专利名称:表达禽流感病毒H5亚型HA蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种表达编码野生型或突 变型禽流感病毒H5亚型血凝素(HA)蛋白的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株，更具体 地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota_H5wtHA和rLasota-H5mutHA。本发明还公开 了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗株在制 备预防禽流感的疫苗中的应用。
背景技术：
新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)为不分节段单股负链RNA病毒，作 为副粘病毒科的重要成员和模型病毒，得到深入研究。重组NDV作为活病毒疫苗载体具有 非凡的优点包括LaSota株在内的NDV弱毒疫苗长期以来一直用于家禽防疫，其安全有 效性已被充分证明；NDV遗传相对稳定，仅有一个血清型，毒株间发生重组及毒力返强可能 性极小；复制过程在细胞浆内完成，从RNA到RNA，不存在DNA阶段及细胞基因组整合的可 能；NDV弱毒疫苗可同时诱导全身性体液免疫、局部粘膜免疫及细胞免疫的形成，形成更加 全面、确实的免疫保护；可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射多种方式给苗，使用极为方便； NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本极为低廉d’7’8’11’12’13)。NDV为高度传染性和高度 致死性的家禽疫病原，我国每年用于新城疫防制的弱毒疫苗至少在百亿羽份以上。NDV作为 活病毒疫苗载体应用的经济意义十分巨大。
负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基因组cDNA 制造新病毒的过程，其基本过程是①组装完整的病毒基因组(或重组型基因组)cDNA克 隆，5’末端精确地缀于T7启动子后，3’末端精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7转录终 止信号之前，构成基因组cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动病毒复制必须的 转录相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表达质粒(T7启 动子)一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可细胞；③M-72小时后收获培养上 清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获(rescue)病毒。对基因组cDNA进行 突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system,RGS 系统)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒(1’2’3’4’5’6)。
NDV基因组全长15186核苷酸，与其它副粘病毒一样，包括核蛋白(NP)，磷蛋白 (P)，基质蛋白(M)，融合蛋白(F)，凝集素神经氨酸酶蛋白(HN)，和大聚合酶蛋白(L)六个 独立转录编码单元(图1A)。NDV和其它负链RNA病毒一样，其最小感染单位是核糖核蛋 白复合物，无蛋白包裹的RNA本身并无感染性。NDV的基因组RNA通过与NP、P、L蛋白一起 组成核蛋白复合体，启动RNA的首轮转录及病毒蛋白的翻译合成、产生感染性子代病毒(7’ 1(°。根据这一原理，1999年欧洲学者率先建立了第一个高致病性NDV的反向遗传操作系统 (reverse genetic system, RGS 系统)⑵。[0005]禽流感是危害世界养禽业发展的重要疾病，高致病力禽流感可导致感染禽群 100%的死亡，被国际兽疫局列为A类烈性传染病。H5亚型历史上引起高致病力禽流感暴 发。2003年末至2004年初以来，韩国、日本、越南、泰国、印尼、柬埔寨、老挝以及中国大陆等 亚洲国家相继暴发H5亚型高致病力禽流感，现有禽流感灭活疫苗和禽痘活载体疫苗具安 全、免疫保护效果好的优点，但仍存在着制造成本高、使用相对不便的不足。研制高效安全、 成本低廉、使用方便的新一代疫苗具有重要的现实意义。
(Avian Influenza, Al)(Avian Influenza Virus, AIV) 引起的禽类感染和/或疾病综合征，AIV在分类学上属于病毒界(Vira)—一正粘病毒
科(Orthomyxoviridae)----流感病毒属(Influenza Virus A and B)----禽流感病毒
(Avianlnfluenza Virus)。禽流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属的A型流感病毒，基因 组由8个单股负链RNA片段组成。其表面结构蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性 不同，被划分为不同亚型。血凝素(HA)是禽流感病毒主要的免疫原蛋白，它可诱导机体产 生抗体介导的特异性体液免疫及细胞免疫应答，抗HA的抗体可以通过干扰病毒与唾液酸 受体的结合或者病毒囊膜与内吞体膜的融合过程从而中和病毒的感染。AIV的致病力与其 表面结构蛋白HA裂解位点的氨基酸序列密切相关。低致病力AIV的HA裂解位点只有一个 碱性氨基酸精氨酸(R)，这一结构决定了这些病毒感染动物后只能在呼吸系统内繁殖，因为 只有呼吸道上皮细胞内含有一种精氨酸特异的类似胰酶的蛋白酶，可将裂解位点含单一碱 性氨基酸精氨酸的HAO裂解为有活性的HAl和HA2，启动病毒的吸附和复制周期。高致病力 H5和H7亚型AIV HA裂解位点含有连续的多个碱性氨基酸残基-RKKR-，可被体内多种细胞 内广泛存在的蛋白酶识别和裂解，因此具有广泛的组织嗜性，一旦感染便会造成全身性扩 散并导致迅速死亡。与可感染人的H1、H2、H3及H9等亚型流感病毒相比，高致病性的H5 和H7亚型AIV对人类的潜在危害更为巨大，因为一旦感染人后即可能全身性扩散和迅速致 死。
2001-2002年，Palese. P.等相继构建表达Hl亚型流感病毒HA免疫原基因的重组 NDV Bl株和表达H7亚型流感病毒HA免疫原基因的重组NDVBl株，免疫试验表明这两种NDV 活载体疫苗可分别在小鼠和禽类诱导保护性免疫反应。但是由于Bl本身高度致弱，在免疫 接种鸡体内的复制能力较差，因而诱导免疫鸡形成有效免疫保护的能力也相对较弱，试验 表明，表达H7亚型HA基因的NDV Bl株对NDV及H7亚型高致病力禽流感致死性攻击的存 活保护分别仅为60%和40%，且不能阻止病毒在体内的复制和排放(12)。研究表明，NDV基 因组在不同位点插入外源报告基因或免疫原基因，经细胞或鸡胚连续高代次传代仍保持高 度的遗传和表达稳定性("’12’13)。但由于上述表达系统、活病毒载体本身的不足与缺陷以及 使用成本等原因，均未实现在生产实际的广泛应用。
发明内容
针对上述研究背景，本发明人为进一步提高禽流感病毒表达抗原的免疫原性， 构建表达野生型和突变型禽流感病毒HA免疫原蛋白的重组NDV活载体二联弱毒疫苗 rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA，通过滴鼻、点眼、肌肉注射甚至饮水、喷雾吸入等多 种途径免疫动物以诱导对禽流感的保护免疫反应，用于禽类新城疫与禽流感的预防免疫。
因此，本发明的一个目的是提供一种表达编码野生型或突变型禽流感病毒H5亚型血凝素(HA)蛋白的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。
在一个实施方案中，所述编码野生型HA蛋白的基因具有SEQ ID No 1所示的核苷 酸序列。
在另一个实施方案中，所述编码突变型HA蛋白的基因具有SEQ ID No 2所示的核 苷酸序列。
优选所述新城疫LaSota弱毒疫苗株是AV1615，更优选所述重组新城疫LaSota弱 毒疫苗株是 rLasota-H5wtHA 禾Π rLasota-H5mutHA。
本发明还有一个目的是提供一种生产上述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株的方 法，该方法包括
(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码野生型或突变型禽流感病毒H5 亚型HA蛋白的基因(野生型或突变型HA基因)的所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因 组cDNA序列；
(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒 疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的 cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；
(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述病毒复制许可的宿主细胞，培养 转染后的宿主细胞；
(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。
在上述生产方法的一个实施方案中，将编码野生型或突变型禽流感病毒H5亚型 HA蛋白的基因插入到新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因组P，M之间人工引入的I^meI位点。 优选所述LaSota弱毒疫苗株是AV1615。
在上述生产方法的另一个实施方案中，包括在所述转录质粒中的基因组cDNA序 列位于T7启动子之后，而在编码自我剪切的核酸酶的序列和T7转录终止子之前，构成基因 组cDNA转录模板。优选所述自我剪切的核酸酶是丁肝病毒核酶(Rib)。
在上述生产方法的另一个实施方案中，包括在所述转录辅助质粒中的编码所述新 城疫LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗 株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白 (L)的cDNA序列都位于T7启动子之后。优选所述转录质粒是pBRN-FL-H5wtHA(也称为 pBRN-FL-H5HAwt)或 pBRN-FL_H5mutHA (也称为 pBRN-FL_H5HAmut)，所述转录辅助质粒是质 粒pBSNP，pBSP和pBSL。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是BHK-21。
本发明还提供了上述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株(特别是rLaSOta-H5wtHA和 rLasota-H5mutHA)在制备预防禽流感的疫苗中的应用。
本发明通过RT-PCR扩增了 NDV疫苗株LaSota 10个cDNA片段，利用片段之间 互相重叠的部分进行拼接，装配成全长cDNA克隆。序列测定结果已经登录GenBank，登 录号为AY84M00。接着分别将禽流感病毒(Avian influenza virus)H5亚型A/Goose/ Guangdong/96/l/H5Nl分离株野生型(保留HA蛋白酶裂解位点，H5wtHA)和突变型(蛋白 酶裂解位点缺失，H5mutHA)HA基因分别重组到NDV疫苗株LaSota的P和M之间。将其与 核蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)辅助质粒共转染表达T7聚合酶的痘病毒感 染的细胞内，从而合成反基因组RNA。此RNA在NP、P和L蛋白的作用下，进行转录和复制。将转染上清接种SPF胚，得到来自cDNA的具有感染性的救获病毒。通过RT-PCR及基因组 cDNA序列分析证实，救获了带有人工遗传标签及野生型或突变型HA基因的Lasota的派生 株rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA。救获的病毒在鸡胚上增殖特征与野生型LaSota 疫苗株相近，血凝价高达212，以上结果再一次证实NDV具有作为疫苗活载体的能力。以上 重组NDV，rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA，不仅可以作为预防H5亚型高致病力禽流 感和新城疫和禽流感的二联弱毒疫苗双价弱毒疫苗，并且完全不干扰目前普遍应用的常规 禽流感流行病学血清学监测。
HA蛋白裂解位点连续多个碱性氨基酸是决定H5亚型高致病力禽流感必须的分子 基础。HA作为RNA病毒囊膜蛋白病表达后有可能嵌合到重组NDV的病毒囊膜表面，有可能 发挥其细胞膜受体结合与融合等细胞侵入相关功能的。通过人工突变删除HA裂解位点连 续多个碱性氨基酸，使其转变为低致病力禽流感病毒HA蛋白的基因形式，将完全避免潜在 的生物安全隐患。为此，本发明通过PCR方法，人工删除了裂解位点连续4个碱性氨基酸 (-RKKR-)，并突变了另外一个氨基酸，形成突变的低致病力形式H5亚型HA基因(mutHA基 因，SEQ ID No 2)，用于构建表达H5亚型禽流感病毒HA抗原的重组新城疫LaSota双价疫 苗株。
图1.从高保真RT-PCR产生的亚基因组重叠cDNA片段装配全长NDV cDNA。将cDNA 片段在共有的限制位点连接，并且在转录质粒PBR322中装配，在转录质粒PBR322中将RBZ 和T7终止子序列预先克隆在EcoRI和sail位点之间(详见说明书)。(A)显示亲代NDV的 整个全长基因组的第一个和最后一个核苷酸。(B)在顶部显示含有GFP基因的NDV的cDNA 克隆，在遗传图谱之下的水平线显示单个cDNA的位置。
图2.通过RT-PCR产生引入修饰酶位点的核苷酸变化，并通过使用PRISM试剂盒 (Perkin-Elmer)和Applied Biosystems ABI310自动测序仪测序。加框的是通过PCR诱变 在pBRNl-ΙΟ中引入的一个核苷酸替代(由A突变为G)。
图3.重组新城疫病毒rLasota_H5wtHA和rLasota-H5mutHA表达H5亚型HA抗原 的免疫荧光分析。(图3A和D)NDV-H5wtHA以MOI为1感染BHK-21细胞，(图和E)和 NDV-H5mutHA以MOI为1感染BHK-21细胞，(图3C禾Π F) NDV LaSota株对照以MOI为1感 染ΒΗΚ-21细胞，感染后20小时将感染的BHK细胞甲醇固定，分别以鸡抗Η5亚型禽流感病 毒高免血清(图3Α、B和C)和鸡抗新城疫病毒高免血清(图3D、E和F)为一抗、FITC-偶 联的兔抗-鸡IgG为二抗进行间接免疫荧光检测，LeicaDMIRES2荧光显微镜下观察细胞。 结果显示野生型和突变型H5亚型HA抗原均可在重组新城疫LaSota弱毒疫苗病毒株获得 正确表达。
图4.重组新城疫病毒rLasota_H5wtHA和rLasota-H5mutHA表达H5HA蛋白质印 迹分析。泳道1 蛋白质标记；泳道2 感染rLaS0ta-H5wtHA的鸡胚原代细胞(CEF)(获自 哈尔滨兽医研究所)；泳道3 感染rLasota-H5mutHA的CEF细胞；泳道4 感染rLaSota的 CEF细胞；泳道5 正常CEF细胞；泳道6 :H5亚型高致病力禽流感病毒接种鸡胚尿囊液；泳 道7 新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株接种9 10日龄SPF鸡胚尿囊液；泳道8 =SPF鸡胚尿 囊液。[0028]图5.重组新城疫病毒活载体疫苗鸡胚生长动力测定比较。
图6. pBTRT的质粒图谱。
图7. pBTRT质粒的DNA序列。第一个斜体部分T7启动子；带下划线部分核酶序 列；第二个带下划线的斜体部分Τ7终止子。
图 8. pBRN-FL-H5wtHA 的质粒图谱。
图9. pBRN-FL-H5wtHA质粒的DNA序列。带下划线斜体部分wtHA基因序列。
图 10. pBRN-FL-H5mutHA 的质粒图谱。
图11. pBRN-FL-H5mutHA质粒的DNA序列。带下划线斜体部分mutHA基因序列。
具体实施方式
下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不 是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求
具体限定。
实施例1表达野生型或突变型禽流感病毒H5亚型血凝素(HA)蛋白的重组新城疫 LaSota弱毒疫苗株的构建
细胞、病毒及试验材料
BHK-21细胞(乳仓鼠肾细胞ATCC CCL-10)，培养基为含10%胎牛血清(Hyclone) 及 lyg/ml G418 的 DMEM(Dulbecco' s 改良的 Eagle' s 培养基)；NDV Lasota 疫苗株 AV1615(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC))。接种9-10日龄SPF鸡胚尿 囊腔扩增后_70°C冻存备用；鸡抗NDV高免性血清由本研究室制备(Chu, H. P.，G. Snell, D. J. Alexander,和 G. C. Schild. 1982. Avian Pathol 11 :227-234) ；SPF 鸡胚及 SPF 鸡雏 均由哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供。H5亚型高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/ Goose/Guangdong/96/l/H5Nl分离株[⑶/1/96 (H5m)](为我国最早分离的H5亚型高致病 力禽流感病毒，唐秀英等.中国禽流感流行株的鉴定.中国畜禽传染病，1998，20(1) 1-5.) 及其 SPF 鸡高免血清、H5 亚型 HPAIV)A/Duck/Nanhui/04/l/H5m 分离株[NH/04 (H5N1)]、反 向遗传操作救获的野生型新城疫病毒LaSota疫苗AV1615株(rLaSota)分别购自哈尔滨兽 医研究所，
转录载体的构建
基因组RNA转录载体pBTRT以低拷贝克隆载体pBR322 (Invitrogen)为骨架并 在EcoRI/sall位点插入T7启动子(T7 promoter)、丁肝病毒核酶(Rib)和T7转录终止信 号(T7 terminal)，由本实验室自行构建。克隆在T7启动子和核酶之间的DNA片段可以在 T7RNA聚合酶的作用下得到转录，并且由于Rib的自身催化功能，可以保证转录产物的3' 末端与克隆的DNA片断精确一致。
插入野生型和突变型HA基因的重组NDV LaSota株基因组全长cDNA的构建
为建立NDV新城疫Lasota疫苗株的反向遗传操作系统，必须首先构建相应基因 组的全长cDNA克隆，作为基因组负链RNA转录模板，为此构建了覆盖整个基因组的十个 cDNA克隆片段，利用各个片断间重叠部分的酶切位点，在低拷贝质粒转录载体质粒pBTRT 连接组装获得了 15186nt的完整cDNA克隆，序列测定结果已经登录GenBank，登录号为 AY845400,并将H5亚型禽流感病毒的野生型和突变型HA基因H5wtHA(GenBank登录号 AF148678，图9中带下划线斜体部分，序列表SEQ ID No. 1)和H5mutHA基因(基因全长DNA序列见图11中带下划线斜体部分，序列表SEQID No 2)克隆到P，M之间。在全长cDNA片 段5’末端前缀T7RNA聚合酶启动子，在cDNA片断后连有具有自我催化功能的肝炎δ核酶 (GenBank Χ04451)和Τ7转录终止信号。构建完成的质粒分别命名为pBRN-FL_H5wtHA和 pBRN-FL-H5mutHA (pBRN-FL-H5wtHA 和 pBRN-FL_H5mutHA 的质粒图谱及其 DNA 全序列分别 见图8、9和图10、11)。为避免)(ba位点的甲基化，通过PCR基因组将基因组cDNA中F蛋白 编码区第6178位碱基由T同义突变为C，并作为拯救病毒的分子标记。与其他研究者一样， 我们同时在T7聚合酶启动子于基因组cDNA的5’末端引入两个多余的G，这可能有助于副 粘病毒反向遗传操作的病毒拯救。具体如下
NDV Lasota疫苗株病毒鸡胚接种尿囊液经常规方法(动物病毒学，第二版)提取 基因组RNA ；整个基因组分为末端部分重叠的10个片段(Fl-FlO)进行RT-PCR扩增，cDNA片 段克隆至pBluescript (Clontech) SmaI位点并经序列分析确证与病毒基因组RNA序列完全 一致；序列测定结果已经登录GenBank，登录号为AY84M00。为引入特异的分子遗传标签， 选择Lasota疫苗株基因组cDNA 6172bp处存在一甲基化的XbaI位点，序列为TCTAGATCA， 利用PCR手段将其突变为TCTAGACCA，使其不再受甲基化酶识别，因而能够被限制性内切酶 XbaI所识别；利用相邻片段重叠部分存在的限制酶切位点连接成组装完整的NDV基因组 cDNA (图1A)，并分别将H5亚型禽流感病毒的野生型和突变型HA基因H5wtHA和H5mutHA基 因(wtHA 用1Trizol (Invitrogen)提出IBDV基因组，反转录后，通过PCR扩增该基因。体系 中加入如下引物。上游引物 5，GTTTAAACCTTAGAAAAAATACGGGTAGAACCAGTTGTGCCACCATGGAGA AAATAGTGCTTCTT 3，，下游引物 5，GTTTAAACTTAAA TGCAAATTCTGCATTGT3，。mutHA 上游引物 5 ’ GTTTAAACCTTAGAAAAAATACGGGTAGAACCAGTTGTGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTT，下游引物 GTTT AAACTTAAATGCAAATTCTGCATTGT5，)克隆到P，M之间人工引入的RneI位点，并在前缀基因终 止和基因起始序列(GE/GS) (TTAAGAAAAAA/T/ACGGGTAGAA)，并克隆在转录载体pBTRT上，分 别构建成含有H5亚型禽流感病毒的野生型和突变型HA基因H5wtHA和H5mutHA基因的病毒 基因组转录质粒pBRN-FL-H5wtHA和pBRN-FL-H5mutHA (图1B)；表达核蛋白(NP)、磷酸蛋白 (P)及大聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框架(ORF)cDNA分别紧接着克隆在pBluescript II (+/")质粒T7启动子下游，分别构成转录辅助质粒pBSNP，pBSP和pBSL。
从重组全长cDNA克隆救获感染性NDV (病毒拯救)
为了从克隆的cDNA中拯救感染性NDV，首先分别以pBRN-FL-H5wtHA和 pBRN-FL-H5mutHA及表达NDVNP、P、L蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞。NDV的融合蛋白 FO必须裂解成Fl和F2才具有感染性，对于Lasota弱毒株而言，BHK-21细胞不能分泌裂解 FO蛋白所需的蛋白酶，因此在培养基中加入相应蛋白酶，所以此时应换成无血清培养基并 加入TPCK (甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮.Sigma) (1 μ g/ml)，继续培养2_3天，收获转染细胞上 清接种于9-11日龄的SPF鸡胚。4天后收获鸡胚尿囊液，血凝(HA)试验结果阳性，不同鸡 胚的HA价介于28_" ；NDV免疫血清血凝抑制(HI)试验分析同样呈现阳性结果。收获病毒阳 性尿囊液作为救获病毒rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA的Fl代。进一步的RT-PCR及 序列分析结果显示，Fl代救获病毒基因组cDNA的6178位点碱基为C，而非原LaSota亲本 株的C，和预期完全相符(图幻。结果表明，通过反遗传操作技术，利用NDV LaSota疫苗株 基因组cDNA克隆成功地救获具有感染性的子代病毒rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA。 更具体地，实验步骤如下[0046]BHK-21细胞接种于35mm六孔板内生长达50-80%单层时，将转录质粒及辅助质粒 pBRN-FL-H5wtHA 或 pBRN-FL_H5mutHA、pBSNP、pBSP 和 pBSL 分别以 5 μ g、2. 5 μ g、1. 25 μ g 1. 25 μ g，共转染BHK-21细胞，采用CaP04转染试剂盒(Invitrogene)，操作按试剂盒说明 书进行。转染后8-12小时，弃去转染混合物，用含10% DMSO的PBS液休克细胞2. 5分钟， 加入完全DMEM过夜孵育，第二天换成无血清培养基，并加入TPCK (1 μ g/ml)继续孵育2_3 天后，收获培养物上清，0. 22um孔径滤器过滤后接种9-11天的SPF胚尿囊腔；接种后的 SPF胚继续培养，3-5天，取鸡胚尿囊液50 μ 1进行按常规进行新城疫病毒的血凝(HA)和
(HI) 1 (Thayer SG, Nersessian BN, Rivetz B, Fletcher 0J. Comparison of serological tests for antibodies against Newcastledisease virus and infectious bronchitis virus using ImmunoComb sol id-phase immunoassay, a commercial enzyme-linked immunosorbent assay, and the hemagglutination-inhibitionassay. Avian Dis. 1987 Jul-Sep ；31 (3) :459-63.)。收获 HA 及 HI 试验结果阳性尿囊液，_70°C冻 存，并按常规方法分别于9-10日龄鸡胚及鸡胚成纤维细胞滴定每毫升EID5tl及PFU病毒含 量(14)。分别命名为 rLasota-H5wtHA 和 rLasota-H5mutHA。
实施例2重组NDV表达AVI HA蛋白间接免疫荧光试验(IFA)试验
NDV LaSota疫苗株能一过性感染体外培养的哺乳动物细胞。为证明 rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA病毒在BHK-21细胞内的复制及病毒抗原表达，二者尿 囊毒以MOI为1的病毒量分别感染约70-80%的单层BHK-21细胞(图3A和B)，同时以NDV 野生型LaSota疫苗株感染细胞为对照(图3C)，感染后20小时细胞出现早期CPE (细胞病 变)现象，立即以NDV高免SPF鸡阳性血清为检测抗体进行间接免疫荧光染色，结果三种病 毒感染细胞荧光显微镜下观察到强阳性反应(图3A、B和C)更具体地，实验步骤如下
分别以鸡胚接种传代二代次尿囊病毒液rLasota-H5wtHA、rLasota-H5mutHA和野 生型LaSota疫苗株(图3D、E和F) DMEM适当倍数稀释，按MOI = 5、50 μ 1体积感染生长于 24孔板的BHK-21，37°C，孵育Ih后用DMEM洗涤三遍，然后加入完全DMEM继续培养，24h后 用95%乙醇固定细胞5min，PBST (含有0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液)洗细胞后用SPF 鸡血清进行封闭1小时后，以鸡抗H5亚型高致病力禽流感病毒高免SPF鸡阳性血清为一 抗，作用30分钟后PBST洗涤后，加入1 160稀释荧光素(FITC)标记的兔抗鸡IgG 二抗 (Sigma)，作用 30min，PBST 洗涤后荧光显微镜(Leica DMIRES2)观察，rLasota_H5wtHA 和 rLasota-H5mutHA感染细胞全部出现强阳性反应，而rLasota感染细胞则完全阴性。
结果表明，重组新城疫病毒rLasota_H5wtHA和rLasota-H5mutHA成功表达了 H5 亚型禽流感病毒HA抗原蛋白。
实施例3重组NDV表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白的Western-Blot鉴定 取病毒感染鸡胚成纤维细胞(CEF)裂解液(弃去培养液后，加入1/10体积的PBS， 悬起细胞，加入等体积的2 X SDS裂解缓冲液沸水裂解IOmin后，12000g离心lOmin，收获上 清)或病毒接种SPF鸡胚尿囊原液，进行SDS-PAGE (Bio-Rad)。将蛋白电转移(Bio-Rad) 到尼龙膜上(Ameresco)，10%脱脂乳封闭过夜，PBST(0. 05% Tween20)洗涤后加入1 50 稀释的DNA免疫制备鸡抗H5亚型禽流感病毒HA抗原高免血清为一抗，辣根过氧化物酶 (HRP)标记兔抗鸡山羊抗鼠IgG(Sigma) 二抗为，1 2500倍PBST稀释，DAB(二氨基联苯 胶，Sigma)显色3 5分钟后用去离子水终止反应。结果如图4，证明了重组NDV分别表达野生型和突变型AVI HA蛋白。结果显示rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA感染CEF的 HA抗原检测均为阳性，新城疫Lasota疫苗株病毒感染及未感染CEF的HA抗原检测均为阴 性；H5W亚型高致病力禽流感病毒GD/1/96株接种SPF鸡胚尿囊原液HA抗原检测为阳性， 而新城疫Lasota疫苗株病毒接种及未接种SPF鸡胚尿囊液HA抗原检测为阴性。
结果表明，H5亚型禽流感病毒HA抗原在重组新城疫病毒rLaSOta-H5mutHA和 rLasota-H5wtHA获得正确表达。
实施例4 rNDV在鸡胚的生长特性及致病特性
为确定反向遗传操作救获rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA的鸡胚生长特性 及其对鸡胚的致病性，将救获病毒鸡胚扩增Fl代按1 X IO4EID50接种9 10日龄SPF鸡胚 尿囊腔。结果反向遗传操作救获的野生型新城疫病毒LaSota疫苗株(rLaSota) 120小时内 完全不致死SPF鸡胚，接种后M小时、48小时、72小时及96小时收获尿囊液，每毫升尿囊液 EID5tl 则分别为 1(Γ8·5、1(Γ8·6、1(Για° 和 10"9·4ο rLasota-H5wtHA 和 rLasota-H5mutHA 相同剂量 途径接种9 10日龄SPF鸡胚尿囊腔，120小时内同样不致死SPF鸡胚；rLasota-H5wtHA 接种后M小时、48小时、72小时及96小时收获尿囊液，每毫升尿囊液EID5tl则分别为10_8 2、 10-8.6、10-9.0 禾口 10-8.5。rLasota-H5mutHA 接种后 24 小时、48 小时、72 小时及 96 小时收获 尿囊液，而每毫升尿囊液EIA。则分别为10_7 9、10_8 5、10_9 2和10_8 6。(图5)结果表明反向 遗传操作救获病毒rLasota-H5wtHA及rLasota-H5mutHA的鸡胚生长动力学与野生株NDV Lasota疫苗株(rLaSota)类似，仍然保持NDV LaSota疫苗亲本株在鸡胚的高滴度生长及低 致死的生物学特性。
接下来将重组病毒rLasota_H5wtHA及rLasota-H5mutHA与反向遗传操作救获病 毒野生型Lasota疫苗株(rLaSota)，即rLaSota进行致病性比较分析。具体按国际动物卫 生组织(0. I.E.)推荐标准进行脑内致病指数(ICPI)、静脉内致病指数(IVPI)及鸡胚平均 致死时间(MDT)测定。用于新生刍鸡的LaSota活毒疫苗株ICPI应在0. 4左右或低于0. 4。 结果，rLasota-H5mutHA病毒不仅保持NDV Lasota疫苗株AV1615的低致病性，而且被更加 致弱。上述结果表明了该重组NDV保持了亲本LaSota疫苗株在SPF鸡胚的高滴度生长特 性及低致病性。
表1.重组新城疫病毒致病性分析
病毒株鸡胚平均致死时间(小时)(MDT)"脑内致病指数(ICPI)"静脉内致病指数(IVPI)“F蛋白裂解位点序列分析_rLasota> 1200. 350GGEQGE L
rLasota—H5mutHA> 12000GGRQGR LrLasota—H5wtHA> 12000GGRQGR L
#按0.1. E推荐标准进行。
***常规RT-PCR及序列分析。
实施例5诱导保护性抗体的免疫效果
为测定反向遗传操作救获病毒rLasota_H5wtHA和rLasota-H5mutHA对SPF鸡雏 的免疫原性，以rLaS0ta-H5wtHA为例，鸡胚扩增Fl代尿囊毒2 X IO6EID50剂量经滴鼻加点眼 途径人工免疫12羽七日龄白色来亨SPF鸡雏(哈尔滨兽医研究所SPF实验动物中心提供)， 另设非免疫组对照组8羽；免疫组和非免疫对照组分别饲养于空气负压过滤隔离器中。3周以后翅静脉采血分离血清按常规检测新城疫和H5亚型禽流感的特异血凝抑制抗体。
实验结果rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA尿囊病毒液Fl代分别以 2 X IO6EID50剂量经滴鼻加点眼途径人工免疫七日龄白色来亨SPF鸡雏，免疫后观察3周，期 间免疫组所有雏鸡无任何异常，饲料消耗及生长发育与非免疫对照组无明显差异；结果，两 种重组病毒弱毒一次免疫雏鸡后3周，即可诱导高水平的NDV和H5亚型AIV特异HI抗体水平 反应。结果表明，重组具有良好的免疫原性，并且保留低致病性LaSota疫苗株良好的安全性。
具体地，对于rLasota_H5wtHA 和 rLasota-H5mutHA 病毒，将它们分别与 NDVLasota 疫苗株AV1615的诱导保护性抗体免疫反应进行比较。结果如表2和3，表明重组病毒 rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA病毒都能够同时诱导对NDV和AIV的保护性抗体免疫 反应。
表2. H5亚型禽流感新城疫病毒活载体双价疫苗(rLaSOta-H5WtHA)免疫1周龄 SPF雏鸡诱导保护性抗体免疫反应
权利要求
1.一种表达编码野生型或突变型禽流感病毒H5亚型血凝素(HA)蛋白的基因的重组 新城疫LaSota弱毒疫苗株，其中所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLaSOta-H5wtHA和 rLasota-H5mutHA0
2.根据权利要求
1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株，其中所述编码野生型HA蛋白的 基因的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。
3.根据权利要求
1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株，其中所述编码突变型HA蛋白的 基因的核苷酸序列如SEQ ID No 2所示。
4.根据权利要求
1-3中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株，其中所述新城疫 LaSota弱毒疫苗株是AV1615。
5.一种生产根据权利要求
1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法，该方法包括(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码野生型或突变型禽流感病毒H5亚型 HA蛋白的基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因组cDNA序列；(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗 株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸蛋白⑵的cDNA 序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述病毒复制许可的宿主细胞，培养转染 后的宿主细胞；(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。
6.根据权利要求
5的方法，其中将编码野生型或突变型禽流感病毒H5亚型HA蛋白的 基因插入到新城疫LaSota弱毒疫苗株的基因组P，M之间人工引入的RiieI位点。
7.根据权利要求
5或6的方法，其中所述LaSota弱毒疫苗株是AV1615。
8.根据权利要求
5或6的方法，其中包括在所述转录质粒中的基因组cDNA序列位于 T7启动子之后，而在编码自我剪切的核酸酶的序列和T7转录终止子之前，构成基因组cDNA 转录模板。
9.根据权利要求
8的方法，其中所述自我剪切的核酸酶是丁型肝炎病毒核酶(Rib)。
10.根据权利要求
5或6的方法，其中包括在所述转录辅助质粒中的编码所述新城疫 LaSota弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的磷酸 蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA 序列都位于T7启动子之后。
11.根据权利要求
5的方法，其中所述转录质粒是pBRN-FL-H5wtHA或 pBRN-FL-H5mutHA。
12.根据权利要求
5的方法，其中所述转录辅助质粒是质粒pBSNP，pBSP和pBSL。
13.根据权利要求
5的方法，其中所述宿主细胞是BHK-21或鸡胚成纤维细胞。
14.根据权利要求
1-4中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株在制备预防禽流感 的疫苗中的应用。
专利摘要
本发明涉及一种表达野生型或突变型禽流感病毒H5亚型血凝素(HA)蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗株是rLasota-H5wtHA和rLasota-H5mutHA。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗株的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗株在制备预防禽流感的疫苗中的应用。
文档编号C12N15/33GKCN1942578 B发布类型授权 专利申请号CN 200680000024
公开日2011年6月15日 申请日期2006年1月13日
发明者步志高, 陈化兰 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (1),