专利名称：一种测定丙酮酸脱氢酶系活性的分光光度法的制作方法
技术领域：
本发明涉及丙酮酸脱氢酶系活性测定的方法。具体是基于用吩嗪二甲酯硫酸盐作电子传递体，噻唑蓝作为电子受体，噻唑蓝被丙酮酸脱氢酶(E1)的催化产物所还原，测定噻唑蓝的还原量，确定丙酮酸脱氢酶系活性的分光光度法。
背景技术：
丙酮酸脱氢酶活性的测定在丙酮酸脱氢酶系的性质、基因克隆、分离、纯化、鉴定及相关研究中都是必不可少的。对于研究与丙酮酸的代谢异常有关的疾病，以酮酸脱氢酶系为靶标的除草剂和杀菌剂也具有重要的意义。本发明对丙酮酸脱氢酶系的测活方法进行研究，并建立了一项经济有效的测活方法。
丙酮酸脱氢酶系或丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)在催化丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA的能量代谢过程中起着关键的作用。丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)是多酶体系，其中包括丙酮酸脱氢酶(E1；EC 1.2.4.1)，二氢硫辛酸转乙酰酶(E2；EC 2.3.1.12)和二氢硫辛酸脱氢酶(E3；EC 1.8.1.4)]三种主酶。丙酮酸脱氢酶是一种限速酶，催化丙酮酸脱羧生成羟乙基-TPP(羟乙基-焦磷酸硫胺素)，接下来将在E2的作用下，羟乙基氧化转变为乙酰基同时转移到E2的辅基硫辛酰胺上。
目前已有报道的丙酮酸脱氢酶活性测定方法几乎都是二十世纪六十年代就发展起来的。根据采用的手段主要可分为两大类分光光度法和放射性同位素法。测定还原型辅酶I(NADH)形成速率的标准分光光度法常被用纯化的丙酮酸脱氢酶复合体，这种方法由于易受到丙酮酸脱氢酶复合体反应产物的副反馈抑制而受到限制，且试剂价格昂贵；常用测定丙酮酸脱氢酶活性的分光光度法有铁氰化钾法；2，6-二氯吲哚酚(2，6-DCPIP)法。同位素标记法主要用于粗酶液，是基于14C丙酮酸经过E1的催化作用转化为的CO2，可以通过测定14C标记的CO2生成量来决定E1酶的活性。因为同位素标记法是采用动态的测量，所以没有分光光度的方法便利，同时它还用到一种相对不稳定的放射性物质，易造成环境污染。1981年(Hinman L M.& J P.Blass，J.Biol.Chem.，Vol.256，No.13)等人报道了一种在粗的均质液中测定丙酮酸脱氢酶复合体活性的分光光度计法方法，此方法一直被用于测定粗的匀质液和线粒体的制备后酶活的测定。
通过本发明人的系统的研究发现铁氰化钾法的灵敏度极低，在反应起始后30分钟内基本没有观察到吸光度的变化；2，6-二氯吲哚酚法又易受到疏基保护剂(β-疏基乙醇和二硫苏糖醇等，为了使提取的酶保持原有的活性，一般在提取酶的过程中都要加入疏基保护剂)的影响，当巯基保护剂β-疏基乙醇浓度很低(50微摩尔/升)时，丙酮酸脱氢酶复合体就能与β-疏基乙醇发生激烈的反应；而在同样的条件下用噻唑蓝与β-疏基乙醇不发生反应。1981年Hinman.等人所报到测定丙酮酸脱氢酶复合体活性的方法，原理是测定碘硝基四唑紫与丙酮酸脱氢酶复合体共同作用后的产物还原型辅酶I发生反应引起的光吸收的变化。经过人们的研究发现碘硝基四唑紫不仅能与NADH反应，它同时也能与丙酮酸脱氢酶复合体中第一个酶丙酮酸脱氢酶的产物直接发生作用，所以这种方法测定丙酮酸脱氢酶复合体的可靠性值得进一步考虑。
发明内容
本发明提供一种新的丙酮酸脱氢酶活性测定方法，这种方法具有经济、灵敏度高、稳定性好、受到的干扰小的特点。
本发明提供的丙酮酸脱氢酶活性的测定方法具体描述如下利用分光光度计，存在底物丙酮酸钠和辅助因子氯化镁、焦磷酸硫胺素的情况下，用吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)作电子传递体，噻唑蓝(MTT)作为电子受体，噻唑蓝被丙酮酸脱氢酶(E1)的催化产物羟乙基-焦磷酸硫胺素所还原，测定丙酮酸脱氢酶E1的催化产物对噻唑蓝的还原量，确定酶的活性。噻唑蓝被丙酮酸脱氢酶(E1)的催化产物还原后，噻唑蓝最大吸收峰从波长400-430纳米变为540-640纳米，通过测定波长540-640纳米光吸收的增加量，用噻唑蓝浓度与吸光度之间的关系曲线--标准曲线，确定噻唑蓝的还原量，定义酶的活性。当石英比色池为1厘米时，还原的噻唑蓝的浓度与吸光度之间的关系见标准曲线(图1)。
反应混合物中包含磷酸钾盐缓冲液，氯化镁(MgCl2)，焦磷酸硫胺素(TPP)，噻唑蓝，吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)和作为反应底物的丙酮酸钠。酶活性单位用实验决定的还原的噻唑蓝的量来计算。酶的活性单位定义为每毫克蛋白每分钟还原1纳摩尔噻唑蓝为1单位。
上述测定噻唑蓝在波长540-640纳米吸光度的增加量的温度为室温10～30℃。
本发明首次利用噻唑蓝作为丙酮酸脱氢酶系中丙酮酸脱氢酶(E1)电子受体。与文献报导方法相比存在以下优点经济、稳定性高、灵敏度高，受到的干扰少。与传统的标准测定NADH(还原型辅酶I)方法相比，所用试剂价格便宜。其它试剂价格相当，但标准测定NADH方法中，100毫克CoA要1950元，而100毫克MTT只需要27元。如前背景技术所述2，6-二氯吲哚酚法和铁氰化钾法尽管试剂价格也不高，但是铁氰化钾法灵敏度极差，2，6-二氯吲哚酚法又易受到巯基保护剂的影响。而本发明的方法实验的重复性好，经过多次独立重复实验，数据之间的标准误差很小。灵敏度比2，6-二氯吲哚酚法和铁氰化钾法高。
图1标准曲线还原噻唑蓝的浓度与吸光度之间的关系曲线图2为MTT法(噻唑蓝法)和DCPIP法(2，6-二氯吲哚酚法)测定猪心丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)中丙酮酸脱氢的酶的活性的比较曲线图3为MTT法和DCPIP法测定乳酸菌丙酮酸脱氢酶的活性的比较曲线图4MTT法测定农药对乳酸菌丙酮酸脱氢酶是否抑制的反应时间与吸光度的关系曲线具体实施方式
实验原理见下式
实施例1MTT法和DCPIP法测定乳酸菌丙酮酸脱氢的酶和猪心丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)中丙酮酸脱氢的酶的活性的比较第一步酶的预处理----乳酸菌丙酮酸脱氢酶(PDH)配制，PDH粉末用含20％甘油的50毫摩尔pH7.1磷酸钾盐缓冲液溶解并稀释到1毫克蛋白/毫升。猪心丙酮酸脱氢酶复合体用含20％甘油的50毫摩尔pH7.1磷酸钾盐缓冲液稀释到1毫克蛋白/毫升。分装后于-20℃保存备用。
第二步MTT法反应混合物的配制反应混合物中包含50毫摩尔pH7.1磷酸钾盐缓冲液，1毫摩尔/升MgCl2，0.2毫摩尔/升焦磷酸硫胺素，0.5毫摩尔/升MTT，6.5毫摩尔/升吩嗪二甲酯硫酸盐和2.0毫摩尔/升丙酮酸钠作反应的底物。DCPIP法参照Nemeria等(2001，J.Biol.Chem.，Vol.276，No.49)所用反应体系有所修改(为了使两种方法具有可比性，辅助因子和底物浓度均相同)。
第三步室温条件下，加入酶液反应起始，进行时间扫描10分钟。DCPIP法测定波长600纳米，MTT法测定波长540-640纳米的吸光度。样品为完全的反应体系，对照为完全的反应体系不加焦磷酸硫胺素。吸光度用HITACHI U-1800紫外可见分光光度计进行。
实验结果见图2、3。从两种方法测定猪心丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)中丙酮酸脱氢的酶(图2)可以看出，DCPIP法测定时间依赖性光吸收变化线性较差，MTT法线性较好，可以看到在反应的起始后2-3分钟DCPIP法光吸收变化较大，考虑到猪心酶液中的巯基保护剂β-疏基乙醇(终浓度是20微摩尔/升)可能对两种方法造成影响，通过用20微摩尔/升的β-疏基乙醇与MTT和DCPIP分别作用，发现DCPIP能与β-疏基乙醇发生激烈的反应，而同样的条件下，即使存在吩嗪二甲酯硫酸盐，MTT也不与β-疏基乙醇发生反应，只有当β-疏基乙醇足够高，远远超出提酶过程中所使用的浓度时，MTT才与β-疏基乙醇有比较明显的反应。同时从吸光度的变化看，MTT法在测定该酶时比DCPIP法灵敏度高66.28％。
从两种方法测定乳酸菌丙酮酸脱氢酶的结果(图3)看，两种方法测定乳酸菌丙酮酸脱氢酶时间依赖性光吸收变化线性都比较好，但是在同样的条件下，从吸光度的变化看，MTT法在测定该酶时比DCPIP法灵敏度高29.71％。从曲线上显示的标准误差看两种方法在测定不含巯基保护剂的酶时重复性都比较好，即稳定性高。
结论MTT法与DCPIP法相比受到巯基保护剂的干扰少，且灵敏度比DCPIP法高。重复性好实施例2抑制剂对丙酮酸脱氢酶活性抑制率的测定第一步酶的预处理----乳酸菌丙酮酸脱氢酶(PDH)配制，PDH粉末用含20％甘油的50毫摩尔pH7.1磷酸钾盐缓冲液溶解并稀释到浓度1毫克蛋白/毫升。
第二步同实施例1第二步第三步将酶与浓度是100ppm的抑制剂IIM-1(IIM-1是1-(2，4-二取代苯氧乙酰氧基烃基膦酸单钠盐类化合物)一起30℃温浴30-60分钟第四步室温条件下，向反应混合物中加入酶或者酶和抑制剂起始反应，测定反应混合液吸光度与时间的关系，结果见图4。
图4中纯酶为完全的反应体系加入酶液反应起始；对照为完全的反应体系中不加酶液；酶加抑制剂为完全的反应体系加入酶和抑制剂。
计算结果5分钟内没有加抑制剂只加酶的样品管吸光度变化为0.113；加入酶的同时又加入抑制剂的样品管吸光度变化为0.84，所以抑制剂对酶活性的抑制率是(0.113-0.84)/0.113＝25.6637％。
本发明实施可随着具体测活性质不同，进行具体反应体系调整，如测定动物源的丙酮酸脱氢酶活性，可以选择pH值在7附近；但如果测定植物源的丙酮酸脱氢酶活性，最好选择pH值在8附近。假如是筛选以丙酮酸脱氢酶为靶标的抑制剂，测定抑制剂对丙酮酸脱氢酶的抑制性和抑制率，就需要调整反应体系中的底物浓度。
权利要求
1.一种丙酮酸脱氢酶活性测定方法，其特征是用吩嗪二甲酯硫酸盐作中间电子传递体，噻唑蓝作为电子受体，测定丙酮酸脱氢酶E1的催化产物羟乙基-焦磷酸硫胺素对噻唑蓝的还原量，根据噻唑蓝的还原量确定酶的活性，酶的活性单位定义为每毫克蛋白每分钟还原1纳摩尔噻唑蓝为1单位。
2.根据权利要求1所述的丙酮酸脱氢酶活性测定方法，其特征是利用分光光度计，在存在底物丙酮酸钠和辅助因子氯化镁、焦磷酸硫胺素的情况下，通过测定噻唑蓝在波长540-640纳米吸光度的增加量，用噻唑蓝浓度与吸光度之间的关系曲线--标准曲线，确定噻唑蓝的还原量，定义酶的活性。
3.根据权利要求2所述的丙酮酸脱氢酶活性测定方法，其特征是测定噻唑蓝在波长540-640纳米吸光度的增加量的温度为室温。
全文摘要
一种测定丙酮酸脱氢酶活性的分光光度法。该法利用分光光度计，在存在底物丙酮酸钠和辅助因子氯化镁、焦磷酸硫胺素的情况下，用吩嗪二甲酯硫酸盐作电子传递体，噻唑蓝作电子受体，噻唑蓝被丙酮酸脱氢酶(E1)的产物羟乙基－焦磷酸硫胺素所还原，噻唑蓝最大吸收峰从波长400－430纳米变为540－640纳米，通过测定波长540－640纳米光吸收的增加量，确定噻唑蓝的还原量，定义酶的活性。本法用的试剂比较经济，稳定性，灵敏度比2，6－二氯吲哚酚法和铁氰化钾法高，同时也克服了2，6－二氯吲哚酚法易受疏基保护剂影响不利于测定丙酮酸脱氢酶复合体中E1活性的缺点，本法既适用于纯化丙酮酸脱氢活性测定，也适用于来自线粒体提取后的丙酮酸脱氢酶复合体中丙酮酸脱氢酶活性测定。
文档编号C12Q1/32GK101017134SQ20071005127
公开日2007年8月15日 申请日期2007年1月17日 优先权日2007年1月17日
发明者袁均林, 何亚辉, 贺红武, 彭浩, 杨旭, 丁书茂 申请人:华中师范大学