专利名称：：H5型和h9型禽流感病毒及新城疫病毒多重检测方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于对禽类及其产品是否感染传染病进行检测的方法，确切讲是一种检测禽类及其产品是否感染H5型或H9型禽流感病毒或新城疫病毒的方法。
背景技术：
：禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)—直是影响养禽业的最主要病原。虽然通过疫苗的广泛使用，使得禽流感和新城疫的流行得以控制，但近年来，在我国流行的H5和H9型禽流感及新城疫在高免鸡群中呈现流非典型症状，常以产蛋量大幅度下降，低死亡率，呼吸道症状及后期的神经症状为特征，临床很难区别禽流感病毒的亚型和新城疫病毒。因此，对禽流感病毒和新城疫病毒的检验与诊断方面的研究具有重要意义。流感和新城疫是呈全球分布的传染病，各个国家都有不同程度的发生。流感对人类的危害众所周知，它的发病率和造成的死亡人数至今仍列为传染病之首。新城疫也有感染人的报道。在畜牧兽医方面，它也威胁着多种家畜家禽甚至很多珍稀野生动物的繁衍和生存，从而对经济也造成极大的影响。由于流感病毒和新城疫的毒株众多，毒力差别很大，所以临床症状也千差万别。尤其H5和H9型禽流感及新城疫很难与其他有类似症状的传染病区分，而且临床症状和病理变化因感染动物的种类、年龄、病程长短、并发感染情况及感染毒株毒力等不同而有所不同，可能缺乏特征性症状和剖检变化，这给流感的诊断和防治带来极大的困难。因此，单靠临床诊断常常难以定性。实验室诊断是确诊流感的惟一有效途径。特别是随着血清学实验技术和分子生物学技术的飞速发展，流感诊断技术的研究也不断取得新的进展。同时，分子生物学的发展为流感病毒核酸序列分析创造了条件。为了确定流感和新城疫是否在某一地区存在，检测动物血清抗体的方法并非完全可靠，还必须通过病原学检査以确诊病原的存在。流感病毒和新城疫病原学检查，一般用生物学实验、血清学诊断技术和分子生物学诊断技术。这些技术方法虽然得到承认、采纳和应用，但是它们有的敏感性不高、有的特异性不强、有的检出率较底、有的检测周期太长、有的费用太大，而且这些方法大多都需动用活病毒，存在向周围环境散毒的隐患。一般基层单位要开展此项工作，存在不少困难，特别是被检材料污染，检出更为困难。因此进行新城疫病毒的分离鉴定，不仅需要严格的无'菌取材，还需要低温保存，迅速送检，这往往也是一般工作现场难以办到的。因而建立一种快速诊断该病的方法，已成为流感和新城疫防治技术研究的重要课题。
发明内容本发明提供一种快速、简便、灵敏和经济的检测的方法，且这种方法用于检测临床样品时，可区分出病禽所感染的是H5、H9型禽流感病毒及新城疫病毒。本发明的方法从待检禽的气管或泄殖腔拭子或血液或粪便或者死禽的器官组织中提取其全基因组RNA，以RNA为模板，以H5A、H9A和F为靶基因的引物进行多重RT-PCR，对得到的产物进行电泳，根据电泳图谱分析被检禽是否感染有H5、H9型禽流感病毒及新城疫病毒。本发明中所用的引物分别是H5A为靶基因的引物为上游弓I物5'-ACGTATGACTATCCACAATACTCAG誦3'下游弓I物5'-AGACCAGCTACCATGATTGC-3';H9A为靶基因的引物为上游引物5'-CTACTGTTGGGAGGAAGAGAATGGT-3'下游弓i物5'-TGGGCGTCTTGAATAGGGT-3'F为靶基因的引物为上游引物5'-TCAATCATAGTCAAGTTGC-3'下游弓I物5'-ACCCTTGTATCCTGCGGAT隱3'在本发明中无菌取待检禽的气管或泄殖腔拭子或血液或粪便或者死禽的器官组织，用灭菌生理盐水研磨成l:5稀释的乳悬液，全基因组RNA提取方法采用Trizol法0本发明较经典的病毒分离、单个RT-PCR方法和血清学分型方法快捷。本发明可以比较方便地一次性鉴定出属于H5、H9型禽流感病毒和新城疫病毒中的那一种病毒感染，可以及时对禽染病情况及区域、环境作出及时快捷的反应，以在最短时间内作出正确的处置办法。这对及时扑灭或治疗禽类的传染病有着积极的意义。另外，本发明较经典方法的病毒分离、鉴定和血清学分型试验方法快速、准确。本发明采取的提取全基因组的Trizol法快速、简捷、低成本，所需试剂种类少，特别适于小样品提取。因此，本发明具有广泛的市场应用前景。图1为本发明与标准样进行的特异性检测的电泳图，附图2为对临床样品评估的电泳图。具体实施例方式以下是本发明的实施例及对比检测情况。1.无菌取病禽血液、气管和泄殖腔拭子或粪便以及死禽的器官组织，最好是禽的脑、脾和肺等器官组织，用灭菌生理盐水研磨成乳悬液(i:5稀释)，并每毫升加入青、链霉素各2000IU,分装入小瓶贴好标签-8(TC保存备用；采用Trizol方法从血液、咽喉和泄殖腔拭子以及组织中提取包括病毒基因在内的全基因组RNA;同时，无菌提取健康禽血液，同样用Trizol方法提取组织基因组RNA，以用作阴性对照。2.引物设计，共设计3对引物，各引物的耙基因为H5和H9型禽流感病毒及新城疫病毒相应病毒的高度保守区域基因，弓I物的退火温度为50-58"C，弓|物均委托商家合成。各引物参见表2。表2.多重RT-PCR检测方法所使用的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>3.多重RT-PCR优化反应体系为20ml，各引物50pmo1，Taq酶0.5U和AIVA酶0.25U以及相应的缓冲液，模板分别为1步骤提取的病毒基因组RNA和健康禽血液中的基因组RNA，反应在PCR仪上进行，循环条件见表3。4.扩增程序结束后通过0.8%的琼脂糖电泳检测，电泳条件为0.8%的琼脂糖凝胶，l.OTAE缓冲液，0.3溴化乙锭预染色，80V稳压电泳30分钟，然后在紫外灯下观察并对照记录结果，见图1所示，各阴性对照物不产生条带。所有靶基因都得到相对应均匀扩增，而且没有非特异性扩增带的出现，应视为最佳的引物浓度组合条件。图l中l-3泳道及10泳道为阴性对照；4，5泳道为H9N2病毒；6，7泳道为H5N1;8，9泳道为NDV;M:DNAmarkerDL2000。表3.多重RT-PCR循环条件<image>imageseeoriginaldocumentpage6</image>5.多重RT-PCR优化条件的验证将上述RT-PCR条件应用于H5N1、H9N2型禽流感和新城疫病毒阳性样品的检测，同样设定阴性对照物，结果见图2，阴性对照物不产生条带，而各病禽样本的所有泳道的病毒靶基因扩增产物都清晰可见，没有出现任何特异性扩增，证明无论所列3种病毒视混合感染还是单独感染，均能在优化的多重RT-PCR条件下检测。图2中1-3及10泳道为阴性对照；4泳道为H9N2;5泳道为H5N1;6泳道为NDV;7泳道为H5N1和NDV;8泳道为H9N2和NDV;9泳道为H5N1和H9N2;M,DNAmarkerDL2000。.本发明与现在技术比较，处具有单个RT-PCR技术的灵敏度、特异性和符合率外，主要是一次RT-PCR实现了临床样品中3种病毒(H5和H9型禽流感病毒及新城疫病毒)的检测，成本更低，适合开发相应多重RT-PCR试剂盒，用于该病的临床诊断和流行病控制。'权利要求1、H5和H9型禽流感病毒及新城疫病毒多重检测方法，其特征是从待检禽的气管或泄殖腔拭子或血液或粪便或者器官组织中提取全基因组RNA，再以RNA为模板，以H5A、H9A和F为靶基因设计引物进行多重RT-PCR，对扩增产物进行电泳，从电泳图谱得到被检禽是否感染有禽流感H5、H9及新城疫病毒F。2、根据权利要求1所述的H5和H9型禽流感病毒及新城疫病毒多重检测方法，其特征是所用的引物为H5A为靶基因的引物为上游引物5'-ACGTATGACTATCCACAATACTCAG-3'下游引物5'-AGACCAGCTACCATGATTGC画3';H9A为靶基因的引物为'上游弓I物5'-CTACTGTTGGGAGGAAGAGAATGGT-3'下游引物5'-TGGGCGTCTTGAATAGGGT-3'F为靶基因的引物为上游弓l物5'画TCAATCATAGTCAAGTTGC-3'下游弓l物5'-ACCCTTGTATCCTGCGGAT-3'3、根据权利要求2所述H5型和H9型禽流感病毒及新城疫病毒多重检测方法，其特征是用灭菌生理盐水将所提取的样本研磨成l:5稀释的乳悬液，再采用Trizol法提取全基因组RNA。全文摘要本发明公开一种检测禽类及其产品是否感染H5型或H9型禽流感病毒或新城疫病毒的方法。本发明的方法是无菌取待检禽的气管或泄殖腔拭子或血液或粪便或者死禽的器官组织，用灭菌生理盐水研磨成乳悬液，再提取其全基因组RNA，以RNA为模板，以H5A、H9A和F为靶基因的引物进行多重RT-PCR，对得到的产物进行电泳，根据电泳图谱分析被检禽是否感染有H5、H9型禽流感病毒及新城疫病毒。文档编号C12Q1/70GK101230405SQ20081008149公开日2008年7月30日申请日期2008年2月20日优先权日2008年2月20日发明者刘永生,孙德惠,杰张,陈豪泰,马丽娜申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所