专利名称：复合定量聚合酶链反应检测禽流感和新城疫病毒的方法
技术领域：
本发明属于禽类感染病毒的检测技术，是一种判定禽类或其他产品是否感染禽流感病毒和新城疫病毒的新的方法。
背景技术：
禽流感和新城疫是波及全世界的两种重大禽类传染病。
禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)属正粘病毒科、流感病毒属，是单股负链RNA病毒，螺旋对称，有囊膜，囊膜上有含血凝素和神经氨酸酶活性的糖蛋白纤突。流感病毒有3个抗原性不同的型A、B和C型。所有的禽流感病毒都属于A型病毒，能引起禽类从呼吸系统到严重全身性败血症等多种症状。根据血凝素和神经氨酸酶的抗原差异将禽流感病毒(AIV)毒株分为15个HA亚型和9个NA亚型，我国报道的AIV血清亚型主要是H9、H5、H7和H14。由于AIV核酸分节段，基因极易发生突变或重排，AIV的高度变异性使得对禽流感的控制极为困难。禽流感的临床症状和病理变化因感染禽的种类、年龄、病程长短、并发感染及感染毒株毒力等不同而表现不同，且无特征性症状和剖检变化。这使得禽流感病毒的检测极为困难。
新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)可引起禽类的一种以呼吸道、消化道粘膜出血为典型症状的急性传染病。新城疫病毒属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、腮腺炎病毒属。禽副粘病毒共有9个血清型，即PMV-1至PMV-9，其中新城疫病毒(NDV)是禽副粘病毒1型(APMV-1)的主要成员。试验表明有250多种鸟类可被NDV感染，其危害和引发的后果极其严重。1999年农业部发布的动物疫病目录中将其列为I类疫病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类疫病。
本发明在做出之前，对禽流感病毒和新城疫病毒的检验检疫方法，世界动物卫生组织(OIE)规定其方法包括病毒的分离鉴定、琼脂凝胶免疫扩散试验、血凝和血凝抑制试验等。
病毒的分离与鉴定首先将样品接种至无特定病原的鸡胚，病毒会随着鸡胚的发育而增殖，经一星期后抽取鸡胚的尿囊液，进行血凝和血凝抑制试验，从而可以判定检测样本中是否含有病毒。该方法的优点是灵敏度高，但是周期长，约需21天，而且工作量大，需要大量的人力物力。
琼脂凝胶免疫扩散试验最早由Oudin于1946年进行对抗原混合物进行分析。基本原理是在一定孔径的凝胶中，当抗原与抗体分子相遇时，形成抗原抗体复合物，若两者比例适当，则复合物分子量增大，颗粒增大，不再继续扩散而产生沉淀线。不同的抗原所形成的沉淀有各自的位置，从而可以将抗原分开。该方法的优点是简单易行，不需要特殊仪器，但是由于抗体分子与抗原决定簇的结合并不总是一对一的，而且，由于离子强度、pH等因素，致使该方法的特异性较低。
血凝和血凝抑制试验其基本原理是某些病毒或者病毒的血凝素，能选择性的使几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝。当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，成为血凝抑制反应。该方法的优点是简单快速，但是由于它检测的是病毒抗体，而抗体必须在感染后相当一段时间内才能产生，因此，该方法的应用范围受到限制。
上述方法因敏感性、特异性、确诊时间过长或环境污染等问题，很难满足进出口贸易中快速、敏感、特异、经济的需求。
技术内容本发明的目的是建立一种敏感、特异、快速、准确的检测方法，并应用于禽流感病毒和新城疫病毒的检验检疫，以提高检测方法的敏感性、特异性，缩短检测时间，降低检测成本，保护和促进我国畜牧业和对外贸易的发展。
本发明是按以下技术操作方案完成的设计并合成检测禽流感和新城疫病毒的特异性荧光标记引物，采集样本并提取样本的RNA，接着制备复合PCR反应液，之后将反应液放入定量PCR仪进行反转录和PCR扩增反应，最后分析数据、进行结果判断，并进行检测方法的特异性分析和灵敏度分析。
设计并合成检测禽流感病毒和新城疫病毒的荧光引物是根据禽流感病毒的核蛋白(NP)基因和新城疫病毒的融合蛋白基因(F)的序列设计的，并进行了荧光标记；引物及标记荧光分别为禽流感病毒正链引物5′-GCTTGTCCTC TGGTATGTGG C-3′负链引物5′-GACCAGGGAG AAGACGCAAC TGCTGGC[JOE]-3′新城疫病毒正链引物5′-GAGCATTGCG GCAACCAATG AA-3′负链引物5′-CACGGTCCAA TTCTCGCGCC G[FAM]G-3′.
采集的样本为活禽的咽喉拭子或者泄殖腔拭子、肌肉或脏器，也可以是血清、血浆和冷冻组织渗出液。
提取所分析样本的RNA采用Trizol裂解液裂解样本，氯仿抽提，异丙醇沉淀的方法制备样本的RNA。
制备复合RT-PCR反应液即混合各种PCR反应成分，包括RT-PCR缓冲液，禽流感引物，新城疫引物，RNA溶液，RNA酶抑制剂，水。混合方法为将一定量的上述各成分加入一个PCR反应管中，混匀。复合PCR反应液包括两层含义第一，RT-PCR缓冲液中包括反转录酶和DNA聚合酶，可以在一个体系中进行反转录及PCR扩增反应；第二，在一个反应体系中加入了禽流感引物和新城疫引物，可以分别扩增禽流感病毒的核蛋白(NP)基因和新城疫病毒的融合蛋白基因(F)。
将反应液放入定量PCR仪进行反转录和PCR扩增反应。采用双通道荧光定量PCR仪，经过开机、打开SDS应用软件、新建反应文件、设定荧光引物、设置反应参数等程序，启动反转录和PCR扩增反应。
数据分析及结果判定是利用定量分析软件SDS 2.1分析数据，判定结果。方法为以熔解曲线为判定依据来判定检测样本中是否含有禽流感病毒和新城疫病毒。
以熔解曲线为判断标准若熔解曲线在75.5℃±1℃处有吸收峰，并且吸收峰信号强度大于阳性对照吸收峰信号的1/3，则判定检测样本含有禽流感病毒；若熔解曲线在78℃±1℃处有吸收峰，且吸收峰信号强度大于阳性对照吸收峰信号的1/3，则判定检测样本含有新城疫病毒；若熔解曲线在75.5℃±1℃处及78℃±1℃处都有吸收峰，则两种病毒都含有；若在两个位置都没有吸收峰，则两种病毒都不含有。
进行检测方法的特异性分析和灵敏度分析分别提取NDV不同毒株、AIV不同毒株以及IBV、IBDV的RNA进行复合定量RT-PCR反应，以确定检测方法的特异性。通过体外转录获得含目的片段的RNA，进行10倍系列稀释，定量RT-PCR反应，通过软件分析得出标准曲线，以确定检测方法的灵敏度。
本发明与已有技术对比其特点是1、所使用的引物是单一荧光标记，它比双荧光标记的Taqman探针可以节约成本。其原理是寡核苷酸的一级和二级结构对所结合的荧光染料的荧光发射性能有影响，引物具有自身荧光淬灭性能，当它与靶序列配对后，其荧光就会恢复。
2、该反应是复合检测体系，包含两层含义第一，RT-PCR反应缓冲液中包括反转录酶和DNA聚合酶，可以在一个体系中进行反转录及PCR扩增反应；第二，在一个反应体系中加入了禽流感引物和新城疫引物，可以分别扩增禽流感病毒的核蛋白(NP)基因和新城疫病毒的融合蛋白基因(F)。
3、简便快速。利用该方法，从提取核酸到最后结果判定，仅需要4小时。不需传统RT-PCR的扩增后处理与结果判定，因而避免了环境污染。
4、灵敏度高。该体系能够检测出的AIV基因拷贝数最低为40个，NDV基因拷贝数最低为79个。
5、结果判定准确，可靠性高。判断结果时，通过熔解曲线作为判断标准，PCR产物的特异性决定Tm值特定，因此可以准确判定检测样本中是否含有禽流感病毒和新城疫病毒，排除由于非特异性扩增导致的假阳性结果。
图1禽流感病毒阳性、新城疫病毒阴性检测样本的熔解曲线1JOE波长的熔解曲线，2FAM波长的熔解曲线，对应的Tm值为75.5℃
图2禽流感病毒阴性、新城疫病毒阳性检测样本的熔解曲线1FAM波长的熔解曲线 2JOE波长的熔解曲线对应的Tm值为78℃图3禽流感病毒阳性、新城疫病毒阳性检测样本的熔解曲线1JOE波长的熔解曲线 2FAM波长的熔解曲线对应的Tm值分别为75.5℃、78℃图4禽流感病毒阴性、新城疫病毒阴性检测样本的熔解曲线1JOE波长的熔解曲线 2FAM波长的熔解曲线对应的Tm值分别为73℃、75℃图5该方法的特异性检测的测试图1，2，3，4，5，6，7分别为NDV-L，NDV-I，NDV-S，NDV-PY，NDV-CY，AIV-H5，AIV-H9的“S”型扩增曲线；8，9分别为IBV、IBDV的非“S”型扩增曲线。
图6该方法检测禽流感病毒的灵敏度的测试图1，2，3，4，5，6，7分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的体外转录AIV目的片段的“S”型扩增曲线。
图7该方法检测新城疫病毒的灵敏度的测试图1，2，3，4，5，6，7分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的体外转录NDV目的片段的“S”型扩增曲线。
具体实施例方式
下面通过实施例结合附图详细叙述本发明的复合定量RT-PCR检测禽流感病毒和新城疫病毒的技术方法首先是根据禽流感病毒的核蛋白(NP)基因和新城疫病毒的融合蛋白基因(F)的序列，设计并合成特异性荧光标记引物，之后采集样本并提取样本的RNA，接着制备复合PCR反应液，再将复合PCR反应液放入定量PCR仪进行反转录及PCR扩增，最后分析数据进行结果判断，进行检测方法的特异性分析和灵敏度分析。
1、设计检测禽流感病毒和新城疫病毒的引物从ncbi genbank获得禽流感病毒NP基因(GENBANK AF509118)和新城疫病毒F基因(GENEBANK AF322052)的序列(见核苷酸序列表)，通过InVitrogen公司的LUX引物在线设计软件(网址为www.invitrogen.com/lux)设计LUX引物。LUX引物的原理是寡核苷酸的一级和二级结构对所结合的荧光染料的荧光发射性能有影响，引物具有自身荧光淬灭性能，当它与靶序列配对后，其荧光就会恢复。设计引物的主要步骤为1)、注册首次使用，应注册用户的姓名、单位、地址、E-mail地址、电话信息。
2)、输入序列将禽流感病毒NP基因(见序列表)和新城疫病毒F基因的序列(见序列表)，分别命名，并将其添加到序列框中。根据需要，设置参数范围，本例中设置扩增片段的大小范围为50-200bp，引物的退火温度Tm为60-70℃。
3)、设计选择荧光标记引物软件设计的荧光标记引物位于操作界面的的顶端，并附有引物的名称、序列、在目标序列中的位置、罚分信息。其中，罚分代表该引物在PCR反应中的预期表现，罚分值越低，引物越好。
4)、选择与荧光标记引物搭配的非标记引物每一个荧光标记引物都有对应的非标记引物。根据试验目的，选取一个非标记引物与标记引物组成引物对。
5)、选择荧光标记对于禽流感引物，标记选择JOE，对于新城疫引物，标记选择FAM。
6)、确认引物订购单、交与Invitrogen公司合成。
经过上述设计步骤，选中两对引物，分别为(见核苷酸序列表)禽流感病毒正链引物5′-GCTTGTCCTC TGGTATGTGG C-3′负链引物5′-GACCAGGGAG AAGACGCAAC TGCTGGC[JOE]-3′新城疫病毒正链引物5′-GAGCATTGCG GCAACCAATG AA-3′负链引物5′-CACGGTCCAA TTCTCGCGCC G[FAM]G-3′2、无菌过程采集样本检测样本为活禽的咽喉拭子或者泄殖腔拭子、肌肉或脏器，也可以是血清、血浆和冷冻组织渗出液。
1)、采样器材剪刀、镊子、注射器、1.5mL Eppendorf离心管，必须将他们经过121℃高压灭菌15min并烘干。
2)、检测样本为活禽，取泄殖腔拭子时，将拭子深入动物的泄殖腔转一圈，粘取粪便。将拭子放入盛有2mL PBS(含抗菌素)的试管中充分洗涤，然后在管壁上挤干液体。所得溶液转入无菌离心管中备用。
3)、咽喉拭子取咽喉拭子时，将拭子深入动物的喉头口及上腭裂来回刮几次，取咽喉分泌液，放入盛有2mL PBS(含抗菌素)的试管中充分洗涤，在管壁上挤干液体。所得溶液转入无菌离心管中备用。
4)、肌肉或脏器肌肉或脏器取5g待检检测样本于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10mL PBS混匀，取上清转入无菌离心管中备用。为使检测样本的代表性更强，也可以取50g待检检测样本，加入50mL无菌的PBS，用Bagmixer均质器处理后，取上清备用。
5)、血清、血浆或冷冻组织渗出液若检测样本为血清、血浆或冷冻组织渗出液，则直接用无菌注射器取至Eppendorf离心管中，编号备用。
3、样本RNA的提取取n个(n＝样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)1.5mL灭菌离心管，加入600μL Trizol裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200μL，再加入200μL氯仿，混匀器上震荡混匀5秒钟；于4℃，12000rpm离心15min。吸取上清液500μL，加入400μL-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀。于4℃，12000rpm离心15min，轻轻倒去上清；加入600μL 75％乙醇洗涤沉淀，并室温干燥3min。加入20μL DEPC水，得到RNA溶液，-20℃保存备用(注意此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增)。
4、制备复合PCR反应液将PCR反应各种成分从冰箱取出，2000rpm离心5sec。之后在一个反应管中加入RT-PCR缓冲液12.5μL(内含DNA聚合酶，反转录酶，MgCl2，AmpErase UNG，dNTPs，dUTP)，200nM禽流感引物；200nM新城疫引物；RNA酶抑制剂0.6μL；RNA溶液4μL；补充水至25μL。将各种成分用枪头吹打，混匀。复合PCR反应液包括两层含义第一，RT-PCR缓冲液中包括反转录酶和DNA聚合酶，可以在一个体系中进行反转录及PCR扩增反应；第二，在一个反应体系中加入了禽流感引物和新城疫引物，可以分别扩增禽流感病毒的核蛋白(NP)基因和新城疫病毒的融合蛋白基因(F)。
5、进行反转录和PCR扩增反应反转录和PCR扩增反应及荧光检测使用双通道荧光PCR仪，以ABIPrism7900HT型荧光引物定量PCR仪为例，具体操作有以下步骤1)、开机，并打开SDS应用软件。
2)、新建文件，在文件中填写检测样本名称、复制荧光引物文件(AIV病毒荧光引物的报告基团选用JOE，淬灭基团选None；NDV病毒荧光引物的报告基团选用FAM，淬灭基团选None)。
3)、应用荧光引物在Well Inspector对话框中荧光引物列表的Use项下的方框中，选中禽流感、新城疫两个荧光引物，则仪器自动探测两种荧光信号。
4)、设置反应参数反转录反应参数为48℃30min；PCR反应参数95℃10min；之后进行95℃15sec，62℃1min 40个循环，最后进行熔解曲线分析(95℃15sec，60℃15sec，95℃15sec)。
5)、启动PCR在Instrument窗口点击Open/Close按钮，弹出样品架(在主机的右侧)。把样品板置入托盘，再单击Open/Close按钮，样品架自动收回并关闭上样门。按Start开始实验，开始时有样品架到位、扫描头到位、热盖升温等工作，等待出现Remain Time若干时间后即开始正式运行。
6、数据分析及结果判定实验结束，利用SDS软件分析结果。在SDS软件中，可以选择自动或者手工确定Ct值，如果手工确定，先输入阈值，再选自动或手工设置基线。基线(Baseline)的起点和终点确定原则为由于95℃高温所导致的荧光信号增高，起点要避开前面几个循环，一般设在第6个循环；终点要设在信号明显增高处的前面。根据本实验的数据，基线设定为3-15个循环，点击分析键，之后在结果中查看扩增曲线、熔解曲线等。
结果判定以熔解曲线为判定依据来判定检测样本中是否含有禽流感病毒和新城疫病毒。其中，质量控制标准为禽流感质控标准阳性对照检测结果熔解曲线在75.5℃±1℃处有单一吸收峰(图1)，阴性对照检测结果熔解曲线在75.5℃±1℃处没有吸收峰。
新城疫质控标准阳性对照检测结果熔解曲线在78℃±1℃处有单一吸收峰(图2)，阴性对照检测结果熔解曲线在78℃±1℃处没有吸收峰，。
只有质控标准成立，方可判定检测样本中是否含有禽流感病毒和新城疫病毒。
检测样本若熔解曲线在75.5℃±1℃处有吸收峰，并且吸收峰信号强度大于阳性对照吸收峰信号的1/3，则判定检测样本含有禽流感病毒。若熔解曲线在78℃±1℃处有吸收峰，且吸收峰信号强度大于阳性对照吸收峰信号的1/3，则判定检测样本含有新城疫病毒。若熔解曲线在75.5℃±1℃处及78℃±1℃处都有吸收峰，则两种病毒都含有(图3)；若在两个位置都没有吸收峰，则两种病毒都不含有(图4)。
7、检测方法的特异性测定分别提取NDV-L，NDV-I，NDV-S，NDV-PY，NDV-CY，AIV-H5，AIV-H9、IBV、IBDV的RNA(如实施例3所示)，进行复合定量RT-PCR反应。25ul反应体系主要成分如下RT-PCR反应液12.5μL；200nM禽流感引物，200nM新城疫引物；RNasin 0.6μL；RNA溶液4μL；补充DEPC水至25μL，进行定量PCR反应，并进行数据分析(如实施例第5、第6步所示)。结果见图5。NDV各毒株有典型的扩增曲线，AIV-H5，AIV-H9、有“S”型扩增曲线，而IBV、IBDV没有明显的“S”型扩增曲线。
8、检测方法的灵敏度测定1)、pGEM-N体外转录载体的构建AIV基因和NDV基因阳性质粒目的片段和pGEM-4z载体分别双酶切每管中加入超纯水50μL，10×K buffer 10μL，Bam HI 2.5μL，Eco RI 2.5μL，分别加入阳性质粒目的片段35μL和pGEM载体35μL，总体积100μL。37℃作用3小时。酶切产物电泳鉴定，分别用胶回收试剂盒纯化目的条带。
连接10×T4 DNA ligase buffer 1.0μL，ligase 1.0μL，N蛋白编码基因1.0μL，pGEM-4Z 3.5μL，超纯水3.5μL，总体积10μL。16℃过夜。转化DH5α感受态细胞，涂布于氨苄平板上，37℃培养18小时挑取单个菌落，扩大培养提质粒，Bam HI和Eco RI双酶切鉴定，阳性质粒命名为pGEM-N。
2)、目的基因体外转录及转录产物的纯化在室温条件下，按顺序加下列物质转录优化5×buffer 10uL，100nmDTT 5μL，RNase 1.25μL，rATP、rGTP、rUTP各2.5μL，rCTP(母液稀释10倍)6μL，DNA模板14μL，T7 RNA聚合酶1μL，ddH2O 4.75μL，总体系50uL 37℃-40℃反应1.5h。从各管中吸出5uL，用于电泳鉴定，其余-80℃保存。
阳性对照的组分如下转录优化5×buffer 4μL，100nm DTT 2μL，RNase 0.5μL，rATP、rGTP、rUTP及rCTP各1μL，pGEM阳性对照模板1μL，T7 RNA聚合酶1μL，ddH2O 7.5μL，总体系20μL。
加入RQ1 RNase Free Dnase，使模板RNA浓度达1μL/μg，37℃作用15min，加入1倍体积的TE饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，涡转1min，12000r/m离心2min。取水相于另一EP管中，加入1倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，涡转1min，12000r/m离心2min。取水相于另一EP管中，加入0.5倍体积的7.5M醋酸铵，2.5倍体积的无水乙醇。-70℃放30min.12000r/m离心20min。小心弃上清，用70％乙醇洗沉淀，干燥。用20μL TE或水溶解RNA，-70℃保存备用。用核酸蛋白分析仪测定体外转录产物的OD260吸收值。
3)、荧光RT-PCR反应以确定检测的灵敏度将体外转录的含目的片段的RNA以10倍系列稀释，进行定量RT-PCR检测，以确定检测的灵敏度。25ul反应体系主要成分如下RT-PCR缓冲液(2倍)12.5μL；200nM禽流感引物；200nM新城疫引物；RNA酶抑制剂0.6μL；RNA溶液4μL；补充DEPC水至25μL。AIV、NDV的扩增曲线分别见图6、图7。
根据公式RNA＝OD260×稀释倍数×40×10-6g，计算出每μL转录RNA的质量(设为A)，再根据RNA的分子量(B)，计算出每μL转录RNA溶液中RNA的拷贝数(A/B)。
禽流感病毒的标准曲线为Ct值＝-3.39 1gX+43.18；相关系数R＝0.973；新城疫病毒的标准曲线为Ct值＝-2.88 1gX+42.97；相关系数R＝0.963。
以Ct值＝35为临界值，计算检测禽流感病毒和新城疫病毒的灵敏度分别为40，79个病毒拷贝。
核苷酸序列表<110>青岛出入境检验检疫局<120>复合定量聚合酶链反应检测禽流感和新城疫病毒的方法<160>6<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>1028<212>RNA<213>新城疫病毒(Avulavirus sp.)<220>
<221>CDS<222>(15)...(1028)<400>1atccaagacg caatatgggc tccaaacctt ctaccaggat cccagcacct ctgatgctga 60tcacctggat tatgctgata ttgggctgta ttcgtccgac aagctctctt gacggcaggc120ctcttgcggc tgcaggaatt gtagtaacag gagataaggc agtcaatgta tacacctcgt180ctcagacagg gtcaatcata gtcaagttgc tcccgaatat gcccagggat aaggaggcgt240gtgcgaaagc cccattagag gcatataaca gaacactgac tactttgctc actcctcttg300gcgactccat ccgcaagatc caagggtctg tgtccacgtc tggaggaagg agacaaaaac360gctttatagg tgctgttatt ggcagtgtag ctcttggggt tgcaacagcg gcacagataa420cagcagctgc ggccctaata caagccaacc agaatgctgc caacatcctc cggcttaagg480agagcattgc tgcaaccaat gaagctgtgc atgaagtcac cgacggatta tcacaactat540cagtggcagt tgggaagatg cagcagtttg tcaatgacca gttcaacaat acggcacgag600aattggactg cataaaaatc acacaacagg ttggtgtaga actcaaccta tacctaactg660aattgactac agtattcggg ccacagatca cctcccctgc attaactcag ctgaccatcc720aggcacttta taatttagct ggtggcaata tggattactt attaactaag ttaggtatag780ggaacaatca actcagctca ttaattggta gcggcctgat cactggttac cctatactgt840atgactcaca gactcaactc ttgggcatac aagtgaattt gccctcggtc gggaacttaa900ataatatgcg tgccacctat ttggagacct tatctgtaag tacaaccaaa ggatatgcct960cagcacttgt cccgaaagta gtgacacaag tcggttctgt gatagaagag cttgacacct 1020catactgt1028<210>2
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<213>人工序列<220>
<223>根据PCR反应要求设计，用于扩增禽流感病毒的正链引物。
<400>3GCTTGTCCTC TGGTATGTGG C 21<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据PCR反应要求设计，用于扩增禽流感病毒的负链引物。
<400>4GACCAGGGAG AAGACGCAAC TGCTGGC 27<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
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<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据PCR反应要求设计，用于扩增新城疫病毒的负链引物。
<400>6CACGGTCCAA TTCTCGCGCC G 2权利要求
1.一种复合定量聚合酶链反应检测禽流感和新城疫病毒的方法，其特征在于它的技术操作程序是设计并合成检测禽流感和新城疫病毒的特异性荧光标记引物，采集样本并提取样本的RNA，接着制备复合PCR反应液，之后将反应液放入定量PCR仪进行反转录和PCR扩增反应，最后分析数据、进行结果判断，并进行检测方法的特异性分析和灵敏度分析。
2.根据权利要求1所述的一种复合定量聚合酶链反应检测禽流感和新城疫病毒方法，其特征在于所述的引物是根据禽流感病毒的核蛋白(NP)基因和新城疫病毒的融合蛋白基因(F)的序列设计的，并进行了荧光标记；引物及标记荧光分别为禽流感病毒正链引物5′-GCTTGTCCTC TGGTATGTGG C-3′负链引物5′-GACCAGGGAG AAGACGCAAC TGCTGGC[JOE]-3′新城疫病毒正链引物5′-GAGCATTGCG GCAACCAATG AA-3′负链引物5′-CACGGTCCAA TTCTCGCGCC G[FAM]G-3′。
3.根据权利要求1所述的一种复合定量聚合酶链反应检测禽流感和新城疫病毒方法，其特征在于所述的制备复合PCR反应液，即混合各种PCR反应成分，包括RT-PCR缓冲液、禽流感引物和新城疫引物、RNA酶抑制剂、RNA模板和水；复合PCR反应液包括两层含义第一，RT-PCR缓冲液中包括反转录酶和DNA聚合酶，可以在一个体系中进行反转录及PCR扩增反应；第二，在一个反应体系中加入了禽流感引物和新城疫引物，可以分别扩增禽流感病毒的核蛋白(NP)基因和新城疫病毒的融合蛋白基因(F)。
4.根据权利要求1所述的一种复合定量聚合酶链反应检测禽流感和新城疫病毒方法，其特征在于所述的分析数据、进行结果判断，是以熔解曲线为判断标准，若熔解曲线在75.5℃±1℃处有吸收峰，并且吸收峰信号强度大于阳性对照吸收峰信号的1/3，则判定检测样本含有禽流感病毒；若熔解曲线在78℃±1℃处有吸收峰，且吸收峰信号强度大于阳性对照吸收峰信号的1/3，则判定检测样本含有新城疫病毒；若熔解曲线在75.5℃±1℃处及78℃±1℃处都有吸收峰，则两种病毒都含有；若在两个位置都没有吸收峰，则两种病毒都不含有。
全文摘要
一种复合定量聚合酶链反应检测禽流感和新城疫病毒方法，其操作程序是根据禽流感病毒的核蛋白基因和新城疫病毒的融合蛋白基因的序列，设计并合成禽流感和新城疫病毒的特异性的荧光标记引物，采集样本并提取其RNA，制备复合PCR反应液，在定量PCR仪器上进行反转录和PCR扩增反应，最后通过软件分析数据判定结果。该方法在同一体系中进行反转录和PCR扩增，并可扩增两种目的基因，进行两种荧光信号的实时监测。该方法特异性好、灵敏度高，可同时对禽流感病毒和新城疫病毒病毒进行检测，缩短检测时间，提高检测效率，降低检测成本，具有很强的推广性和实用性。
文档编号C12Q1/25GK1683564SQ20051004252
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月1日 优先权日2005年3月1日
发明者梁成珠, 高宏伟, 朱来华, 岳志芹 申请人:中华人民共和国青岛出入境检验检疫局