/lDTT(二硫苏糖醇)、182mmol/lTris-HCl(pH8.3，25°C)、273mmol/lKCI、llmmol/1MgC12。(8)、逆转录酶储存液包含20mmol/lTris_HCl(pH7.5，25°C)、lOOmmol/lNaCl、0.lmmol/1EDTAU.0mmol/lDTT,50%(V/V)甘油、0.01%(V/V)Nonidetp_40、200U/ul逆转录酶(M-MLV)、水。(9)、dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，为其钠盐-水溶液pH7.0-7.5，四种dNTP浓度均为lOmmol/1。如dATP为脱氧腺苷三磷酸，其钠盐为磷酸上的三个氢中的一个或两个被钠取代，便形成了钠盐；其它几种也是如此。即dNTP是以钠盐形式存在的。(10)、PCR反应液包含18.5mmol/lTris-HCI(pH8.3,25°C)>2.78mmolMgC12、92.6mmol/LKCL、引物、dNTP混合物、水。检测用引物序列分别为正向序列为5，-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3，，(见SEQIDNO2所示)反向序列为5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3，(见SEQIDNO3所示)(11)、探针荧光标记的探针，其序列为5，-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3，(见SEQIDN01所示)。(12)、对照品分为阳性对照品与阴性对照品。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。SEQUENCELISTING<110>上海市公共卫生临床中心<120>一种副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法和应用<130>/<160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1tgacatcctacatgactgtgaac23<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>21cgaagatgtttatggtcaatc21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3accgctgccattgtatagtct2权利要求一种副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测试剂盒，包括dNTP混合物、PCR反应液、探针、扩增引物，其特征在于，所述探针的序列为5’-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3’所述扩增引物，正向序列为5’-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3’反向序列为5’-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3’。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针5’-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3，的位置在517_541bp处，所述扩增引物，正向序列5，-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3，的位置在467_487bp处，反向序列5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3，的位置在571-551bp处。3.一种副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤(a)、细菌复苏(b)、副溶血性弧菌0D_值的测定和相差显微镜下绝对计数(c)、细菌基因组DNA的定量提取(d)、引物和探针设计(e)、tdh基因扩增(f)、定量tdh基因标准DNA模板的制备(g)、实时荧光定量PCR反应。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(d)中的探针序列为5’-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3’所述扩增引物，正向序列为5，-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3’，反向序列为5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3，。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述探针5’-FAM-TGACATCCTACATGACTGTGAAC-ECLIPSE-3，的位置在517_541bp处，所述扩增引物，正向序列5，-CGAAGATGTTTATGGTCAATC-3，的位置在467_487bp处，反向序列5，-ACCGCTGCCATTGTATAGTCT-3，的位置在571-551bp处。6.根据权利要求1或2所述的试剂盒在制备检测致病副溶血性弧菌性疾病药物中的应用。7.根据权利要求1或2所述的试剂盒在出入境海产品的检疫质量控制中的应用。全文摘要本发明涉及一种试剂盒，所述的试剂盒包括dNTP混合物、PCR反应液、探针、扩增引物，所述探针的序列见SEQIDNO1所示，所述扩增引物，正向序列见SEQIDNO2所示，反向序列见SEQIDNO3所示，本发明还提供了一种副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的荧光定量PCR检测方法。另外，本发明还提供了试剂盒的用途。本发明优点在于建立了快速检测副溶血性弧菌tdh基因的real-timePCR方法，可做为副溶血性弧菌致病性评判体系的方法之一，用于对出入境海产品的检疫质量控制。我们建立了用副溶血性弧菌OD600值计算菌群绝对数量浓度的公式，可替代繁琐的显微镜下计数法，简化了定量时间。文档编号G01N21/64GK101851667SQ200910048808公开日2010年10月6日申请日期2009年4月3日优先权日2009年4月3日发明者周晓明,张继伦,王宏萍申请人:上海市公共卫生临床中心