专利名称：一种从组织中高效分离间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明属于细胞培养技术领域，具体地说，涉及一种从组织中高效获取间充质干细胞或其它细胞的方法。
背景技术：
组织是获取干细胞和其它多种细胞的重要来源，这些从组织中分离获得的干细胞和其它原代细胞可广泛应用于科学研究和临床治疗。组织贴壁培养法是从组织中获取细胞的传统方法，如用于从皮肤组织中获取成纤维细胞，以及从脐带组织获取间充质干细胞等。 但长期以来，组织贴壁培养法的关键技术环节难以掌控，以致细胞分离失败，或获取细胞量低，不仅造成宝贵组织资源的浪费，而且使相关的科学研究及临床应用受阻。解决此法中的技术缺陷，提高获取原代细胞的成功率和产量具有重大的应用价值。传统的组织贴壁培养法的具体操作步骤一般是先将组织切成块状或片状，贴在细胞培养皿上(塑料或玻璃细胞培养皿)，含待分离细胞的一面朝下，然后加入细胞培养液培养数天，中间更换培养液。但此方法常遇到的一个问题是组织在加入培养液后浮起，使组织内的细胞无法贴壁生长，导致细胞分离失败或细胞产量低。
发明内容
本发明是在传统组织贴壁培养法的基础上，解决了贴壁组织加入培养液后的上浮的问题。具体方法是，当组织片或块贴在细胞培养皿上(塑料或玻璃细胞培养皿，含待分离细胞的一面朝下)后，在组织上面压一个带孔的玻璃板或类似物，再加入细胞培养液。这样既借助玻璃板或类似物的重力有效防止组织上浮，又通过玻璃板或类似物上面的孔保证组织内、外营养物质及气体的交换，从而显著提高从组织中分离细胞的效率和产量。本发明的组织贴壁培养法可使从脐带组织分离间充质干细胞的产量较传统方法提高50%以上，长出间充质干细胞的时间提前3天以上。这不但提高了细胞分离的效率，而且保证了干细胞等稀缺细胞的有效分离。本发明解决了用传统组织贴壁培养法分离细胞的过程中经常遇到的易失败、产量低等缺陷，是一种高效、可靠、高细胞质量的从组织中分离细胞的方法。
为直观形象地说明本发明的内容，在说明书附图部分附3个图，分别作如下说明图1.有孔玻璃板，从左向右分别适用于150mm、IOOmm和6孔板细胞培养皿。图2.有孔玻璃板的使用方法先将组织块贴在培养皿上，再将有孔玻璃板压到组织块上面，最后加入细胞培养液。图3.用有带孔的玻璃板压在培养的脐带组织上面，分离脐带组织中的间充质干细胞。
具体实施例方式
实施例1制备有孔玻璃板或类似物玻璃板所用材料应对细胞无毒；玻璃板以透明为宜，以便于观察；玻璃板大小不限，一般以少小于细胞培养皿大小为宜；玻璃板上有大小适当、数量足够的贯通孔，以保证营养及气体的交换。孔的大小不限，一般以方便通过其换培养液为宜；玻璃板厚度适当，使带孔玻璃板在培养液中有一定的下沉力，但又不过度挤压组织，影响组织内营养物质的交换。举例从脐带组织中分离间充质干细胞，可用下列有孔玻璃板。150mm细胞培养皿，可用直径130mm、厚2mm的圆形玻璃板，上有直径为4mm的圆孔80个；IOOmm细胞培养皿，可用直径80mm、厚2mm的圆形玻璃板，上有直径为4mm的圆孔30个；6孔板细胞培养皿， 可用直径35mm、厚2mm的圆形玻璃板，上有直径为4mm的圆孔11个(见图1)。以上有孔玻璃板也可用于从皮肤组织中分离成纤维细胞。玻璃板的厚度和所含孔的大小和数量可变化，以更适合从不同组织中分离细胞的要求。实施例2从脐带分离间充质干细胞将新鲜人脐带切成0. 5-2cm的段，从中间剖开，可去掉或不去掉血管，用刀在暴露面上多次划痕，使Wharton胶充分暴露。将组织贴在培养皿上(塑料或玻璃细胞培养皿)， Wharton胶暴露面与培养皿紧密接触，各组织块间距离适当。然后再将带孔玻璃板压在组织切片上方。最后加入细胞培养液(如含10%胎牛血清的DMEM培养液)至没过组织(见图 2和图幻。小心将培养皿移至细胞培养箱内，在37°C、5% CO2条件下培养，每3天更换80% 的培养液。换液时，通过玻璃板上的孔，小心将培养液吸出，避免移动玻璃板。数日后显微镜下可见细胞从组织周边长出。收集贴壁细胞时，可先取出组织上方的玻璃板，再进行胰蛋白酶消化，也可在胰蛋白酶消化后，再取出玻璃板，后者细胞收获量稍高。鉴定间充质干细胞的特征，包括细胞表面特征性蛋白的表达和向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的能力。 运用免疫磁珠等方法纯化间充质干细胞。本方法较传统方法(无带孔玻璃板加盖，其它步骤相同)分离间充质干细胞的产量提高50%以上，长出间充质干细胞的时间提前3天以上。实施例3从皮肤组织分离成纤维细胞人或鼠皮肤在去毛后酒精消毒，人皮肤需刮去皮肤脂肪层。将新鲜皮肤切成小块， 用分散酶(dispase)消化去除表皮层(可省略)，将皮肤贴在培养皿上(塑料或玻璃细胞培养皿)，真皮面朝下，组织间距离适当。然后再将带孔玻璃板压在组织切片上方。最后加入细胞培养液(如含10%胎牛血清的DMEM培养液)至没过组织。小心将培养皿移至细胞培养箱内，在37°C、5% CO2条件下培养，每3天更换80%的培养液。换液时，通过玻璃板上的孔，小心将培养液吸出，避免移动玻璃板。数日后显微镜下可见细胞从组织周边长出。收集细胞时，可先取出组织上方的玻璃板，再进行胰蛋白酶消化，也可在胰蛋白酶消化后，再取出玻璃板，后者细胞收获量稍高。以上实施实例旨在说明有孔玻璃板(或类似物)在细胞分离过程中的使用方法， 某些操作步骤可根据需要灵活变化。
权利要求
1.一种从组织中高效获取间充质干细胞细胞或其它细胞的方法，其特征是在贴壁培养的组织的上方压带孔的玻璃板或类似物，大大提高细胞分离成功率及细胞的产量，缩短培养时间。
2.根据权利要求1所述，其特征在于，在贴壁培养的组织的上方压带有一个或多个孔的玻璃板或类似物。
3.根据权利要求1所述，其特征在于，压在培养组织块上的有孔玻璃板或类似物可以是一片或多片。
4.根据权利要求1所述，其特征在于，压在培养组织块上的带孔的玻璃板或类似物可因培养皿或其它培养体系的形状而呈圆、方或其它任意形状。
5.根据权利要求1所述，其特征在于，可使用于从脐带组织或其它组织(如皮肤、胎盘等)中获取间充质干细胞或其它一种或多种细胞贴壁生长的细胞。
6.根据权利要求1所述，其特征在于，本技术适用于组织及组织工程产品的培养。
7.根据权利要求1所述，本方法其特征包括但不限于以下部分或全部操作步骤(1)制备有孔玻璃板或类似物，其比重大于培养液，使之在培养液中能下沉；玻璃板或类似物可以带有一个或多个孔，可以是一片或多片，可以是圆形、方形或其它任意形状；(2)组织切块(含待分离细胞的面朝下)贴在细胞培养皿(塑料或玻璃细胞培养皿) 上后，再将带孔玻璃板或类似物压在组织上方，然后加入细胞培养液；(3)更换培养液的方法为，通过玻璃板上的孔，小心将培养液吸出，避免移动玻璃板；(4)收集细胞的方法为，当一定量的细胞从组织周边长出后，用胰蛋白酶消化，收获贴壁的细胞。
全文摘要
本发明公开了一种从组织中高效分离间充质干细胞的方法，属于细胞培养技术领域。本发明旨在解决传统组织贴壁培养法分离间充质干细胞中，贴壁组织块在加入培养液后上浮，使组织内的细胞无法贴壁生长，导致分离失败或细胞产量低的问题。该改良的组织贴壁培养法在传统组织贴壁培养法的基础上，增加一个带孔玻璃板或类似物压在贴壁的组织块上，即有效防止组织上浮，又保证组织内营养物质及气体的交换，从而显著提高从组织中分离间充质细胞的成功率和产量。本发明中的技术方法可广泛用于从多种组织中获取干细胞及其它多种细胞，简单实用，易于操作，将广泛应用于细胞研究、细胞及组织工程产品的研发和生产。
文档编号C12N5/07GK102311939SQ20101021572
公开日2012年1月11日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者刘陈雄, 吴耀炯, 李智龙 申请人:吴耀炯