鸡传染性法氏囊病病毒重组弱毒疫苗株及其应用的制作方法

专利名称：鸡传染性法氏囊病病毒重组弱毒疫苗株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株重组弱毒疫苗株，尤其涉及一株表达流行毒株主要保护性抗原蛋 白VP2的鸡传染性法氏囊病病毒重组弱毒疫苗株，本发明还涉及该重组弱毒疫苗株在制备 防制鸡传染性法氏囊病生物制品中的应用，属于鸡传染性法氏囊病的防制领域。
背景技术：
鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病 病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一种主要危害雏鸡的急性、高度 接触性、免疫抑制性、致死性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为“影响社会经济的重 要疾病”。该病于1957年首次爆发于美国，现已大面积流行于欧州、东南亚、非州、南美洲等 地。中国的流行情况也比较严重，一直威胁着中国养禽业的发展。IBDV有两个血清型，仅血 清I型对鸡致病。血清I型毒株由于不断变异又分为经典毒株、变异毒株、超强毒株(very virulent IBDV, vvIBDV)，其中vvIBDV的致死率高达60%以上，而且耐过鸡群会呈现对禽
(MuIler H, Islam M R, Raue R. Research on infectious bursal disease-the past,the presentand the future. Vet. Microbiol. 2003,97 :153-165.)。最 近研究发现，野生鸟类也能感染wIBDV。免疫抑制、抗原变异，特别是wIBDV的出现，使得 该病的防控形势更加严峻。IBDV属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属，其基因组由两个双股RNA节段组成。B 节段长2827bp，编码具有RNA聚合酶活性的VPl蛋白。A节段长3260bp，包括两个开放阅 读框(ORF)小ORF在前，编码非结构蛋白VP5;大ORF在后，编码VP2、VP3和VP4蛋白。 VP2是IBDV唯一的衣壳蛋白，是IBDV主要的毒力蛋白和宿主保护性抗原(Garriga D， Querol-Audi J, Abaitua F, et al. The 2. 6-Angstrom structure of infectious bursal disease virus-derived T-Iparticles reveals new stabilizing elements of the virus capsid. J. Virol.，2006,80 :6895_6905·)。最近，IBDV新的变异趋向已被监测到。本发明人实验室对分离鉴定的vvIBDV进行 全基因组序列分析还发现，HLJ-0504代表了一群具有基因组新特征的vvIBDV，这类病毒具 有超强毒的A节段和介于强弱毒之间的B节段，VP2基因存在抗原漂变，其对SPF鸡致死率 高达86. 7%，该类病毒在东北地区、广西以及法国均有存在。依据主要保护性抗原基因VP2 绘制的遗传进化树分析发现，HLJ-0504株在国内流行毒株中具有代表性。疫苗免疫是防控wIBDV的主要手段，但wIBDV致病性很强且不适应细胞培养，活 疫苗株的获得只能通过将野生vvIBDV在鸡胚或CEF细胞上传代致弱(Wang X Μ,Fu C Y, Gao H L, et al. Pathogenicantigenic and molecular characterization of very virulent strain (Gx) of infectious bursal disease virus isolated in China. Agri. Sci. China, 2003,2 :566-572. Wang X M, Zeng X W, Gao H L, et al. Changes inVP2 gene during the attenuation of very virulent infectious bursaldisease Virus strain Gx isolated in China. Avian Dis. ,2004,48 :77-83. Wang, X. , Zhang H. , Gao H. , et al. Changes inVP3 and VP5 genesduring the attenuation of very virulent infectious bursal disease virusstrain Gx isolated in China. Virus Genes，2007，34 :67_73. Yamaguchi T，Ogawa M，Inoshima Y，et al. Identification of sequence changesresponsibIe for the attenuation of highly virulent infectious bursaldisease virus. Virology, 1996,223 :219-223.)。这种传统的疫苗株驯化方法费时费力，往往需要数年时间，而且结果 带有随机性。对于高致病力的、易变异的vvIBDV的防控，特别是突发疫情的防控，开展疫苗 株的快速构建研究迫在眉睫。反向遗传技术是研究基因功能和进行分子修饰的有力工具。国外研究者对建立快 速的疫苗株筛选方法做了一些探索工作。Mimdt等曾以疫苗株D78为亲本毒，拯救获得嵌合 病毒D78-Chim，该病毒对经典毒和变异株的攻击均能产生保护。此外，有研究者曾以缺失 VP5的策略试图构建疫苗株，VP5缺失虽然导致复制延迟但并不影响宿主对IBDV的体液免 疫反应强度。Lim等曾通过点突变使wIBDV HK46株适应非允许细胞CEF，但没有进一步评 估其致病性和免疫原性。在过去近60年里，IBDV曾经出现过两次大的变异，每次变异都因为新毒株 突破了原有疫苗免疫保护而造成了严重损失(MUller H，Islam M R，RaueR. Research on infectious bursal disease—the past, the present and the future.Vet. Microbiol. 2003，97 :153-165.)。近20年来，鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株(vvIBDV)在 危害养禽业的同时，也在发生和累计着微小的变异，是否会出现抗原性大的变异或者出现 毒力更强的毒株可能只是个时间问题。传统的传代致弱的疫苗株驯化方法费时费力，不能 满足突发疫情应急防控的需要。所以，应用先进的反向遗传操作技术，依据流行病学监控信 息，针对流行毒株，有目的的快速构建IBDV新型疫苗毒株具有重大的现实意义。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一株表达vvIBDV流行 毒株主要保护性抗原蛋白VP2的重组弱毒疫苗株，该毒株有较高的复制滴度，对鸡无致病 性，遗传稳定性良好，有较好的免疫原性。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一株表达wIBDV流行毒株主要保护性抗原蛋白VP2的重组弱毒疫苗株 (rGtHLJVP2)，其微生物保藏号是CGMCC No. 3749 ；分类命名是鸡传染性法氏囊病病毒 (Infectious Bursal Disease Virus)；保藏时间是2010年4月20日保藏单位是中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所。本发明克隆了流行超强毒株HLJ-0504的主要保护性抗原基因VP2，将其核苷酸进 行突变修饰(A889T/G980A)，然后将其替换IBDV弱毒株Gt基因组的相应区段，构建IBDV 重组基因组的感染性克隆，利用IBDV反向遗传操作系统，拯救并鉴定了重组弱毒疫苗株 rGtHLJVP2。在感染性克隆里，IBDV基因组的两端均克隆有核酶的cDNA序列。核酶的本质 是一种具有剪切酶活性的RNA。锤头状核酶结构(hammerhead ribozyme,HamRz)核心序列 共有58个核糖核酸，自我剪切位点在其3'末端C处；丁肝病毒核酶结构(h印atitis delta ribozyme, HdvRz)共有88个核糖核酸，自我剪切位点在其5‘末端G处。核酶序列的引入实现了从转录水平上控制重组IBDV基因组的完整性，这是实现高效病毒拯救的关键之一。 vvIBDV不能够适应CEF细胞，这是由VP2的253和284位氨基酸位点决定的(Qi X L，Gao H L, Gao Y L, et al. Naturally occurring mutations atresidues 253 and 284 in VP2 contribute to the cell tropism andvirulence of very virulent infectious bursal disease. Antiviral Res. ,2009,84 :225_233.)。vvIBDV HLJ-0504核苷酸突变A889T/G980A 导致了 VP2的氨基酸突变Q253H和A284T，这是感染性克隆有感染性并在DFl和CEF细胞上 能够拯救出重组病毒的前提。感染性克隆pCAGGGtAHLJVP2HRT与pCAGGGtBHRT共转染细胞后，经IFA和电 镜观察证明，拯救出了重组弱毒疫苗株rGtHLJVP2。测序证明，本发明重组弱毒疫苗株 rGtHLJVP2是一株以弱毒株Gt为骨架，其主要保护性抗原基因VP2被wIBDV HLJ-0504相 应区域替换了的重组病毒。本发明重组弱毒疫苗株(rGtHLJVP2)主要具有以下几方面的特点(1)复制特性良好。rGtHLJVP2在CEF细胞上与Gt具有相似的复制动力学曲线， 接毒后48h-60h，病毒滴度可达到107TCID5Q/ml以上。在SPF鸡的法氏囊内，rGtHLJVP2与 Gt也具有相当的病毒载量。(2)安全性好，对SPF鸡无致病性。rGtHLJVP2尽管具有vvIBDV的VP2基因，但由 于做了分子修饰，与Gt对照组一样，对SPF鸡不呈现致病性。在接种SPF鸡后的14天内，试 验鸡的精神状态良好，未出现任何发病症状；法氏囊正常，没有萎缩，没有明显的显微病变。 rGtHLJVP2和弱毒疫苗株Gt —样对SPF鸡无致病性，但中等毒力疫苗B87对法氏囊造成了 严重萎缩和不可逆病理损伤。(3)遗传稳定性良好。rGtHLJVP2在CEF细胞和SPF鸡上分别盲传15代和5代， 病毒滴度保持稳定，基因组没有发生意外突变，毒力也没有返强。(4)免疫原性良好。rGtHLJVP2免疫SPF鸡后，7d 80%血清抗体阳转，IOd 100% 阳转，而且能够100%保护强毒攻击。rGtHLJVP2和中等毒力疫苗B87相当，优于弱毒疫苗 株Gt。总之，本发明重组弱毒疫苗株rGtHLJVP2具有良好的复制性、遗传稳定性和安全 性。在免疫效果上，本发明弱毒疫苗株和中等毒力疫苗相当，优于弱毒疫苗株。本发明重组 弱毒疫苗株具备了作为疫苗株的高效、低毒的特点，是一株良好的疫苗候选毒株，可以用于 鸡传染性法氏囊病(IBD)的防控。


图1HLJ-0504株VP2基因的突变修饰及替换Gt株相应区段流程图。图2感染性克隆示意图。图3用HLJ-0504株VP2基因替换Gt株基因组相应区段过程中的各步PCR产 物；M. Ikb DNA Ladder Marker ； 1. PCR 产物 GtHLJ0504VP2I ；2. PCR 产物 GtHLJ0504VP2II ； 3. GtHLJ0504VP2III ；4. PCR 产物 GtAHLJVP2HRT。图4重组病毒在CEF上的CPE (100X)；左.rGtHLJVP2 ；右.正常细胞对照。图5间接免疫荧光检测重组病毒(X 100)；左.rGtHLJVP2 ；右.正常细胞对照。图6电镜下的重组病毒rGtHLJVP2 (40000 X)。
图7重组病毒rGtHLJVP2在CEF细胞上的复制动力学曲线。图8重组病毒rGtHLJVP2体内(法氏囊)复制动力学曲线。图9重组病毒接毒后鸡囊重指数变化曲线。图10重组病毒接种SPF鸡的法氏囊的病理变化(20X)。图11重组病毒诱导试验鸡的抗体滴度。图12不同疫苗免疫试验鸡抗体消长曲线。图13试验鸡二免及攻毒后各组鸡囊重指数变化曲线；d p. i. dayspost-infection (接禾中后天数)；d p. c. :days post challenge (攻毒后天数)。图14试验鸡二免及攻毒后法氏囊的病理变化(20X) ；d p. i. dayspost-infection (接禾中后天数)；d p. c. :days post challenge (攻毒后天数)。图15试验鸡二免后法氏囊中的病毒载量。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1重组弱毒疫苗株rGtHLJVP2的设计、拯救、鉴定及免疫效力初步评价1材料和方法1. 1 材料1. 1. 1 病毒HLJ-0504, vvIBDV[购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所菌毒种室(对外)]； Gt, IBDV弱毒疫苗株，由哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病课题组(本发明人课题组)将 vvIBDV Gx株连续传代致弱并保存，具体方法可参考有关文献(Wang X Μ, Zeng X W, Gao H L, et al. Changes in VP2 geneduring the attenuation of very virulent infectious bursal disease Virus strain Gxisolated in China. Avian Dis. ,2004,48 :77_83 ；Wang, X. , Zhang H. , Gao H. , et al. Changes in VP3 and VP5 genes during the attenuation of very virulent infectiousbursal disease virus strain Gx isolated in China. Virus Genes，2007，34 :67-73.)。1.1.2 质粒pT-HLJ0504AHRT 将HLJ-0504基因组A节段克隆入pMD18T载体，A节段5，端和 3，端已分别加入核酶结构的cDNA序列，分别为HamRz (58bp) 5' TGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTC3'和 HdvRz (88bp) 5' GGGTCG GCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCG3 ‘。 pCAGGGtAHRT和pCAGGGtBHRT 分别将IBDV弱毒株Gt的基因组的A、B节段克隆入真核表达 载体pCAGGS，基因组两端已分别引入了核酶结构HamRz和HdvRz (Qi X L, Gao Y L, Gao H L,et al. An improved method forlnfectious bursal disease virus rescue using RNA polymerase II system. J. Virol. Methods，2007，142 :81_88.)。上述质粒均由本发明人课
6题组构建和保存。1.1.3细胞和单克隆抗体DFI 细胞购自美国模式培养集存库(American type culture collection, ATCC)； 原代鸡胚成纤维细胞(CEF)按常规方法用SPF鸡胚制备；抗IBDVVP2蛋白单克隆抗体6H7D 由本发明人课题组制备；ToplOF'菌种由本发明人实验室保存(ToplOF'菌种也可从生物 试剂公司购买得到)。1. 1.4实验动物SPF鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供，饲养于超滤负压 隔离器中。1. 1.5主要试剂各种限制性内切酶、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Marker、dNTP 等购于 大连宝生物公司；胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自Omega公司；Plasmid Midi Kit为 QIAGEN 产品；LipofectamineTM-2000，SuperscriptRT-PCR Systems 试剂盒购于英俊生物 技术有限公司(Invitrogen) ；Opti-MEM I Medium为GIBCO产品；荧光素(FITC)标记的羊 抗鼠IgG为Sigma产品。1.2引物设计与合成用于RT-PCR、融合PCR以及点突变的引物见表1，由英俊生物技术有限公司 (invitrogen)合成。
权利要求
一株鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus)重组弱毒疫苗株，其微生物保藏号是CGMCC No.3749。
2.权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病病毒重组弱毒疫苗株在制备预防或治疗鸡传 染性法氏囊病生物制品中的用途。
3.权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病病毒重组弱毒疫苗株在制备诊断鸡传染性法 氏囊病生物制品中的用途。
全文摘要
本发明公开了鸡传染性法氏囊病病毒重组弱毒疫苗株及其应用。本发明克隆了流行超强毒株HLJ-0504的主要保护性抗原基因VP2，将其核苷酸进行突变修饰，然后将其替换IBDV弱毒株Gt基因组的相应区段，构建IBDV重组基因组的感染性克隆，利用IBDV反向遗传操作系统，拯救并鉴定了重组弱毒疫苗株，其微生物保藏号是CGMCC No.3749；本发明重组弱毒疫苗株具有良好的复制性、遗传稳定性和安全性。在免疫效果上，本发明弱毒疫苗株和中等毒力疫苗相当，优于弱毒疫苗株。在生物安全性上，优于中等毒力疫苗。本发明重组弱毒疫苗株具备作为疫苗株的高效、低毒的特点，是良好的疫苗候选毒株，可用于鸡传染性法氏囊病的防控。
文档编号C12N15/40GK101935637SQ201010215328
公开日2011年1月5日 申请日期2010年6月29日 优先权日2010年6月29日
发明者王永强, 王笑梅, 祁小乐, 秦立廷, 高宏雷, 高玉龙, 高立 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所