专利名称：二羟基丙酮激酶的原核表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种高效表达二羟基丙酮激酶蛋白 (DAK)的原核表达载体pET28a-DAK及其在DAK蛋白的原核表达和DAK蛋白抗体制备中的应用。
背景技术：
甲醛是一种无色，有强烈刺激气味的气体，易溶于水、醇和醚，被广泛用于工业生 产中，是胶粘剂工业应用最广泛的化学原材料。随着经济的发展和人民生活水平的提高， 各种原料制成的建筑装饰材料已走入各种室内公共场所和家庭，使甲醛成为室内空气污染 公认最具代表性的化学物质。室内空气中游离甲醛浓度在中国规定的允许值是0.08(mg/ 立方米)，对新装修住宅的调查结果表明室内空气中甲醛浓度是室外空气的6. 65倍，为 0.492mg/m3，在门窗关闭时甲醛浓度超标100倍。甲醛为较高毒性物质，它反应能力极强， 能与蛋白质，核酸和脂类产生非特异性的反应，是一种非常活泼的化合物，因此对所有的 生物来说都有很高的毒性。长期接触低剂量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻烟癌、 结肠癌、脑瘤、月经紊乱、细胞核的基因突变，DNA单链内交连和DNA与蛋白质交连及抑制 DNA损伤的修复、妊娠综合症、引起新生儿染色体异常、白血病，这就是所谓的装修综合病 (sick-house)0相对于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、游离甲苯二异氰酸酯(TDI)、挥发性有机化合物 (V0C)等有害物质来说，甲醛具有潜伏周期长(3-15年)、隐藏深、分布广、易挥发、治理难、 危害大等特性。目前清除污染甲醛通常使用的方法有三种一是使用环保材料；二是开窗 通风；三是用植物或除污剂清除污染，使用除污剂有二次污染的可能。用室内栽培植物清除 甲醛污染，是最自然、最环保的方式，科学研究证明确实有些植物能够吸收分解甲醛，但吸 收能力和速度非常有限(Giese 等，1994，Plant Physiol. 104 1301-1309)。甲基营养酵母具有利用一碳化合物甲醇的高效代谢机制，在甲醇的代谢途径中， 甲醇首先被乙醇氧化酶氧化为甲醛，甲醛是甲醇代谢过程中的一个关键性的中间产物，它 处于甲醇同化和异化途径的分支点上。二羟基丙酮合成酶(DAS)催化甲醛同化途径中的 第一个反应，DAS催化酵母菌中的甲醛和木酮糖5-P形成二羟基丙酮和甘油醛3-磷酸。甲 醇被乙醇氧化酶氧化成甲醛后，由它把甲醛固定到D-木酮糖5-磷酸分子上(Yurimoto等， 2005，The Chemical Record. 5 :367_375)。通过突变体和酶学特性分析证实了 DAS的生理 作用是甲醇同化作用的关键酶。目前已从甲基营养型酵母菌假丝酵母(Candida boidinii) 中克隆到编码DAS的基因(DHAS1)，进一步的调查结果证实DAS主要参与这种酵母菌细 胞中甲醛的同化作用而非异化作用或脱毒作用(Sakai等，1998，American Society for Microbiology. 180 :5885_5890)。二羟基丙酮对酵母细胞来说是有毒的化合物，在酵母菌中二羟基丙酮激酶(DAK) 参与二羟基丙酮的脱毒作用，它催化的反应使二羟基丙酮磷酸化，形成无毒性的磷酸二羟 丙酮，可为酵母细胞所利用。该酶普遍存在于大多数的生物体中，结合遗传学和生物化学方法，已从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中克隆到两个编码DAK的基因(YML070W/DAKl和YML053W/DAK2)，它们所编码的蛋白质是同型二聚体(Molin等，2003，The journal of biological chemistry. 278 1415-1423)。从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中 克隆到的DAK基因编码的蛋白质定位于细胞质中(LUers等，Yeast. 1998，Jun 15，14(8) 759-71)。5-磷酸木酮糖和磷酸二羟丙酮及甘油醛3-磷酸都是开尔文循环的中间产物，本 申请人:的研究结果证明(见本申请人的另一申请专利提高植物吸收和耐受甲醛的方法及 其植物载体与应用，申请号为200810058341. 9)在植物的叶绿体中过量表达来自酵母菌的 DAS和DAK，可以用在转基因植物中利用DAS和DAK构建一条甲醛同化途径，提高植物同化 和吸收甲醛的能力。因此DAS和DAK的过量表达可用于提高观赏植物代谢甲醛能力的分 子育种，把DAS和DAK整合到植物基因组后，DAS和DAK蛋白在植物中的表达量是转基因是 否起作用的关键，其中DAK蛋白特异性抗体是检测转基因植物中DAK蛋白表达水平的有效 工具。目前虽然有些研究用经典方法直接从裂殖酵母(John et al. , Journal ofGeneral Microbiology，1986，132 :2611-2614)、大肠杆菌(Bachler et al.，The EMBO Journal, 2005，24 :283-293)、克蕾伯氏菌(Johnson et al.，Journal of Bacteriology, 1984,160 55-60)中纯化到DAK蛋白并研究这些微生物中DAK的生理生化特性。另外用类似的方法从 法氏柠檬杆菌(Citrobacter freundii)中也纯化到DAK蛋白并用于研究其晶体结构。但 是至今仍然没有研究纯化毕赤酵母的DAK并制备其特异性的抗体。由于天然的酵母菌中 DAK的表达量不高，所以用经典的方法纯化DAK蛋白纯化操作过程很复杂，通常用这类方法 纯化DAK蛋白需要大规模培养酵母菌，过几种性质不同的柱子，并用专业的仪器控制洗脱 条件，蛋白纯化的成本很高，因此这类方法不方便重复使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种DAK的原核表达载体(pET28a_DAK)，该载体含有T7启动 子和终止子、细菌核糖体结合位点和DAK基因及一个组氨酸标签，利用该载体转化大肠杆 菌(BL21)，可实现DAK蛋白的高水平表达，表达的重组蛋白质大部分为可溶性蛋白，用亲和 层析很容易从大肠杆菌可溶性总蛋白中纯化出高纯度的重组DAK蛋白质，用于DAK抗体的 制备或生化特性分析。DAK重组蛋白表达量很高，因此不需要大规模培养细菌，纯化DAK蛋 白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案一种原核表达载体，在该原核表达载体中含有烟草DAK基因。所述原核表达载体的起始载体为pET_28a ；所述DAK基因上游添加有T7的启动子 和细菌核糖体结合位点RBS ；上述载体中的二羟丙酮激酶基因DAK来源于巴斯德毕赤酵母， 在GenBank中的登录号为AF019198。在上述载体中，DAK基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动 子的下游有操作子序列，可被IPTG诱导。为了使DAK基因表达的重组蛋白DAK能用亲和层 析纯化，紧靠DAK基因的起始密码子上游还有6个组氨酸标签序列。本发明的原核表达载体由下述方法构建而得(1)从GenBank中查找烟草DAK的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物
DAK5 :5，-CATGGCTAGTAAACATTGGGATTAC-3，DAK3 :5，-CTCGAGCAACTTGGTTTCAGATTTGAAG-3，5’端引物添加一个C碱基，并由此形成NcoI酶切位点；3’端引物末端加XhoI酶 切位点；以巴斯德毕赤酵母基因组为模板通过PCR扩增，得到DAK的全长DNA序列；(2)回收并纯化DAK全长基因片段，并将其连接到pMDlS-Τ载体上，采用碱裂解法 提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-DAK ；(3)构建原核载体pET28a-DAK，用NcoI和XhoI双酶切pMD-DAK和pET28a，并回收 纯化DAK基因片段以及载体片段pET28a，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR扩增检测和酶 切检测，获得原核表达载体pET28a-DAK。本发明的原核表达载体在制备重组DAK蛋白中的应用，在制备DAK特异性抗体中 的应用。将上述载体热刺激法导入大肠杆菌蛋白表达专用受体菌株BL21中，获得转化子 菌落，用IPTG进行诱导可高水平表达DAK重组蛋白。本发明的实验结果表明用IPTG于28°C诱导6小时后可使DAK重组蛋白达到很高 的表达量，表达的重组蛋白质50 %为可溶性蛋白，50 %形成包涵体蛋白，各占大肠杆菌总蛋 白50%，用亲和层析很容易从大肠杆菌可溶性总蛋白中纯化出高纯度的重组DAK蛋白质， 可用于DAK抗体的制备或生化特性分析，为DAK特异性抗体的制备提供了一条新途径。
图1、巴斯德酵母菌基因组DNA的检测，M λ DNA/HindIII DNA marker ； 1-6 假丝 酵母基因组；图2、DAK基因的TA克隆策略；图3、DAK基因TA克隆质粒的检测，(A)重组质粒pMD18_DAK的电泳检测。1 正对 照(分子量为4. 5kb的质粒DNA) ；2-5 重组质粒pMD18_DAK。(B)重组质粒pMD18_DAK的 酶切检测。M =DNA marker III ； 1-2 用 EcoRI 酶切的 pMD18_DAK。(C)重组质粒 pMD18_DAK 的 PCR检验。M:DNA marker III ；1-2 以 pMD18_DAK 为模版用 DAK5 和 DAK3 引物扩增的 PCR 产物；图4、DAK基因的原核表达载体构建策略；图5、DAK基因原核表达载体的检测，(A)重组质粒pET28a_DAK的电泳检测。1 正 对照(分子量为7. Okb的质粒DNA) ； 2-4 重组质粒pET28a-DAK。(B)重组质粒pET28a_DAK 的酶切检测。M =DNA marker III ；1 没有酶切的质粒pET28a_DAK ；2-4 用EcoRV酶切的 pET28a-DAK。(C)重组质粒 pET28a_DAK 的 PCR 检验。M =DNAmarker III ;1 正对照(以 PMD18-DAK为模版用DAK5和DAK3引物扩增的PCR产物)；2-5 重组质粒pET28a_DAK的PCR 扩增产物；图6、DAK重组蛋白表达条件的优化；图7、可溶性和不溶性DAK重组蛋白的分布；图8、DAK重组蛋白的纯化。
具体实施例方式
试剂与仪器试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物 鉴定和检测所需的各种试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制 齐IJ、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物 技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂购自invitrogen公司。其余试剂均为国产 分析纯。仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明 均为常规方法。实施例1 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)基因组DNA的制备与检测本发明所用的巴斯德毕赤酵母(Candida boidinii)购自中国工业微生物菌种保 藏中心，巴斯德毕赤酵母菌基因组DNA的制备采用CTAB法，。取1. 5mL菌液于4°C 4000rpm 离心 2min，弃尽上清液，收集菌体。加 400 μ 1 2 X CTAB (Tris-HCl pH 7. 5100mM,EDTA 20mM, NaCl 1. 4M, CTAB 2% )勻浆，65°C保温20min，加500 μ 1氯仿混勻后于室温下13000rpm离 心IOmin0转移上清，加50 μ 1的10% CTAB,加650 μ 1异丙醇置于室温1小时，4°C 12000rpm 离心25min.，沉淀用500 μ 1 75%酒精洗一次.，真空干燥，加20 μ 1含有RNase的TE溶解， 37°C保温一小时。取2μ 1基因组DNA用1 %的琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果(图1)说明 提取到的基因组DNA质量符合要求。实施例2 =DAK基因的扩增与TA克隆DAK基因的扩增及TA克隆的策略如图2所示，首先从GenBank中查找DAK的全长 基因序列(DAK基因的GenBank登录号为AF019198)，并设计一对引物，序列如下DAK5 CATGGCTAGTAAACATTGGGATTACDAK3 CTCGAGCAACTTGGTTTCAGATTTGAAG5’端引物DAK5末端加一个C，由此形成NcoI酶切位点；3，端引物DAK3末端加 XhoI酶切位点。在PCR反应混合液中加入10 μ g的巴斯德毕赤酵母基因组DNA作为模板，同时加 入 50 μ g 的特异性引物 DAK5 和 DAK3、1. 8 μ IdNTP (2. 5mM)，5 μ 1 的 Long Taq 反应 Buffer 和0. 3 μ 1的long Taq (2. 5U/ μ 1)聚合酶(购自天根生化科技)，加双蒸水使反应终体积为 20 μ 1。在PCR仪上于94°C加热3分钟，然后按照94°C、45秒，55 °C >45秒，72°C、1分钟45 秒的程序进行30个循环的反应，最后在72°C延长反应10分钟的程序进行PCR反应扩增得 到DAK基因。反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物。回收并纯化DAK全长 基因DNA，然后用宝生物(TaKaRa)的TA克隆试剂盒亚克隆到pMD18_T (大连宝生物公司) 载体上，实验操作按试剂盒的说明书进行，反应过夜后用反应混合液转化大肠杆菌感受态 DH5a (购自天根生化科技公司)，采用碱裂解法提取质粒DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测 其大小(图3A)，选取大小和理论值相符的重组质粒进行酶切检测。用EcoRI酶切重组质 粒，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒PMD-DAK有二条带，其中一 条分子量大为4. 3kb的载体带，另一条分子量较小的为0. 23kb DAK DNA片段(图3B)。选 取酶切检测正确的重组质粒PMD18-DAK做进一步的PCR检测，用DAK基因上下游特异性引物DAK5和DAK3作PCR，亚克隆成功的重组质粒均能扩增出1. 8kb左右的DAK基因DNA片 段(图3C)，测序分析证明重组质粒载体中插入的DAK全长基因序列正确。再次确认是连 接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5 α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒 PMD18-DAK。实施例3 原核表达载体pET28a_DAK的构建pET28a-DAK 的构建策略如图 4 所示，用 Nco I (Fermentas)和 Xho I (Fermentas) 切开纯化的原核表达质粒载体pET28a(购自Novagen公司)和pMD18_DAK，通过琼脂糖 凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pET28a被切割后产生的载体片 断pET28a(5.4kb)及pMD18_DAK被切割产生的DAK基因的DNA片断(1.8kb)，然后用宝生 物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pET28a载体片段和DAK基因的DNA片断产生原核表达 载体pET28a-DAK。用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5 α， 购自天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km，50yg/ml)的平板上， 于37°C过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒(图5A)，用 EcoRV(Fermentas)进行酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生两条带，分 子量小的一条为2. 36kb，另一条为4. 75kb (图5B)。选出连接成功的质粒载体pET28a_DAK， 用DAK基因上下游特异性引物进行PCR检测，亚克隆成功的重组质粒均能扩增出1. Skb左 右的DAK基因DNA片段(图5C)，再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5 α， 挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pET28a-DAK。实施例4 重组DAK蛋白的表达与表达条件的优化用原核表达载体pET28a_DAK转化大肠杆菌BL21的感受态细胞(DH5 α，天根生化 科技)。挑取单菌落加入2mL LB (含有Km 50mg/L)中，37°C过夜培养(OD600值约为1. 5)。 加0. 5和1. OmM的IPTG于28°C诱导0_8小时后，离心收集菌体，去掉上清液，加入0. Iml SDS-PAGE上样缓冲液(Sample loading buffer)，于95°C加热10分钟煮沸菌体。冰浴冷却 后于4°C离心(12000rpm)10分钟，取上清作SDS-PAGE。根据文献资料和软件分析预测目的 蛋白大小为70kDa左右，采用12%分离胶。SDS-PAGE电泳参看《分子克隆实验指南(第三 版)》。SDS-PAGE电泳结果(图6)表明用IPTG于28°C诱导的时间越长，DAK蛋白表达量越 高，用LOmM的IPTG诱导6小时后DAK蛋白表达量最高。表达的重组蛋白质50%为可溶性 蛋白(图7)，50%形成包涵体蛋白(图7)，各占大肠杆菌总蛋白50% (图7)。实施例5 重组DAK蛋白的纯化用原核表达载体pET28a_DAK转化大肠杆菌BL21的感受态细胞，挑取单菌落入 IOOOmL LB (含有 Kan 50mg/L)中，37°C培养至 0D600 值约为 0. 6。加 1. Ommol/LIPTG 诱导后 6小时，离心收集菌体，用wash buffer洗2次，加入30ml蛋白抽提缓冲液(磷酸钠缓冲液 (pH7. 4) 20mmol/L)，悬浮菌体。于冰浴中超声波破碎细菌细胞(工作3秒，间歇9秒，功率 30W，全程30分钟)。于4°C离心(6000g)30分钟，转移上清，过0.45um滤膜。用亲和层析 柱分离纯化可溶性DAK重组蛋白。参看His-Trap HP说明书，首先用5柱体积纯水洗柱，用 5柱平衡缓冲液(磷酸钠缓冲液(pH7. 4)20mmOl/L，5mM咪唑)平衡柱子，然后上蛋白样品， 用5柱体积浓 度为30、100、200、400、500mM的咪唑缓冲液(磷酸钠盐缓冲液20mmol/L，NaCl 0. 5mmol/L,咪唑30-500mmol/L)进行梯度洗脱，收集洗脱液，每管2mL。最后用分别用5柱 体积纯水和5柱体积20%乙醇洗柱。测定及各洗脱液中蛋白的浓度，用50ug跑SDS-PAGE检测蛋白的纯度(图8)，图8的数据说明DAK重组蛋白在400mM的咪唑缓冲液中被洗脱下来，蛋白质的纯度达90%，加70%硫酸铵沉淀洗脱液中的蛋白质，用IXPBS溶解并透析后 可用于DAK抗体的制备或生化特性分析。
权利要求
一种原核表达载体，含有巴斯德毕赤酵母的DAK基因。
2.如权利要求1所述的原核表达载体，其特征在于所述原核表达载体的起始载体为 pET-28a。
3.如权利要求1所述的原核表达载体，其特征在于所述DAK基因上游添加有T7的启动 子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操纵子序列，紧靠DAK 基因的起始密码子上游还有6个组氨酸标签序列。
4.如权利要求1所述的原核表达载体，其特征在于上述载体中的二羟丙酮激酶基因 DAK来源于毕赤酵母，其GenBank登录号为AF019198。
5.一种原核表达载体，由下述方法构建而得(1)从GenBank中查找巴斯德毕赤酵母DAK的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物DAK5 :5’ -CATGGCTAGTAAACATTGGGATTAC-3’ DAK3 :5’ -CTCGAGCAACTTGGTTTCAGATTTGAAG-3’5’端引物添加一个C碱基，并由此形成Ncol酶切位点；3’端引物末端加Xhol酶切位 点；以毕赤酵母基因组为模板通过PCR扩增，得到DAK的全长DNA序列；(2)回收并纯化DAK全长基因片段，并将其连接到pMDIS-T载体上，采用碱裂解法提取 质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-DAK ；(3)构建原核载体pET28a-DAK，用Ncol和Xhol双酶切pMD_DAK和pET28a，并回收纯 化的DAK基因片段以及载体片段pET28a，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检 测，获得原核表达载体pET28a-DAK。
6.权利要求1-5的原核表达载体在制备重组DAK蛋白中的应用。
7.权利要求1-5的原核表达载体在制备DAK特异性抗体中的应用。
8.权利要求1-5的原核表达载体的构建方法，包括下列步骤(1)从GenBank中查找巴斯德毕赤酵母DAK的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物DAK5 :5’ -CATGGCTAGTAAACATTGGGATTAC-3’ DAK3 :5’ -CTCGAGCAACTTGGTTTCAGATTTGAAG-3’5’端引物添加一个C碱基，并由此形成Ncol酶切位点；3’端引物末端加Xhol酶切位 点；以毕赤酵母基因组为模板通过PCR扩增，得到DAK的全长DNA序列；(2)回收并纯化DAK全长基因片段，并将其连接到pMDIS-T载体上，采用碱裂解法提取 质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-DAK ；(3)构建原核载体pET28a-DAK，用Ncol和Xhol双酶切pMD-DAK和pET28a，并回收纯化 DAK基因片段以及载体片段pET28a，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获 得原核表达载体pET28a-DAK。
全文摘要
本发明提供一种巴斯德毕赤酵母DAK的原核表达载体(pET28a-DAK)，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点和DAK基因及一个组氨酸标签，从巴斯德毕赤酵母中克隆出DAK基因，用T7启动子控制它在大肠杆菌中的表达，利用该载体转化大肠杆菌(BL21)实现DAK蛋白的高水平表达。表达的重组蛋白质大部分为可溶性蛋白，占大肠杆菌可溶性总蛋白50％，用亲和层析很容易从大肠杆菌可溶性总蛋白中纯化出高纯度的重组DAK蛋白质，用于DAK抗体的制备或生化特性分析。DAK重组蛋白表达量很高，不需要大规模培养细菌，纯化DAK蛋白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。
文档编号C07K16/40GK101845452SQ20101011733
公开日2010年9月29日 申请日期2010年3月4日 优先权日2010年3月4日
发明者孙振, 张婧, 肖素勤, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学