表达禽流感病毒H9亚型HA蛋白的重组新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株的制作方法

专利名称：表达禽流感病毒H9亚型HA蛋白的重组新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种表达编码 禽流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋白的基因的重组新城疫LaSota弱毒 疫苗，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗是rL-H9HA。本发明还公 开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota 弱毒疫苗在制备预防禽流感和新城疫的双价疫苗中的应用。
背景技术：
世界动物卫生组织(OIE)规定的A类传染病中，包括两种禽类烈性 传染病，分别为高致病性禽流感和新城疫。高致病性禽流感除H5或H7 亚型AIV以外，还有可感染人的H9亚型AIV，具有更为重要的公共卫生 意义。采用新城疫弱毒疫苗构建防制高致病性禽流感重组病毒活载体疫 苗，可以真正实现一种疫苗预防两种重大疫病。现有禽流感灭活疫苗具安 全、免疫保护效果好的优点，但仍存在着制造成本高、使用相对不便的不 足[1，2，3]。研制高效安全、成本低廉、使用方便的新一代疫苗具有重要的现 实意义。
AIV属于正粘病毒科流感病毒属的A型流感病毒，血凝素(HA)是 禽流感病毒主要的免疫原蛋白，它可诱导机体产生抗体介导的特异性体液 免疫应答，抗HA的抗体可以通过干扰病毒与唾液酸受体的结合或者病毒 囊膜与内吞体膜的融合过程从而中和病毒的感染。
重组新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)可同时诱导体液免 疫、细胞免疫和粘膜免疫[4'5]，是所有疫苗形式中最为理想的免疫方式；经 过多年的临床应用检验，NDV遗传相对稳定，毒株间发生重组及毒力返 强可能性极小，使用安全、方便；NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生 产成本低廉，便于规模化生产。因此，NDV作为疫苗载体具有广阔的应 用空间和巨大的经济意义。
负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基 因组cDNA制造新病毒的过程，其基本过程是①组装完整的病毒基因组 (或重组型基因组)cDNA克隆，5'末端精确地缀于T7启动子后，3'末端 精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7转录终止信号之前，构成基因组 cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动病毒复制必须的转录 相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的 表达质粒(T7启动子) 一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可 细胞；③24-72小时后收获培养上清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡 胚尿囊腔拯救(rescue)病毒。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基 因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system, RGS系统) 可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒。
申请人之前获得授权的中国专利"新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作 系统及其应用"(申请号200510097997.8，申请日2005年9月2日)已经 建立了一种新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统，并且成功拯救 了野生型病毒株，并且为进一步开展新城疫病毒活载体疫苗研制及NDV 病毒相关基础奠定了坚实的基础。

发明内容
针对上述研究背景，本发明人为进一步提高禽流感病毒表达抗原的免 疫原性，构建表达禽流感病毒H9亚型HA免疫原蛋白的重组NDV活载体 二联弱毒疫苗rL-H9HA，通过滴鼻、点眼、肌肉注射甚至饮水、喷雾吸入 等多种途径免疫动物以诱导对禽流感的保护免疫反应，用于禽类新城疫与 禽流感(H9亚型)的预防免疫。
因此，本发明的一个目的是提供一种表达编码禽流感病毒H9亚型血 凝素(HA)蛋白的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗。
在一个实施方案中，所述用于表达HA蛋白的新城疫LaSota弱毒疫苗 是AV1615 (购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC))。
在一个实施方案中，所述禽流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋白的氨 基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
在另一个实施方案中，所述编码禽流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋 白的基因的序列如SEQ ID No. 2所示。
在另一个实施方案中，所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗为rL-H9HA。 本发明还有一个目的是提供本发明的重组新城疫LaSota弱毒疫苗在
制备预防禽流感和新城疫的双价疫苗中的应用。
本发明还有一个目的是提供一种生产本发明的重组新城疫LaSota弱
毒疫苗的方法，该方法包括
(1) 构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码禽流感病毒H9亚 型HA蛋白的基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗的基因组cDNA序列；
(2) 构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫 LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota 弱毒疫苗的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒 疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；
(3) 将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫丄aSota弱毒 疫苗复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；
(4) 收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重 组病毒株。
在一个实施方案中，其中所述转录质粒是pBRN-FL-H9HA。 在另一个实施方案中，所述转录辅助质粒是质粒pBSNP、 pBSP和 pBSL。
在另一个实施方案中，所述宿主细胞是稳定表达T7聚合酶的细胞系。
本发明还有一个目的是提供根据本发明的方法制备的重组新城疫 LaSota弱毒疫苗rL-H9HA。
本发明以我国广泛使用的一株新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株 (AV1615,商购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，CVCC)为载体， 通过反向遗传操作技术，构建了表达A/Chicken/Shandong/07/2/H9N2 (SD/07)分离株裂HA基因重组NDV LaSota疫苗株，经临床试验证实可 以保护SPF雏鸡免受H9N2强毒株的攻击，为防制禽流感和新城疫的多联 /多价重组基因工程活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。
更具体地，本发明在现有技术已知的新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株 反向遗传操作系统(参见ZL200510097997.8)的基础上，构建了表达H9
亚型禽流感病毒HA基因的重组NDV基因组cDNA克隆，经间接免疫荧 光鉴定成功拯救重组病毒rL-H9HA。重组病毒平均致死时间(MDT) 2168 小时，脑内致病指数(ICPI)和静脉内致病指数(IVPI)均为0。重组病 毒保持了 LaSota弱毒疫苗亲本毒株对鸡胚良好的高滴度生长适应和低致 病特性，并且鸡胚连续传9代次仍保持HA的稳定表达及生物学特性不变。 以1X106EID5Q (半数感染量(EID5Q))病毒量接种SPF雏鸡，免疫后21d 对鸡新城疫病毒北京株(F48E9)的致死性攻击可提供100%的保护，对于 H9亚型禽流感病毒002的攻击，免疫鸡在攻毒后3天的喉头和泻殖腔拭 子病毒分离阳性率为1/10， 5天时喉头一例阳性，其余为阴性。而对于H9 亚型禽流感病毒FJ株的攻击，仅3天的喉头拭子一例阳性，其余为阴性。 免疫组病毒的分离率显著低于对照组。重组病毒rL-H9HA具有作为同时 预防H9亚型禽流感和新城疫的双价苗的应用前景。


图1.新城疫病毒重组H9亚型HA基因组cDNA的构建。空白矩形框 代表NDV LaSota基因，HA基因为灰色阴影矩形，经Pme I位点插入 rLaSota-HA载体，图上部为HA基因开放阅读框，大括号表示插入外源基 因的核酸序列，边框部分表示基因起始信号和基因终止信号序列，基因间 隔序列见标示，HA基因起始密码子ATG和终止密码子TAA以下划线标 示，HA基因其余部分用逗点表示，Kozak序列用斜体表示；
图2.重组病毒RT-PCR检测结果。1为重组病毒接种SPF鸡胚尿囊液 RT-PCR结果，2为DNA分子量标准；
图3.重组病毒感染BHK细胞HA基因表达的检测。重组病毒感染 BHK-21细胞，A-C为rLaSota感染组，D-F为rL-H9HA感染组，A， D组以 抗NDV血清为一抗，B,E组以抗H9N2 AIV为一抗，C，F以SPF鸡阴性 血清为一抗进行免疫荧光检测；
图4. pBRN-FL-Pmel的质粒图谱；
图5. pBRN-FL-H9HA的质粒图谱；
图6.质粒pBSNP的序列，带下划线的斜体部分是NP基因的编码序
图7.质粒pBSP的序列，带下划线的斜体部分是P基因的编码序列；
图8.质粒pBSL的序列，带下划线的斜体部分是L基因的编码序列； 图9.质粒pBRN-FL-H9HA的全序列。
具体实施例方式
下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本 发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具 体限定。
实施例1表达禽流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋白的重组新城疫LaSota 弱毒疫苗的构建和生物学活性
1材料与方法
1.1细胞和病毒
BHK-21细胞(ATCCCCL-IO)，培养基为含10%胎牛血清的DMEM; H9亚型禽流感毒株A/Chicken/Shandong/07/2/H9N2 (SD/07)商购自中国 农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室；攻毒试验用鸡新城 疫病毒北京株(F48E9)商购自中国兽医药品监察所；稳定表达T7聚合酶的 重组痘病毒vTF7-3 (ATCC， VR-2153)购于ATCC;新城疫血凝抑制试验 (HI)诊断抗原由哈尔滨维科生物技术开发公司生产并提供；H9亚型禽 流感病毒高免血清和H9亚型禽流感血凝抑制试验(HI)诊断抗原商购自 国家禽流感参考实验室。鸡抗NDV高免性血清和SPF阴性血清购自中国 兽医药品监察所。
1.2主要试剂和仪器
FITC标记的兔抗鸡荧光二抗购自Sigma公司。工具酶均购自TaKaRa 公司。RNA提取试剂Trizol，鼠源反转录酶(MLV)试剂盒，无血清培养 基Opti-MEM I 、磷酸钙转染试剂盒以及胎牛血清均购自Invitrogen公司， TPCK (甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮)处理的胰酶购自Sigma公司(Sigma, Cat井T8802)。质粒中量提取试剂盒购自QIAGEN公司。普通显微镜与荧 光显微镜，分别购自Leica公司。PCR仪购自MJ Research公司。核酸测采用BECKMAN CEQ 8000自动测序仪，所用试剂为BECKMAN公司 产品。P2级生物安全柜购LABCONCO自公司。不同型号离心机均购自 BECKMAN公司。-70卩超低温冰箱购自NBS公司。各种规格细胞培养瓶 及细胞培养板均购自CORNING公司。 1.3试验动物
9-U日龄SPF鸡胚和0-8周龄SPF鸡均购自中国农业科学院哈尔滨兽 医研究所实验动物中心。所有SPF鸡感染及免疫实验均在哈尔滨兽医研究 所实验动物中心提供的负压隔离器中进行。
1.4引物
试验中所用引物见表l。
表l克隆质粒构建所用到的引物
引物名引物序列
^_
H9HA- 5' - GACTGTTTAAACfTTAGAAAAA^jX^GGTAGAA^:CAGTTGTGCC4C
PF ATGGAAACAGTATCACTAATAAC — 3'
H9HA- 5' — GCGCGTTTAAACTTATATAC AAATGTTGC ATCTGC 3'
^_
注下划线部分为病毒特异序列，黑体表示酶切位点，Kozak序列用 斜体表示，基因起始信号和基因结束信号用字符边框表示。 1.5病毒基因组RNA的提取、反转录和PCR
取H9亚型禽流感毒株A/Chicken/Shandong/07/2/H9N2 (SD/07)接种 SPF鸡胚，2天后收取病毒尿囊液备用。提取RNA并进行反转录，产生病 毒HA基因的cDNA。 PCR在Pfu高保真DNA聚合酶作用下进行，按试
剂盒说明书方法进行。
1.6表达HA基因的全长cDNA克隆的构建
以SD/07病毒的cDNA为模板，以引物H9HA-PF和H9HA-PR进行 PCR反应，扩增出HA片段，在HA基因ORF的5'端引入尸w"限制酶识 别序列和NDV自身聚合酶L识别的转录终止序列GE(TTAAGAAAAAA) 及转录起始序列GS (ACGGGTAGAA)，在HA的ORF的3'端引入尸we I 限制酶识别序列，并确保重组基因组cDNA全长总碱基数仍保持6的倍数。
PCR产物经凝胶电泳回收后平端克隆到pBlueScript载体(Clontech)的 五coi V位点，克隆产物为pBS-H9HA。经测序无误后，pBS-H9HA经尸me I处理，回收HA片段，并与同样经Pme I酶切的pBRN-FL-PmeI问(葛金 英，温志远，王永，等。表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建[J].微 生物学报，2006， 46(4):547 551)(病毒基因组转录质粒pBRN-FL-Pmel，含 有新城疫病毒的基因组全长cDNA，质粒图谱见图4)连接，构建表达HA 基因的重组基因组cDNA的pBRN-FL-H9HA (其全序列见SEQ ID No. 3， 质粒图谱见图5)。
1.7重组病毒的拯救
如ZL200510097997.8或参考文献[6]所述，将表达新城疫病毒(基因 组序列GenBank登录号AY845400)的核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)及 大聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框架(ORF) cDNA分别紧接着克隆 在pBlueScript载体(Clontech)质粒T7启动子下游，分别构建转录辅助 质粒pBSNP， pBSP禾npBSL (序列分别如图6至8所示)。将表达H9HA 的重组基因组全长cDNA克隆质粒pBRN-FL-H9HA与三个辅助质粒 pBSNP、 pBSP和pBSL共转染预先感染vTF7-3的BHK-21细胞拯救重组 病毒，详细过程参见参考文献[6]。收获鸡胚尿囊液进行HA及NDV抗血 清HI检验，阳性样品分装后，-701:冻存，用于重组病毒鸡胚半数感染量 (EID5Q)的测定、连续传代、致病性、生物学特性及免疫原性试验。
1.8 RT-PCR鉴定及序列测定
不同代次重组病毒HA外源基因裂解位点的序列分析取拯救重组病 毒250 juL，用Trizol RNA提取试剂盒提取病毒RNA，用上游引物Ph ATGGAAACAGTATCACTAATAAC 和下游引物 P2 : TTATATACAAATGTTGCATCTGC，进行RT-PCR方法扩增H9亚型禽流感 病毒HA基因部分片段，对扩增的PCR产物进行序列分析。
1.9间接免疫荧光检测(IFA)
鸡胚尿囊腔接种扩增重组病毒尿囊液以DMEM适当倍数稀释，按感 染复数MOI约为1 、 100 体积感染生长于24孔板的BHK-21细胞，37 °C ， 孵育l小时后弃去培养液，然后加入完全DMEM继续培养，20小时后用 冰冷3%多聚甲醛室温固定细胞20分钟，含0.05%Tween 20的磷酸盐缓
冲液(PBST)洗细胞后用15^BSA进行封闭1小时后，以1:100稀释鸡抗 NDV高免血清和抗H9N2 AIV高免血清(商购自中国农业科学院哈尔滨 兽医研究所)作为一抗，同时设相同稀释倍数的NDV高免血清和SPF阴 性血清为对照进行间接免疫荧光检测。
2.结果
2.1表达H9HA基因的NDV全基因组cDNA克隆的构建和重组病毒的拯 救
经PCR方法，在HA基因两端引入GE、 GS禾口尸meI酶切位点，构建 成的克隆质粒命名为pBS-H9HA。 pBS-H9HA经尸we I酶切处理后回收， 并进一步亚克隆连入同样经尸we I酶切处理过的pBRN-FL-Pmel上，构建 成表达HA基因的重组NDVcDNA克隆质粒pBRN-FL-H9HA (图1)。
为了从克隆的cDNA中拯救感染性重组NDV，首先将 pBRN-FL-H9HA与表达NDV NP、 P、 L蛋白的辅助质粒共转染BHK-21 细胞。收获转染细胞上清接种于9一11日龄的SPF鸡胚。4天后收获血凝 (HA)和血凝抑制(HI)试验呈阳性结果的鸡胚尿囊液。收获的阳性病 毒尿囊液作为拯救重组病毒的F1代。进一步的RT-PCR (图2)及序列分 析结果显示，重组病毒基因组带有HA基因，和预期完全相符。结果表明， 通过反向遗传操作技术，利用疫苗株基因组cDNA克隆成功拯救具有感染 性的子代病毒rL-H9HA (也称为rLaSota-H9HA)。
2.2间接免疫荧光试验(IFA)
rL-H9HA重组病毒感染细胞以NDV高免血清(图3D)和H9N2 AIV 高免血清(图3E)为一抗的细胞孔内均观察到强荧光信号；不表达HA基 因的rLaSota病毒(按照ZL200510097997.8制备)感染细胞以NDV高免 血清(图3A)为一抗的细胞孔内观察到同样的荧光信号(图3A)，用H9N2 AIV高免血清为一抗检测rLaSota感染细胞不能观察到阳性反应(图3B)， rLaSota和重组病毒rL-H9HA感染细胞以SPF血清为一抗的间接免疫荧光 染色结果为阴性(图3C、 F)。
实施例2 rL-H9HA重组病毒的致病性试验和对雏鸡的免疫试验
1. 材料与方法
材料、仪器同实施例1。 1.1重组病毒的致病性试验
重组病毒rL-H9HA的鸡胚平均致死时间(MDT)、雏鸡脑内致病指 数(ICPI)及鸡静脉内致病指数(IVPI)等致病性试验按O丄E.标准进行"'21。 1.2重组病毒对雏鸡的免疫试验
为了评价重组病毒对SPF雏鸡的免疫保护效果，鸡胚扩增尿囊毒以 2xl(^EID5o剂量经滴鼻加点眼途径分别人工免疫12羽7日龄白色来亨SPF 鸡雏(商购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)，另设非免疫对照组8 羽；免疫组和非免疫对照组分别饲养于空气负压过滤隔离器中。免疫后19 天翅静脉采血分离血清按常规检测NDV特异血凝抑制(HI)抗体，用H5 亚型禽流感病毒4单位抗原测定血凝抑制(HI)抗体，免疫后21天用强 毒F48E9以及H5N1亚型禽流感同源或异源病毒分别进行攻击，观察两周， 统计发病与死亡情况。
攻毒后3、 5、 7天采集喉头拭子和泻殖腔拭子，对于鸡则采集死亡当 天的拭子，棉拭子采集后在9-11日龄SPF鸡胚中进行病毒滴定。具体操 作为在采集喉头和泻殖腔拭子样品中直接加入lmL冰上预冷的灭菌PBS (每毫升PBS含1000单位青霉素和1000单位链霉素)，摇动混匀，然后 以4000 rpm/min低速离心5分钟。上清样品进行10倍系列稀释，各稀释 度经尿囊腔途径接种9-11日龄SPF鸡胚4枚。孵化48小时后，收集鸡胚 尿囊液，进行血凝试验(HA)。
2. 结果
2.1重组病毒的致病性试验
重组病毒rL-H9HA尿囊液鸡胚平均致死时间(MDT)大于168小时。 重组病毒在SPF鸡胚上进行传代，各代次病毒对鸡均不表现出致病性，对 6周龄SPF鸡静脉内致病指数(IVPI)与野生型亲本LaSota疫苗株完全一 致，在感染后IO天内没有出现任何发病症状，也没有死亡，IVPI值均为
0。对新生雏鸡的脑内致病指数(ICPI)由亲本LaSota的0.4下降为0，说
明病毒重组后被进一步致弱。
2.4重组病毒对SPF雏鸡的免疫攻毒保护试验
采用rL-H9HA毒株和rLaSota毒株，分别以2xl06EID5()剂量经滴鼻加 点眼途径分别人工免疫30羽4周龄白色来亨SPF鸡雏，另设非免疫对照 组10羽，免疫后三周，采集血清，测定HI抗体，结果rLaSota-HA免疫 后三周平均HI抗体滴度可以达到41og2以上。
免疫后三周，每组平均分成3组，其中2组分别用H9N2 AIV SD/02 和FJ/04株(都由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验 室提供)1021^5。剂量经鼻腔途径进行攻击。重组病毒免疫雏鸡攻毒后均 未出现任何临床症状和死亡，攻毒后3、 5天分别采集喉头及泻殖腔拭子， 接种9-11日龄SPF鸡胚进行病毒分离滴定，重组病毒免疫组攻毒后病毒 排放检测结果阳性率《90%，远低于rLaSota免疫组和非免疫对照组病毒 分离阳性率。
最后一组与对照组用NDV强毒F48E9以105ELD5()的剂量，经肌肉注 射途径进行攻击。重组病毒和rLaSota免疫雏鸡攻毒后未出现任何临床症 状和死亡，而非免疫对照组6只鸡在攻毒后3天全部死亡，未进行喉头和 泻殖腔拭子病毒分离试验。试验结果说明HA重组新城疫病毒rL-H9HA 对免疫鸡提供了完全保护(表2)。
表2 rL-H9HA重组病毒对SPF鸡的免疫保护试验
组a攻击病毒 在不同天数从泄殖腔拭子上分离的病毒shedding/总数 存活/总数
(logI0EID50)'
第3天第5天
喉头泄殖腔喉头泄殖腔
rL-H9HASD/021/10(2.5)1/10(1.25)1/10(1.25)0/1010/10
rLaSotaSD/024/6(1.56)0/62/6(0.5)0/66/6
rL-H9HAF48E9NDNDNDND10/10
rLaSotaF48E9NDNDNDND6/6
对照'F48E9NDNDNDND0/6
rL-H9HAFJ/041/10(2.5;)0/100/100/1010/10
rLaSot3FJ/046/6(3.75)3/6(0,5)6/6(2.75)1/6(0.5)6/6
a. 实验组SPF鸡以1(^EID5。的剂量，经滴鼻点眼途径接种rL-H9HA双价苗，每只鸡100nL,免疫后3周分别攻击 1()5EID5。的H9N1或是105ELDso的F48E9。
b. 攻毒后3天、5天采集攻毒SPF鸡喉头和泄殖腔拭子。
c. 对照鸡均为SPF鸡。
禽流感病毒跨越种间障碍传播的机率在逐渐加大，HPAIV(H5、 H7、 H9亚型)感染人和其它哺乳动物的报道屡见不鲜，这加重了人们对流感大 流行发生的担忧。疫苗接种作为控制流感的一种主要手段，历来受到人们 的高度关注。自1997年人们便开始研究可能用于预防流感大流行而使用 的各种疫苗，但流感病毒变异频繁，血清型众多，而且型间无交叉保护， 这给疫苗的研制造成了很大困难。目前，处于不同实验室研究阶段的流感 大流行疫苗主要是针对.H5N1和H7N7及H9N2的全病毒灭活疫苗、重配 全病毒灭活疫苗、禽痘载体疫苗等，生产成本和技术难度限制了疫苗的广 泛应用，研制新型禽流感疫苗成为众多科研工作者的焦点。
新城疫病毒作为载体表达外源蛋白是近年迅速发展起来的一项新技 术。Plase.P采用高度致弱的Bl株为载体，构成H7AIV重组新城疫病毒 疫苗株，结果一次免疫雏鸡，对新城疫强毒和H7亚型高致病力禽流感病 毒(HPAIV)的致死攻击的保护率仅为40%[4]。通过对F基因裂解位点的 修饰，提高B1株的致病力，结果对NDV强毒和HPAIV的致死性攻击保 护率分别达到100%和90%[7]。我们采用与Palese相似的策略，将H9 HA 基因插入基因组P和M基因之间，重组病毒诱导出高水平H9特异HI抗 体反应。尽管ICPI由重组前的0.4降为0，但一次免疫雏鸡，对新城疫强 毒的致死性攻击的保护率为100%，对H9 AIV的攻击可大大降低免疫鸡 的排毒率以及排毒量。
重组新城疫病毒表达流感病毒HA糖蛋白可以被动的装配到NDV病 毒粒子表面，有可能发挥其相应的生物学功能[5'8]。 HA裂解位点是决定 AIV高致病特性的分子基础。为此，构建了表达裂解位点连续疏水碱性氨 基酸删除的突变型HA基因的重组NDV。
重组新城疫LaSota疫苗株能够一过性感染BHK-21等部分哺乳动物细 胞系[9]，可在细胞内有效复制、装配释放出成熟病毒粒子，同时表达重组 的外源抗原蛋白H5亚型禽流感HA蛋白，并导致细胞圆縮等细胞病变。 但在培养液缺乏特定蛋白酶情况下，释放出的重组病毒粒子表面F蛋白不
能有效裂解为Fl和F2亚单位，难以维持持续感染。因而，感染后24 36小时进行新城疫病毒抗原及禽流感病毒H5亚型HA抗原的免疫荧光检 测，通过比较新城疫病毒和H5亚型禽流感病毒HA特异荧光阳性细胞的 数量，可准确判断疫苗组成病毒的纯粹性和外源重组HA抗原表达的遗传 稳定性。
重组新城疫病毒作为活毒疫苗不仅可诱导强烈的细胞免疫反应，而且 可通过滴鼻、点眼等粘膜途径直接给苗，对诱导粘膜免疫极为有利。我们 在研究中发现，雏鸡个体间对HA抗原的HI抗体反应能力存在着较大差 距。rL-H9HA (SD)以106EID5Q常规剂量免疫后，个体间新城疫特异HI 抗体反应显著，差别较小，但少数雏鸡个体间的H9禽流感特异HI抗体水 平则差别显著，可以为11og2、 21og2甚至阴性，但这些雏鸡往往对H9亚 型禽流感病毒的攻击仍然可以形成保护，攻毒后不发病，攻毒后第3、 5 天喉头及泄殖腔排毒检测绝大部分仍为阴性，这些现象表明以新城疫为载 体的疫苗其细胞免疫和粘膜免疫机制发挥了极为关键的免疫保护作用。
新城疫病毒反向遗传操作系统的成功建立使之成为研究外源蛋白生物 学活性的完美表达载体，而作为禽病疫苗载体更具有绝对优势。新城疫病 毒作为弱毒苗在生产实践中应用多年，具有良好的安全性和有效性。适应 鸡胚生长，滴度高，便于大量生产，成本低。如果能够部分替代禽流感灭 活疫苗的使用，不仅减轻生产压力，更能节约大量的国家财政开支。
参考文献丄ipatov A. S., Webby R. J., Govorkova E. A. " a/ Efficacy of H5 influenza vaccines produced by reverse genetics in a lethal mouse model, J. Infect. Dis[J], 2005,191:1216-1220..Nwanegbo E., Vardas E., Gao W. a/ Prevalence of neutralizing antibodies to adenoviral serotypes 5 and 35 in the adult populations of The Gambia, South Africa, and the United States. Clin. Diagn. Lab. Immunol[J],2004,ll:351-357. [3].Check E, Avian flu special: is this our best shot Nature[J],2005,435:404-406, [4].Swayne D.E, Suarez D丄,Schultz-Cherry S. " a/ Recombinant Paramyxovirus Type 1-Avian Influenza-H7 Virus as a Vaccine for Protection of Chickens Against Influenza and Newcastle Disease .AVIAN DISEASES[J],2002,47:1047-1050.Nakaya T., Cros J., Park M.-S." a/ Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. J. Viro肌2001,75:l聽-11873..葛金英，温志远，王永，等。表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒LaSota疫苗株的 构建[J].微生物学报，2006， 46(4) :547 551..Park M.S., Steel丄,Garcia-Sastre A. W <a7 Engineered viral vaccine constructs with dual specificity:Avian influenza and Newcastle disease[J],Proc.Natl.Acad.Sci.2006.103 : 8203-8208..Veits J, Wiesner D, Fuchs W. "/ Newcastle disease virus expressing H5 hemagglutinin gene protects chickens against Newcastle disease and avian influenza[J],Proc.Natl.Acad.Sci.2006.103: 8197-8202..Martine-Sobrido L., Gitiban N., Fernandez-Sesma A. W Protection aginst Respiratory Syncytial Vims by a Recombinant Newcastle Disease Virus Vector. J. Virol[J]， 2006,1130-1139.序列表
<110〉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
〈120〉表达禽流感病毒H9亚型HA蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株 〈130〉 IB085346 <160〉 2
<170> Patentln version 3. 1
〈210> 1 〈211> 560 〈212> PRT
<213〉 禽流感病毒H9亚型 〈400〉 1
Met Glu Thr Val Ser Leu lie Thr Met Leu Leu Val Val Thr Val Ser
15 10 15
Asn Ala Asp Lys lie Cys lie Gly Tyr Gin Ser Thr Asn Ser Thr Glu
20 25 30
Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Ala Lys
35 40 45
Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Asn Leu
50 55 60
Gly His Pro Leu lie Leu Asp Thr Cys Thr lie Glu Gly Leu lie Tyr 65 70 75 80
Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Leu Leu Gly Gly Arg Lys Trp Ser Tyr
85 90 95
lie Val Glu Arg Pro Ser Ala Val Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn
100 105 110
Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Ser Leu Phe Ser Ser Ala Ser Ser 115 120 125
Arg lie Gin lie Phe Pro Asp Thr lie Trp Asn Val Ser Tyr
140
Tyr Arg Ser
Tyr Gin 130
Ser Gly Thr Ser Lys 145
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Phe 135
Cys Ser Asp Ser
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Asn Asn Ala Tyr
Lys 165
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Ser Val Ala Thr
Phe Tyr Arg Ser Met Arg
155 160
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170 175
Phe Met Trp Gly lie Asn His
Leu 185
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Gly Asn His Gly
Leu 245
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275
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Gin Cys 290
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Ser Gly Leu Val Ala Gly 355
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Gly lie 320 Lys Ser 335 Gly Gly Trp 350
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Gly Val Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gin Lys Ala lie Asp
370 375 380
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Tyr Glu lie lie A印His Glu Phe Ser Glu Val Glu Thr Arg Leu Asn
405 410 415
Met lie Asn Asn Lys lie Asp Asp Gin lie Gin Asp lie Trp Ala Tyr
420 425 430
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435 440 445
His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu
450 455 460
Gly Ser Asn Ala Val Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His 465 470 475 480
Lys Cys Asp Asp Gin Cys Met Glu Thr lie Arg Asn Gly Thr Tyr Asn
485 490 495
Arg Arg Lys Tyr Gin Glu Glu Ser Lys Leu .Glu Arg Gin Lys lie Glu
500 505 510
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515 520 525
Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val lie Ala Met Gly Phe Ala Ala Phe
530 535 540
Leu Phe Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn lie Cys lie 545 550 555 560
〈210〉 2
<211> 1683
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〈213〉 禽流感病毒H9亚型
〈400> 2
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168权利要求
1. 一种表达编码禽流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋白的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗。
2. 根据权利要求1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其中所述用于表 达HA蛋白的新城疫LaSota弱毒疫苗是AV1615。
3. 根据权利要求1或2的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其中所述禽 流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo. 1所示。
4. 根据权利要求3的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其中所述编码禽 流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋白的基因的序列如SEQIDNo.2所示。
5. 根据权利要求1-4中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其为 rL-H9HA。
6. 根据权利要求1-5中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备 预防禽流感和新城疫的双价疫苗中的应用。
7. —种生产权利要求1-5中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗的 方法，该方法包括(1) 构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码禽流感病毒H9亚 型HA蛋白的基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗的基因组cDNA序列；(2) 构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫 LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota 弱毒疫苗的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒 疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；(3) 将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫LaSota弱毒 疫苗复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；(4) 收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔拯救重 组病毒株。
8. 根据权利要求7的方法，其中所述转录质粒是pBRN-FL-H9HA。
9. 根据权利要求7的方法，其中所述转录辅助质粒是质粒pBSNP、 pBSP禾卩pBSL。
10. 根据权利要求7-9中任何一项的方法制备的重组新城疫LaSota弱 毒疫苗，优选为rL-H9HA。
全文摘要
本发明涉及一种表达禽流感病毒H9亚型血凝素(HA)蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗是rL-H9HA。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防禽流感和新城疫的双价疫苗中的应用。
文档编号A61P31/14GK101376027SQ20081022277
公开日2009年3月4日 申请日期2008年9月24日 优先权日2008年9月24日
发明者步志高, 葛金英, 陈化兰 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所