专利名称：重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的制备方法及其表达载体和工程菌的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF) 的制备方法及其表达载体和工程菌，属于利用DNA重组技术生产蛋白质或 多肽药物的领域。
背景技术：
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种多功能细胞因子，主要 具有调节机体造血功能、促进髓系组细胞的增殖分化等功能，在造血功能 障碍的治疗上具有广泛的用途。目前，在国家食品药品监督管理局注册共 有约15家企业注册了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
现有的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)多数均为大 肠杆菌表达产物，其制备方法主要包括①工程菌发酵；②rhGM-CSF包涵 体的制备；③包涵体的抽提及rhGM-CSF的复性；④柱层析纯化rhGM-CSF。 该方法存在以下缺点大肠杆菌的表达系统为包涵体型，生产过程中需要 复性，复性率低，最高也不超过40%，其中60%为非复性物，不能去除， 因而比活性低(最高也只有1,107单位廣克蛋白)，副作用大。
也有文献报道用酿酒酵母工程菌株进行表达来制备rhGM-CSF，但酿酒 酵母工程菌株的表达属非整合型表达，存在表达不稳定、产物表达量较低 和基因易丢失等缺陷。对于菌种的保存也具有较高的要求。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM-CSF)的制备方法，以提高目标蛋白rhGM-CSF的生物比活性，减少副作用，降低生产成本。
本发明的另一目的在于提供一种可高效表达重组人粒细胞-巨噬细胞集 落刺激因子的分泌型表达载体。
本发明的另一目的在于提供一种被所述分泌型表达载体转化的酵母重 组工程菌株，以制备重组人粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子。
本发明主要是采用酵母分泌表达系统取代大肠杆菌包涵体型表达系
统，目标蛋白rhGM-CSF不需要复性，可大幅提高其生物比活性，减少副 作用，降低生产成本。
首先，本发明提供了一种表达重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的 分泌型表达载体，该载体包含重组的rhGM-CSF序列、 一个MS2聚合酶 的SD序列，SD序列、PL启动子、及rrnB终止子序列。
根据本发明的一具体实施方案，本发明的表达重组人粒细胞-巨噬细胞 集落刺激因子的分泌型表达载体具有如图1所示的pKpL-GM-CSF的结构。 其中是将GM-CSF经过酶切处理后用T4 DNA连接酶连接到所述载体中的。 更具体地说，该分泌型表达载体是按照以下方法制备得到的
将pKpL-3a (利用pEX31b和pKK233-2构建的高效表达非融合蛋白的 表达载体，含有一个MS2聚合酶的SD序列， 一个合成SD序列、PL启动 子、起始密码子、Cat基因片段及rrnB终止子序列)用Sty I酶切，再用Klenow 片段进行末端补齐，接用Hind III酶切；
将GM-CSF的PCR产物先用Klenow处理，再用Hind III酶切；
利用T4 DNA连接酶将上述处理好的GM-CSF的PCR产物与上面处理 好的pKpl-3a连接，构建成GM-CSF表达质粒pKpL-GM-CSF。
本发明还提供了一种被所述的分泌型表达载体所转化的酵母重组菌 株。在本发明的一具体实施方案中，是将rhGM-CSF分泌型表达载体转化 毕赤酵母(Pichiapastoris)的菌株GS115，构建成分泌型表达rhGM-CSF的酵 母重组工程菌株rhGM-CSF/pKpL/GS115;并进一步通过抗生素筛选、SDS-PAGE分析及生物活性测定，获得目标酵母重组工程菌株。相关实验 表明，本发明的酵母重组工程菌株目标蛋白rhGM-CSF的表达量约占分泌 总蛋白的55%,比活性为4xl(^单位/毫克蛋白左右；目标蛋白rhGM-CSF 具有与天然GM-CSF相同的免疫原性。本发明的酵母重组工程菌株接受外 源基因是以整合于基因组形式，这与大肠杆菌、酿酒酵母的独立染色体组 外质粒表达体系有显著差别，故本发明的酵母重组工程菌株比大肠杆菌、 酿酒酵母稳定，不易发生外源基因丢失现象，以本发明的工程菌作为样品 模板，通过PCR、分子杂交等技术鉴定选择出来的阳性菌株其准确率达 100%，且其目标表达产物rhGM-CSF直接表达分泌在培养液中，因此检测 其蛋白表达量及目标产物的生物活性非常简易，这比大肠杆菌表达体系表 达产物需复性优越得多；另外，本发明中所用酵母是一种简单的真核生物， 其表达后加工模式类似高等真核生物，故用它表达的基因产物不仅具有天 然产物相同的生物活性，而且副作用低，产品成本低，适用性广。
本发明还提供了制备重组人粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子(rhGM-CSF) 的方法，该方法包括培养被分泌表达载体所转化的酵母重组菌株，分离 纯化所表达的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
在本发明的一具体的制备rhGM-CSF的方法中，是将利用所获得的高 产物表达量、高产物活性的酵母重组株进行发酵，首先将菌种活化与扩大 培养，然后接种入发酵罐，30'C培养至0.D600xl0达0.30 0.40，升温诱 导42'C保持4小时，压縮空气做气源，保持通气量lvvm ，溶氧控制30% 45%，诱导时pH7.0 7.2。
在本发明的一具体的制备rhGM-CSF的方法中，所述rhGM-CSF的纯 化方法具体可以为离心收集酵母重组菌株的发酵上清液，加硫酸铵，上 Phenyl Sepharose柱，收集目标洗脱峰；然后上DEAE Sepharose柱，收集 目标洗脱峰；接着超滤浓缩，过SephacrylS-200柱层析，收集目标蛋白峰， 得到rhGM-CSF原液。相关实验表明，利用本发明的纯化方法，所得到的蛋白纯度大于97%，蛋白浓度500pg/ml，蛋白回收率为35%，比活性大于 4.(^107单位/毫克蛋白。
综上所述，本发明主要是将克隆修饰的rhGM-CSF基因构建分泌型表 达质粒pKpL-GM-CSF，并将分泌型表达质粒pKpL-GM-CSF转化酵母菌株 GS115,构建成分泌型表达rhGM-CSF的酵母重组工程菌株，通过抗生素筛 选、SDS-PAGE分析及生物活性测定，获得目标酵母重组工程菌株，然后 发酵培养，再经分离纯化得到rhGM-CSF。利用本发明的制备rhGM-CSF 的方法，目标蛋白rhGM-CSF不需要复性，且rhGM-CSF具有高生物活性， 副作用低，适用性广，产品成本低。
图1为构建GM-CSF表达质粒pKpL-GM-CSF的图谱。 图2为rhGM-CSF纯化各步骤SDS-PAGE电泳分析图。其中，泳道1: 发酵液表达量图谱；泳道2: Phenyl Sepharose柱层析纯化图谱；泳道3: DEAE Sepharose柱层析纯化图谱；泳道4、 5、 7: Sephacryl SJOO柱层析 纯化图谱；泳道6:分子量标记物图谱。
具体实施例方式
以下通过具体实施例并结合附图详细说明本发明的技术及特点，旨在 帮助阅读者更好地理解本发明的技术实质和所具有的有益效果。
实施例l、分泌型表达载体pKpL-GM-CSF的构建
将克隆修饰的rhGM-CSF基因构建分泌型表达质粒pKpL-GM-CSF，具
体方法包括
pKpL-3a的处理将pKpL-3a(利用pEX31b(含pL启动子和噬菌体MS2 的RNA聚合酶片段基因，可高效表达MS2和外源基因产物的融合蛋白， 由德国Beck和Schaller博士惠赠)和pKK233-2(含pTrc启动子和双拷贝的rrB转录终止子(Terminator)，购自Pharmacia公司)构建的高效表达非融合 蛋白的表达载体，含有一个MS2聚合酶的SD序列， 一个合成SD序列、 PL启动子、超始密码子、Cat基因片段及rmB终止子序列)用StyI酶切， 再用Klenow片段进行末端补齐，接用Hind III酶切；
GM-CSF的PCR产物的处理将GM-CSF的PCR产物先用Klenow处 理，再用Hind III酶切;
将上述处理好的GM-CSF的PCR产物与上面处理好的pKpl-3a连接， 所用连接酶为T4 DNA连接酶，构建成GM-CSF表达质粒pKpL-GM-CSF， 其构建图谱请参见图1。
实施例2、分泌表达rhGM-CSF的酵母重组菌株的构建、筛选
将实施例1中制备得到的分泌型表达质粒pKpL-GM-CSF转化酵母 (Pichia pastoris)的菌株GS115CRGS115 (W"))(购自澳大利亚 Invitrogen公司)，构建成分泌型表达rhGM-CSF的酵母重组工程菌株 rhGM画CSF/ pKpL /GS115;
分泌型表达质粒pKpL-GM-CSF转化宿主细胞GS115的具体操作为 挑取GS115工程菌单个菌落，接种工程菌于LB培养基中(含100吗/ml Amp)，在3(TC培养振荡过夜，再以2%浓度接种于LB培养液中，到OD600 为0.4左右，培养温度升至42t:开始诱导，继续培养4小时。(菌种保藏 每支0.5ml，加入等体积甘油，-20。C冻存)
通过抗生素筛选、SDS-PAGE分析及生物活性测定，获得目标酵母重 组工程菌株。
实施例3、酵母重组菌株发酵制备rhGM-CSF以及rhGM-CSF的纯化
1、酵母重组菌株的发酵工艺
利用获得的高产物表达量、高产物活性的酵母重组菌株进行发酵，发 酵工艺主要包括保藏菌种——单菌落(Fl)—— 一级种子(F2)——二级种子(F3)培养——发酵——离心收集菌体。
1) 菌种活化与扩大培养
挑取一接种环保存菌种，划LA平板24 36小时，3(TC培养生产单菌落。
Fl发酵菌种挑取LA平板单一菌落，接入LA2ml培养基中(含氨苄) 30°C，培养箱过夜。
F2发酵菌种将Fl接到50ml/500ml三角瓶，LB培养基中(含氨苄) 30°C， 200转/min摇荡培养，至0.D600xl0达0.25 0.35时转入二级扩培。
F3发酵菌种将F2接到300ml/lL三角瓶，LA培养基中，30°C 300rpm/min摇荡培养，OJD600x10达0.30 0.40，接种入发酵罐。
2) 发酵罐发酵培养
按1: 10比例将F3接种入罐，30'C培养至0.D600xl0达0.30 0.40， 升温诱导42'C保持4小时，压縮空气做气源，保持通气量lvvm ，溶氧控 制30% 45%，诱导时pH7.0 7.2，诱导过程中，每隔1小时取样，测 OD600xl0至最大，不再增长。补料速率在培养阶段控制在补料泵20% 40%，随发酵时间以10%增长，诱导阶段，补料速率控制在补料泵60% 80%，在诱导阶段第一小时内补料速度最大。
2、 rhGM-CSF的纯化方法
利用获得的高产物表达量、高产物活性的酵母重组株进行发酵结束后， 离心收集上清液，按终浓度加20%硫酸铵，上Phenyl Sepharose柱，收集 5%硫酸铵洗脱峰；经三次25mlTris-HCl缓冲液搅拌透析，每次6h，然后上 DEAE Sepharose柱，收集0.4M NaCl洗脱峰；接着用截留分子量3000Dalton 的超滤器超滤浓縮，浓縮蛋白浓度大于5mg/ml，过Sephacryl S-200柱层析， 收集目标蛋白峰，得到rhGM-CSF原液。经检测，所得rhGM-CSF纯度大 于97%，蛋白浓度500pg/ml，蛋白回收率为35%，比活性大于4.(^107单位 /毫克蛋白。本实施例中，rhGM-CSF纯化各步骤SDS-PAGE电泳分析图请参见图2，其中，泳道l:发酵液表达量图谱；泳道2: Phenyl Sepharose柱 层析纯化图谱；泳道3: DEAE Sepharose柱层析纯化图谱；泳道4、 5、 7: SephacrylS-200柱层析纯化图谱；泳道6:分子量标记物图谱。
rhGM-CSF纯度检测法SDS-PAGE银染色电泳法，上样量5pg，只有
一个显色斑点。
rhGM-CSF活性测定方法(MTT法，比活性大于4xl(^单位/毫克蛋白)
1) 取生长良好的TF-1细胞，1000rpm离心10min，弃上清，沉淀细胞 用培养液洗涤3次后，悬浮于基本培养液中，调整细胞数量为4><105个/1111, 备用；
2) 标准品用1640液稀释成5xl0M咅，作为初始浓度；将待检品用1640 液稀释成2><105倍，作为初始浓度；
3) 在96孔板上从第一排向低浓度制备标准品和等检品倍比稀释梯度， 每个样品ll个梯度，每个梯度2孔。每孔留50pl余液，每12排做空白对 照组。每孔加入细胞悬液50pl，置37'C， 5。/。C02培养45小时。每孔加入 MTT20pl，置37X:， 5%(^02培养4小时。弃上清，每孔加入溶解液150pd， 混匀后比色。设定波长为492nm，测其OD值。
相关实验检测证明，本发明上述实施例中，酵母重组工程菌株目标蛋 白rhGM-CSF的表达量约占分泌总蛋白的55%，比活性为4xl(^单位/毫克 蛋白左右；目标蛋白rhGM-CSF具有与天然GM-CSF相同的免疫原性。本 发明的工程菌株接受外源基因是以整合于基因组形式，这与大肠杆菌、酿 酒酵母的独立染色体组外质粒表达体系有显著差别，故本发明的工程菌株 比较稳定，不易发生外源基因丢失现象，以工程菌作为样品模板，通过PCR、 分子杂交等技术鉴定选择出来的阳性菌株其准确率达100%，且其目标表达 产物rhGM-CSF直接表达分泌在培养液中，因此检测其蛋白表达量及目标 产物的生物活性非常简易。
权利要求
1、一种表达重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子rhGM-CSF的分泌型表达载体，该载体包含rhGM-CSF序列、MS2聚合酶的SD序列，SD序列、PL启动子、及rrnB终止子序列。
2、 根据权利要求1所述的分泌型表达载体，其中是将GM-CSF经过酶 切处理后用T4 DNA连接酶连接到所述载体中的。
3、 一种酵母重组工程菌株，其被权利要求1所述的分泌型表达载体所 转化。
4、 根据权利要求3所述的酵母重组工程菌株，其是由权利要求1所述 的载体转化毕赤酵母菌株GS115而得到的。
5、 一种制备重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的方法，该方法包括步骤培养权利要求3所述的酵母重组工程菌株，分离纯化所表达的重组人 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
6、 根据权利要求5所述的方法，其中，所述培养酵母重组工程菌株的 过程包括将菌种活化与扩大培养，然后接种入发酵罐，30。C培养至 0.D600xl0达0.30 0.40，升温诱导42'C保持4小时，压縮空气做气源， 保持通气量lvvm ，溶氧控制30% 45%，诱导时pH7.0 7.2。
7、 根据权利要求5所述的方法，其中，所述分离纯化的过程包括离 心收集酵母重组菌株的发酵上清液，加硫酸铵，上Phenyl Sepharose柱，收 集目标洗脱蜂；然后上DEAESepharose柱，收集目标洗脱峰；接着超滤浓 縮，过SephacrylS-200柱层析，收集目标蛋白峰，得到rhGM-CSF原液。
全文摘要
本发明提供了一种重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的制备方法及其表达载体和工程菌。本发明主要是将克隆修饰的rhGM-CSF基因构建分泌型表达质粒pKpL-GM-CSF，并转化酵母菌株GS115，构建成分泌型表达rhGM-CSF的酵母重组工程菌株，然后发酵培养，并经分离纯化得到rhGM-CSF。本发明中是采用酵母分泌表达系统取代大肠杆菌包涵体型表达系统，目标蛋白rhGM-CSF不需要复性，可大幅提高其生物比活性，减少副作用，降低生产成本。
文档编号C12R1/84GK101597619SQ20081011468
公开日2009年12月9日 申请日期2008年6月6日 优先权日2008年6月6日
发明者严旭豪, 和 姜, 马云飞 申请人:北京北医联合药业有限公司