专利名称：一种从骨实质中分离间充质干/祖细胞的方法
技术领域：
本发明涉及分离干细胞的方法，特别是涉及一种从骨实质中分离间充质干/祖细胞的方法。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中的非造血干细胞，具备向成骨、成软骨和成脂肪细胞分化的能力，具有免疫调节和造血支持作用。因此，MSC不但是组织工程化骨和软骨构建中重要的种子细胞，而且由于MSC促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血细胞移植中也具有广泛的应用前景。MSC具有体外贴壁生长特性，利用细胞的贴壁性能，人们已经从人、犬、兔、大鼠、鸡、绵羊、山羊、猪和牛骨髓中，成功分离出MSC。
将人或牛等其他动物骨髓细胞体外培养时，贴壁的细胞群体中含有间充质干/祖细胞(mesenchymal stem/progenitor cells，MSPC)、内皮细胞和血细胞。由于培养体系中血清浓度较低，且经过严格筛选，体系中未添加内皮细胞生长因子或其他细胞因子，不利于内皮细胞和血细胞增殖。因此，随着培养传代进行，MSPC成为贴壁层中的主要成分，所占比例在90％以上。小鼠是开展有关MSPC细胞生物学研究的理想模型，然而，利用文献方法进行小鼠骨髓体外培养时，由于血细胞不易从贴壁层中去除，建立MSPC培养体系十分困难。最近的研究表明，人和小鼠骨实质中存在MSPC，为分离培养小鼠MSPC提出了新的途径。本发明发明人曾利用小鼠骨碎片和骨髓细胞共同培养的方法，以纯化骨髓中的间充质干/祖细胞，获得了比较满意的结果(Sun S，Guo Z，Xiao X，et al.Isolation of mouse marrow mesenchymal progenitors by a novel and reliablemethod.Stem Cells 2003；21527-35)。但是所获得细胞中仍然含有相当数量的CD45+细胞，而且，相当数量为碱性磷酸酶阳性的成骨细胞。因此可以认为，采用上述方法所得到的贴壁细胞群中不但有血细胞的残存，而且，部分细胞可能不是真正的干细胞。
发明内容
本发明的目的是提供一种实用简单的从骨实质中分离间充质干/祖细胞的方法。
本发明所提供的从骨实质中分离间充质干/祖细胞的方法，包括如下步骤1)用胶原蛋白酶溶液消化骨片；2)将消化后的骨片在培养基中培养，去除非贴壁细胞，得到贴壁细胞，即为所述的间充质干/祖细胞。
其中，步骤1)所述骨片大小为1-2mm，在消化前经过含5-15％体积胎牛血清的PBS缓冲液冲洗。常用骨片为小鼠股骨片，此时得到的细胞为小鼠MSPC细胞。步骤1)常用的胶原蛋白酶为胶原蛋白酶II，其重量百分浓度为0.1-0.15％，溶剂为含有15-20％体积胎牛血清的α-MEM培养基。
步骤2)所述培养基为含有1-2mmol/L谷氨酰胺，10％体积胎牛血清的α-MEM培养基；培养条件为35-38℃、5％CO2，培养时间为2-3天。
将所得到的MSPC细胞利用低血清体系进行传代培养，细胞体外增殖旺盛，最终从每根股骨可获得6×107以上细胞，可完全满足一般细胞生物学实验所需数量。
本发明方法操作简单，方便实用，所得到间充质干/祖细胞纯度高，没有血细胞和内皮细胞残存；分化性能好，具有向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞等细胞分化的能力。本发明建立了稳定实用的MSPC细胞纯化培养技术体系，为开展MSPC细胞的研究奠定了基础。
图1为MSPC培养照片；图2A-图2I为消化骨片培养获得的MSPC细胞的流式细胞分析结果；图3A-图3I为消化细胞培养获得的细胞的流式细胞分析结果；图4A-图4F为诱导MSPC细胞组织化学染色照片；图5A-图5C为诱导MSPC细胞RT-PCR的电泳照片。
具体实施例方式
实施例1、小鼠间充质干/祖细胞的分离和鉴定一、小鼠间充质干/祖细胞(MSPC)的分离1、实验材料实验动物2-4周龄雌性C57BL/6小鼠，购于军事医学科学院动物中心，实验动物使用符合军事医学科学院实验动物指南；实验试剂胶原蛋白酶II和α-MEM购自GIBCO公司，胎牛血清(FCS)为加拿大Hyclone公司产品，经筛选后使用；各种单克隆抗体购于PharMingen公司；胶原蛋白酶II溶于含20％FCS(体积百分比)的α-MEM中，使用浓度为0.1％(重量百分比)。
2、实验方法
1)骨片消化及接种无菌条件下取小鼠股骨，剔除肌肉及肌腱组织，用含10％体积FCS的PBS缓冲液冲洗骨髓腔至骨转为白色，然后将骨剪为大小2毫米的碎片，置入含0.1％胶原蛋白酶II中，37℃振荡消化2小时，振荡频率为200rpm。去除消化下来的细胞悬液，洗涤骨碎片，将骨片置37℃、5％CO2条件下进行培养，所用培养基为含2mM谷氨酰胺，10％FCS(体积百分比)的α-MEM，骨片密度为每75cm2(细胞培养瓶内表面积)接种2根股骨碎片。3天后换液，去除非贴壁细胞，贴壁细胞即为小鼠MSPC细胞。
作为对比，将消化下来的细胞悬液也在相同条件下进行培养，其接种密度为5×105/cm2(细胞培养瓶内表面积)。
2)细胞培养及传代贴壁层形成后，用0.05％胰蛋白酶/2mM EDTA消化，细胞计数，然后按3000细胞/cm2进行传代培养；之后，细胞密度达50％左右时进行消化传代。
其他如人、犬、兔、大鼠、鸡、绵羊、山羊、猪和牛等动物的MSPC细胞可以采用以上相同的过程从其骨实质中分离培养得到。
二、小鼠间充质干/祖细胞(MSPC)的鉴定除特殊说明的外，鉴定对象为本发明方法得到的细胞。
1、细胞生长情况将骨碎片培养24小时后，即可在骨片周围发现少许成纤维细胞样贴壁细胞，48小时出现由数个细胞组成的小集落，72小时时集落由十数个细胞组成。培养约5天时细胞形成70-80％融合的贴壁层，结果如图1。
2、流式细胞学分析将所得小鼠MSPC细胞和消化细胞培养获得的细胞分别传代培养3代后收集细胞，按0.5μg/1×106细胞分别加入PE或FITC标记抗CD29、CD31、CD34、CD45、CD105、Sal-1等单克隆抗体，室温反应30分钟，PBS洗涤两次后，用流式细胞仪检测，每个反应至少收集10000个点数据，以相应同型抗体管为阴性对照。
图2A-图2I分别为用本发明方法消化骨片培养获得的MSPC细胞与CTL-FITC(阴性对照)，CD45-FITC，Scal-1-FITC，H2b-FITC，CD31-FITC，CTL-PE(阴性对照)，CD34-PE，CD44-PE，CD29-PE的分析结果(纵坐标细胞数；横坐标相对荧光强度)。由图可见，通过消化骨片培养获得的MSPC细胞均一表达CD29、CD44和Scal-1(图2C、图2H、图2I)，提示为一群干/祖细胞；不表达CD31、CD34和CD45(图2F、图2D、图2B)，表明细胞群体中没有血细胞和内皮细胞残存。
图3A-图3I分别为消化细胞培养获得的细胞与CTL-FITC(阴性对照)，CD45-FITC，Scal-1-FITC，H2b-FITC，CD31-FITC，CTL-PE(阴性对照)，CD34-PE，CD44-PE，CD29-PE的分析结果，由图3组可见，采用消化细胞悬液培养得到的细胞表面抗原谱与本发明方法通过消化骨片培养获得的MSPC细胞类似，但是，与MSPC细胞不同的是，该细胞群体中有相当比例细胞表达CD45(图3B)，即使传代5次后仍有部分细胞为CD45阳性，说明其中还含有部分血细胞。
3、MSPC细胞的诱导分化及组织化学鉴定按文献方法(Sun S，Guo Z，Xiao X，et al.Isolation of mouse marrow mesenchymalprogenitors by a novel and reliable method.Stem Cells 2003；21527-35)进行所得小鼠MSPC细胞的诱导分化成骨分化体系包括抗坏血酸磷酸盐、地塞米松和β磷酸甘油；应用含转化因子-β(TGF-β1)的无血清体系、微球培养法诱导向成软骨细胞分化；脂肪分化体系包括地塞米松和胰岛素。
1)组织化学染色鉴定以未加诱导体系的细胞为对照，利用碱性磷酸酶和von Kossa染色鉴定成骨细胞，阿尔辛蓝染色显示细胞外蛋白聚糖鉴定成软骨细胞，油红O染色鉴定脂肪细胞类型。图4A-图4F依次为成骨诱导前、成骨诱导后、软骨诱导前、软骨诱导后、脂肪诱导前、脂肪诱导后细胞的染色照片，结果表明，培养细胞具有体外成骨、成软骨和成脂肪能力。
2)RT-PCR鉴定收集诱导细胞，应用Trizol试剂(GIBICO/BRL)提取细胞总RNA，以之为模板进行RT-PCR，反转录及cDNA扩增按mRNA选择性RT-PCR试剂盒(购于Takarashuzo)说明书进行，引物序列如表1所示。
表1.RT-PCR引物序列及其特异性
图5A-图5C分别为小鼠MSPC细胞诱导为成脂肪细胞、诱导为成骨细胞、诱导为成软骨细胞的PR-PCT电泳照片，其中，泳道1为诱导前细胞，泳道2为诱导后细胞；结果表明，体外诱导后细胞能表达系列特异性mRNA成脂肪诱导后细胞表达PPAR-γ，成骨诱导后细胞表达骨钙素，成软骨诱导后细胞表达II型胶原蛋白，说明所得到的MSPC细胞具有成骨、成软骨和成脂肪能力，符合公认的MSC标准。
应用常规诱导体系培养本发明方法所获得的MSPC细胞，经组织化学染色和RT-PCR鉴定细胞类型，结果显示，MSPC具有向成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞分化的能力，证实本发明方法所得的MSPC具有干细胞特点。
权利要求
1.一种从骨实质中分离间充质干/祖细胞的方法，包括如下步骤1)用胶原蛋白酶溶液消化骨片；2)将消化后的骨片在培养基中培养，去除非贴壁细胞，得到贴壁细胞即为所述的间充质干/祖细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)所述骨片大小为1-2mm；所述骨片为小鼠股骨片。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤1)所述骨片在消化前还经过含5-15％体积胎牛血清的PBS缓冲液冲洗。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)所述胶原蛋白酶为胶原蛋白酶II。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤1)所述胶原蛋白酶II溶液的重量百分浓度为0.1-0.15％，溶剂为含有15-20％体积胎牛血清的α-MEM培养基。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于步骤2)所述培养基为含有1-2mmol/L谷氨酰胺，10％体积胎牛血清的α-MEM培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤2)所述培养的培养条件为35-38℃、5％CO2，培养时间为2-3天。
8.根据权利要求6述的方法，其特征在于步骤2)所述贴壁细胞还经过传代培养。
9.根据权利要求7的方法，其特征在于步骤2)所述贴壁细胞还经过传代培养。
10.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于步骤2)所述贴壁细胞还经过传代培养。
全文摘要
本发明公开了一种从骨实质中分离间充质干/祖细胞的方法。本发明所提供的从骨实质中分离间充质干/祖细胞的方法，包括如下步骤1)用胶原蛋白酶溶液消化骨片；2)将消化后的骨片在培养基中培养，去除非贴壁细胞，得到贴壁细胞，即为所述的间充质干/祖细胞。本发明方法操作简单，方便实用，所得到间充质干/祖细胞纯度高，没有血细胞和内皮细胞残存；分化性能好，具有向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞等细胞分化的能力。本发明建立了稳定实用的小鼠MSPC细胞纯化培养技术体系，为开展MSPC细胞的研究奠定了基础。
文档编号C12N5/06GK1673358SQ20051005526
公开日2005年9月28日 申请日期2005年3月17日 优先权日2005年3月17日
发明者李秀森, 李红, 郭子宽, 于晓妉, 毛宁 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所