专利名称：含有人生长激素或人粒细胞巨噬细胞刺激因子的用于治疗损伤和溃疡的外用制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种外用制剂，特别涉及含有重组人生长激素(rhGH)或重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(rhGM-CSF)的外用制剂。本发明还涉及重组人生长激素(rhGH)或重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(rhGM-CSF)在用于治疗各种损伤和溃疡的药物制备中的用途。本发明特别涉及用于治疗角膜损伤及角膜溃疡的眼部外用制剂。
背景技术：
人生长激素(hGH)是人的脑垂体腺前叶嗜酸细胞分泌的一种非糖基化多肽激素。hGH有多种生物功能，如能影响糖、蛋白和脂肪代谢，对一些细胞的增殖、分化和DNA合成有直接影响，但主要功能是刺激身体生长，包括骨骼、肌肉、结缔组织、毛发和皮肤。重组人生长激素是一种亲水性蛋白，它有两种大小不同的分子，主要组分的分子量为22KDa，有191个氨基酸残基，等电点为4.9，分子中有4个Cys残基，组成两对二硫键，分别连成大小不同的两个肽环。另有5％～10％的生长激素分子量为20KDa，有176个氨基酸残基，缺失22KDa重组人生长激素的32～46位15个氨基酸残基。
近年来，由于应用基因工程技术可以大量地生产重组人生长激素，从而促进了对生长激素的研究并扩大了其临床应用，使用的范围从原来的只限于治疗严重生长受阻的垂体性侏儒症儿童，发展到治疗其它疾病。用生长激素治疗疾病主要有以下几个方面1)治疗GH缺陷的儿童或伴随有生长受阻的疾病有些疾病在治疗过程中引起GH缺陷而影响生长，如患有脑瘤、颅咽管瘤和白血病的病人，受到颅侧放射治疗或整个躯体放射治疗，引起GH缺乏而影响生长。用rhGH治疗可使病人继续生长，而未接受治疗的儿童不能自发地恢复由于放射治疗诱导的GH缺乏。对患有成神经细胞瘤的儿童，GH也是有效的生长刺激剂。
有些疾病引起生长受阻及其它症状，但患者的GH水平并没有明显的不正常，给予GH可使症状减轻。如特纳综合症、唐氏综合症等。
2)代谢更改GH对脂肪、葡萄糖和蛋白代谢有特异性效应，因此对GH相对缺乏的儿童、成年人和老年人来说，GH能有效影响他们的各种代谢参数。
3)骨质疏松症GH能增加软骨细胞的增殖，也能增加成骨细胞的增殖和活性，GH也通过增加钙的肠道吸收来增强骨功能。
4)肾功能不良GH能增强肾功能和回复由于慢性肾衰竭引起的生长抑制。
5)生殖功能障碍GH是许多促性腺激素的受纳因子，说明GH能用于治疗男性或女性不孕症。
6)治疗烧伤病人近年来，由于GH具有间接地促进生长和直接地增强代谢、增加机体细胞和体液免疫以及降低应激反应的作用，而被广泛地用于治疗临床烧伤病人和提高术后病人的免疫力以及加速伤口愈合。
粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是由骨髓分化而成、并可由骨髓前体细胞分离得到，其生物学功能为刺激巨噬细胞和粒细胞形成集落。GM-CSF也可刺激成熟巨噬细胞、嗜酸性白细胞和嗜中性白细胞而诱导各种功能活性。GM-CSF是酸性蛋白，与GM-CSF敏感细胞的受体有很高的亲合性。
GM-CSF是活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞及成纤维细胞等细胞产生并分泌的一种酸性蛋白。成熟的rhGM-CSF由127个氨基酸组成，是含144个氨基酸的蛋白前体切去17个氨基酸的信号肽后所得的蛋白质，相对分子量为147000Da，生物活性不受糖基化的影响。
近年来，由于应用基因工程技术可以大量地生产出rhGM-CSF从而促进了对rhGM-CSF的研究并扩大了其临床应用，它是众多细胞因子中最为临床研究者所熟悉、且已正式投放市场的一种产品。GM-CSF最基本作用是刺激粒系造学祖细胞向粒细胞、巨噬细胞增殖分化，并逐渐成熟为具有吞噬功能的细胞。然而其临床应用并非如此单一，而是非常广泛，并涉及到很多领域。
目前，rhGM-CSF的临床应用现状主要包括以下几个方面(1)rhGM-CSF在肿瘤性疾病治疗中的应用1)实体肿瘤性疾病临床上，多数肿瘤化疗药物随剂量增加会增加对骨髓造血功能的毒性作用，导致中型粒细胞减少，增加感染机会。研究者证明在化疗后加用GM-CSF，则可缩短中性粒细胞减少的时间，降低感染率；同时，GM-CSF在肿瘤治疗方面可以诱导并增强外周血单核-巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
2)白血病GM-CSF有促使白细胞祖细胞更多地进入细胞周期的作用，可缩短化疗患者中性粒细胞减少期的持续时间，增加化疗药物对白血病细胞的杀灭作用，减少发热和感染并发症。
3)再生障碍性贫血在再生障碍性贫血治疗中使用GM-CSF，可是病人感染率降低50％左右。
(2)GM-CSF在骨髓移植中的应用GM-CSF能加速造血功能恢复，明显加速WBC、PMN的恢复，降低感染率、减少抗生素输注次数而缩短住院时间；同时，还可通过应用rhGM-CSF等细胞因子来调节和促进正常造血干细胞的生长。
(3)GM-CSF在抗感染治疗中的作用由于GM-CSF有刺激粒系造学祖细胞向粒细胞、巨噬细胞增殖分化，并逐渐成熟为具有吞噬功能细胞的功能，因此临床上可以协同治疗感染性疾病；另外，在艾滋病患者的菌血症及感染扩散过程中(分枝杆菌侵入到单核巨噬细胞内)，使用GM-CS能够激活被感染了的巨噬细胞，进而抑制或杀灭细胞内的分枝杆菌，可协同抗生素治疗效果。
基于GM-CSF大量的基础及临床研究结果，GM-CSF在下述几方面将具有良好的临床应用前景(1)GM-CSF有促进伤口愈合的作用动物实验表明，GM-CSF能够诱导纤维母细胞增殖以及典型肌原细胞的形成；活化中性粒细胞和单核/巨噬细胞、促进内皮细胞有丝分裂和迁移、促进角化细胞的增殖并调节纤维母细胞的表达。因此，在促进伤口愈合过程中起着非常重要的作用。
(2)根据GM-CSF对细胞周期与化疗周期中的作用特点应用本细胞因子。
利用GM-CSF对造血系统各个生长发育水平细胞均有作用这一特点，在各个化疗周期中选择合适时间，联合应用GM-CSF，则可大大减少化疗毒性而增强化疗疗效。
(3)GM-CSF的免疫增效作用众多实验表明，GM-CSF是一种非常有效的免疫佐剂，它可通过全身作用、区域性应用、局部应用、融合蛋白及体外活化抗原表达细胞等五种方式来增强机体对疫苗(抗原)的免疫应答，增强机体对疾病的免疫抵抗能力。
由于GH和GM-CSF理化性质的特殊性，如易于在肠道中分解，目前在临床治疗中均以注射液的方式使用。到目前为止，还没有将rhGH和rhGM制成外用制剂用于治疗各种损伤和溃疡，特别是在角膜损伤及角膜溃疡中的应用未见报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种外用制剂，该制剂含有重组人生长激素或重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子，和外用制剂辅料。
本发明的另一个目的是提供所述外用制剂的制备方法。
本发明的再一个目的是提供重组人生长激素(rhGH)及重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(rhGM-CSF)在用于治疗各种损伤和/或溃疡，特别是角膜损伤和/或溃疡的药物中的用途。
图1为外用rhGH与阳性和阴性对照组在治疗角膜溃疡的不同时间的观察结果。
图2为外用rhGM-CSF与阳性和阴性对照组在治疗角膜溃疡的不同时间的观察结果。
具体实施例方式
在本发明的外用制剂中，以外用制剂总重量的百分比计，所述外用制剂含有0.015-0.35％，优选0.035-0.25％，更优选0.07-0.14％的生长激素或0.0003-0.002％，优选0.0005-0.0015％，更优选0.0008-0.0012％的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子。
所述的外用制剂的单位制剂中，rhGH的浓度为150-3500μg/g基质，优选为350-3000μg/g基质，更优选为700-1400μg/g基质；或所述rhGM-CSF的浓度为3-20μg/g基质，优选为5-15μg/g基质，更优选为8-12μg/g基质。
本发明的外用制剂可以为眼用滴眼液、眼用凝胶剂或眼用膏剂。
对于所述眼用滴眼液来说，以制剂总重量的百分比计，其含有0.015-0.35％的生长激素或0.0003-0.002％的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子，0.1-约40％的制剂辅料，和余量的无菌注射用水。
对于所述眼用凝胶剂或眼用膏剂来说，以制剂总重量的百分比计，其含有0.015-0.35％的生长激素或0.0003-0.002％的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子，30-90％的增稠剂，0.1-约40％的除增稠剂以外的制剂辅料，和余量的无菌注射用水。
本发明的外用制剂中，作为基质成分的用于凝胶剂的所述增稠剂为选自聚乙烯醇、聚维酮、纤维素衍生物、甲基纤维素、羟丙甲纤维素、羟乙纤维素、羟丙纤维素、羧甲基纤维素、卡波姆、西黄蓍胶、透明质酸钠、明胶、淀粉、丙二醇、甘油、黄原胶、壳聚糖类、海藻酸钠、磷脂、泊洛沙姆、液体石蜡、凡士林、羧甲基纤维素钠、羊毛脂、聚山梨脂、聚氧乙烯、脂肪油、胶体硅、铝皂或锌皂的物质。
作为基质成分用于膏剂的所述增稠剂为选自豚脂、植物油、氢化植物油、硫酸化氢化蓖麻油、凡士林、石蜡、地蜡、液体石蜡、羊毛脂、羊毛醇、蜂蜡、白蜂蜡、鲸蜡、胆固醇、一价皂、鲸蜡醇、硬脂醇、十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠、甘油单硬脂酸酯、聚甘油硬脂酸酯、吐温-20、21、40、60、61、65、80、81、85、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯的物质、甘油明胶、淀粉甘油、海藻酸钠、聚乙二醇、甲基纤维素、羟甲基纤维素钠。
所述制剂辅料以制剂总重量的百分比计，包括0.1-10％的等渗调节剂，0-5％的蛋白稳定剂，0.5-5％的pH调节剂，0-30％的保湿剂，0-0.2％的防腐剂和0-2％的抗氧化剂。
所述制剂辅料为选自甘露醇、甘油、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、人血白蛋白、环糊精、丙二醇、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、偏重亚硫酸钠、硫代硫酸钠、甲醛合次硫酸氢钠、氢氧化钠、盐酸、硫酸、枸橼酸、枸橼酸钠、硼酸、硼酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、马来酸、马来酸钠、组氨酸、三乙醇胺、氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨酸、山梨酸钾、苯乙醇、苯氧乙醇、三氯叔丁醇、溴化苯甲烃铵(新洁尔灭)、杜灭芬、双氯苯双胍已烷、硝酸苯汞、硫柳汞、对羟基苯甲酸酯类的物质。其中的多种物质可同时作为所述制剂辅料中的等渗调节剂、蛋白稳定剂、pH调节剂、保湿剂、和抗氧化剂。例如，甘油可同时作为等渗调节剂、蛋白稳定剂和保湿剂使用，甘露醇可同时作为等渗调节剂和蛋白稳定剂使用等。
本发明的外用滴眼液的制备方法包括基于组合物总重量的百分比，在含有0.015-0.35％的生长激素或0.0003-0.002％的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的溶液中，加入根据需要的0.1-40％的制剂辅料，然后加入无菌注射用水至定量，混合均匀后进行除菌处理，例如用滤膜除菌。
本发明的外用凝胶剂或膏剂的制备方法包括基于组合物总重量的百分比，将30-90％的作为基质的增稠剂熔融或溶涨，根据需要将0.1-40％的制剂辅料加至熔融或溶涨的基质中，并加入无菌注射用水，混合均匀后进行除菌处理，例如经高压湿灭或滤膜除菌，待冷却至常温后，加入经过滤膜除菌的含0-5％的蛋白稳定剂和0.015-0.35％的rhGH或0.0003-0.002％的rhGM-CSF溶液，加入无菌注射用水补足余量，混合均匀，冷却，罐装。
本发明的重组人生长激素(rhGH)及重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(rhGM-CSF)可用于治疗各种皮肤损伤和/或溃疡，特别是角膜外伤或角膜溃疡，如包括穿孔伤或擦伤的角膜外伤及角膜溃疡等。
本发明的制剂可与其它具有协同治疗作用的药剂合用，如具有促进上皮与基质粘附作用的药物、抗生素或人工泪液等。具体药剂如地塞米松、氟米龙滴眼液、泰利必妥滴眼液、阿托品滴眼液、人工泪液等。
为了更好地理解本发明的实质，下面用重组人生长激素和重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子外用制剂在治疗角膜外伤、角膜溃疡以及皮肤溃疡的药效学试验来说明其在制药领域中的用途。由于眼用制剂是外用制剂中要求标准最高的制剂，因此，本发明以眼用制剂来举例说明，但本发明的外用制剂绝不仅限于眼用制剂。对于其它的外用制剂，本领域的技术人员可以根据常规技术进行配制。
在本发明的外用制剂中，所述rhGH或rhGM-CSF是长春金赛药业有限责任公司通过基因工程技术生产上市的安全的rhGH和rhGM-CSF，其商品名分别为赛增和金磊赛源。其各项物化指标完全符合《中华人民共和国药典》(2005年版)中的各项规定。
下面用实施例的方式来具体地说明和解释本发明。
滴眼液实施例1向含有200mg的rhGH或2.5mg的rhGM-CSF的20ml水溶液中加入1g白蛋白，再加入1g甘露醇及2g甘油，用5％的柠檬酸水溶液调pH至6.5，加入无菌注射用水至100ml定容，混匀后过0.2μm的滤膜除菌后，制成rhGH滴眼液或rhGM-CSF滴眼液。
实施例2向含有150mg的rhGH或1.2mg的rhGM-CSF的20ml水溶液中加入0.5g葡聚糖，再加入0.5g甘露醇及5g甘油，用10％的硼酸水溶液调pH至6.5，加入无菌注射用水至100ml定容，混匀后过0.2μm的滤膜除菌后，制成rhGH滴眼液或rhGM-CSF滴眼液。
眼用凝胶剂实施例3在称量过的容器内高速搅拌下加入0.3g卡波姆934、0.05g山梨酸钾、0.1g泊洛沙姆和70ml的水，用1N的氢氧化钠水溶液调节pH值至5.5，在115℃灭菌20分钟，待冷却至室温时加入除菌后的含0.5g白蛋白和75mg的rhGH溶液或含0.5g白蛋白和0.5mg的rhGM-CSF的溶液，加入无菌注射用水定容至100ml，搅拌均匀后分装待用，制成rhGH眼用凝胶剂或rhGM-CSF眼用凝胶剂。
实施例4在称量过的容器内加入1g羧甲基纤维素钠、0.15g山梨酸、0.2g吐温-80和70ml的水，溶胀过夜后，在115℃灭菌20分钟，待冷却至室温时加入已除菌的含1g葡聚糖和70mg的rhGH溶液或含1g葡聚糖和3mg的rhGM-CSF溶液，加入无菌注射用水定容至100ml，搅拌均匀后分装待用，制成rhGH眼用凝胶剂或rhGM-CSF眼用凝胶剂。
实施例5在称量过的容器内搅拌下加入1g甲基纤维素、0.1g泊洛沙姆和70ml的水，溶胀过夜，在115℃灭菌20分钟，待冷却至室温时加入已除菌的含0.5g白蛋白和35mg的rhGH溶液或含0.5g白蛋白和0.75mg的rhGM-CSF溶液，加入无菌注射用水定容至100ml，搅拌均匀后分装待用，制成rhGH眼用凝胶剂或rhGM-CSF眼用凝胶剂。
实施例6在称量过的容器内搅拌下加入0.8g羟丙基甲基纤维素钠、0.2g吐温-80和70ml的水，加热溶胀均匀，在115℃灭菌20分钟，待冷却至室温时加入已除菌的含2g白蛋白和含350mg的rhGH溶液或含2g白蛋白和2.0mg的rhGM-CSF的蛋白溶液，加入无菌注射用水定容至100ml，搅拌均匀后分装待用，制成rhGH眼用凝胶剂或rhGM-CSF眼用凝胶剂。
实施例7在称量过的容器内搅拌下加入0.1g透明质酸钠、0.1g泊洛沙姆和70ml的水，溶胀过夜，用0.2μm滤膜过滤除菌后，加入已除菌的含0.5g白蛋白及125mg的rhGH溶液或含0.5g白蛋白和1mg的rhGM-CSF的蛋白溶液，加入无菌注射定容至100ml，搅拌均匀后分装待用，分别制成rhGH眼用凝胶剂或rhGM-CSF眼用凝胶剂。
实施例8在称量过的容器内搅拌下加入1g西黄蓍胶、0.10g山梨酸、0.1g泊洛沙姆、2g甘油和70ml的水，溶胀过夜，在115℃灭菌20分钟，待冷却至室温时加入已除菌的含1.5g白蛋白和175mg的rhGH溶液或含1.5g白蛋白和1.25mg的rhGM-CSF的蛋白溶液，加入无菌注射定容至100ml，搅拌均匀后分装待用，分别制成rhGH眼用凝胶剂或rhGM-CSF眼用凝胶剂。
实施例9在称量过的容器内搅拌下加入1.5g海藻酸钠、0.15g山梨酸、0.1g泊洛沙姆和70ml的水，溶胀过夜，在115℃灭菌20分钟，待冷却至室温时加入已除菌的含2g葡聚糖及250mg的rhGH溶液或含2g葡聚糖和1.75mg的rhGM-CSF溶液，加入无菌注射用水至100ml，搅拌均匀后分装待用，分别制成rhGH眼用凝胶剂或rhGM-CSF眼用凝胶剂。
实施例10在称量过的容器内搅拌下加入0.2g透明质酸钠、0.1g泊洛沙姆188、0.75g组氨酸和70ml的水，溶胀过夜，用0.2μm滤膜过滤除菌后，加入已除菌的含130mg的rhGH溶液或含1mg的rhGM-CSF溶液，加入无菌注射用水至100ml，搅拌均匀后分装待用，分别制成rhGH眼用凝胶剂或rhGM-CSF眼用凝胶剂。
实施例11在称量过的容器内搅拌下加入0.1g透明质酸钠、0.1g泊洛沙姆188、0.03g尼泊金乙酯、0.6g组氨酸和70ml的水，溶胀过夜，用0.2μm滤膜过滤除菌后，加入已除菌的含65mg的rhGH溶液或含0.5mg的rhGM-CSF溶液，加入无菌注射用水至100ml，搅拌均匀后分装待用，分别制成rhGH眼用凝胶剂或rhGM-CSF眼用凝胶剂。
实施例12在称量过的容器内搅拌下加入0.4g透明质酸钠、0.1g泊洛沙姆188、4.5g甘露醇、0.7g硼酸和70ml的水，溶胀过夜，在115℃灭菌20分钟，待冷却至室温时加入已除菌的含15mg的rhGH溶液或含0.03mg的rhGM-CSF溶液，加入无菌注射用水至100ml，搅拌均匀后分装待用，分别制成rhGH眼用凝胶剂或rhGM-CSF眼用凝胶剂。
实施例13在称量过的容器内搅拌下加入0.25g透明质酸钠、0.15g泊洛沙姆188、3.0g甘露醇、0.02g尼泊金乙酯、1.0g柠檬酸和70ml的水，溶胀过夜，在115℃灭菌20分钟，待冷却至室温时加入已除菌的含350mg的rhGH溶液或含2mg的rhGM-CSF溶液，加入无菌注射用水至100ml，搅拌均匀后分装待用，分别制成rhGH眼用凝胶剂或rhGM-CSF眼用凝胶剂。
实施例14在称量过的容器内搅拌下加入0.2g透明质酸钠、0.1g泊洛沙姆188、0.70g组氨酸和70ml的水，溶胀过夜，用0.2μm滤膜过滤除菌后，加入已除菌的含150mg的rhGH溶液或含1.2mg的rhGM-CSF溶液，加入无菌注射用水至100ml，搅拌均匀后分装待用，分别制成rhGH眼用凝胶剂或rhGM-CSF眼用凝胶剂。
眼用软膏实施例15在称量过的容器内加入60g的液体石腊、20g的凡士林、0.1g泊洛沙姆、0.15g山梨酸，加热至60℃，使其溶解，将混合后的基质在121℃灭菌30分钟，温度降至40℃时加入已除菌的含1g白蛋白及200mg的rhGH溶液或含1g白蛋白和1.5mg的rhGM-CSF溶液，加入无菌注射用水至100ml，搅拌均匀后分装待用，分别制成rhGH眼用膏剂或rhGM-CSF眼用膏剂。
实施例16在称量过的容器内加入70g的黄凡士林、10g的液体石蜡、0.1g泊洛沙姆、0.15g山梨酸，加热至60℃，使其溶解，将混合后的基质在121℃灭菌30分钟，温度降至40℃时加入已除菌的含0.5g白蛋白及30mg的rhGH溶液或含0.5g白蛋白和0.3mg的rhGM-CSF溶液，加入无菌注射用水至100ml，搅拌均匀后分装待用，分别制成rhGH眼用膏剂或rhGM-CSF眼用膏剂。
实施例17在称量过的容器内加入60g的凡士林、10g的羊毛脂、10g液体石蜡、0.15g山梨酸，加热至60℃，使其溶解，将混合后的基质在121℃灭菌30分钟，温度降至40℃时加入已除菌的含1.5g白蛋白及250mg的rhGH溶液或含1.5g白蛋白和1.25mg的rhGM-CSF溶液，加入无菌注射用水至100ml，搅拌均匀后分装待用，分别制成rhGH眼用膏剂或rhGM-CSF眼用膏剂。
实施例18在称量过的容器内加入60g的聚乙二醇400、20g的硬脂醇、0.1g泊洛沙姆、0.15g山梨酸，加热至60℃，使其溶解，将混合后的基质在121℃灭菌30分钟，温度降至40℃时加入已除菌的含1g白蛋白及150mg的rhGH溶液或含1g白蛋白和1mg的rhGM-CSF溶液，加入无菌注射用水至100ml，搅拌均匀后分装待用，分别制成rhGH眼用膏剂或rhGM-CSF眼用膏剂。
实施例19在称量过的容器内加入60g的氢化植物油、15g的石蜡油、8g的蓖麻油、0.15g山梨酸，加热至60℃，使其溶解，将混合后的基质在121℃灭菌30分钟，温度降至40℃时加入已除菌的含1g白蛋白及100mg的rhGH溶液或含1g白蛋白和0.75mg的rhGM-CSF溶液，加入无菌注射用水至100ml，搅拌均匀后分装待用，分别制成rhGH眼用膏剂或rhGM-CSF眼用膏剂。
实施例20在称量过的容器内加入13.5g的鲸蜡醇、10g的羊毛脂、10g的凡士林、20g液体石蜡、0.15g山梨酸，加热至60℃，使其溶解，将混合后的基质在121℃灭菌30分钟，温度降至40℃时加入已除菌的含0.75g白蛋白及75mg的rhGH溶液或含0.75g白蛋白和0.55mg的rhGM-CSF溶液，加入无菌注射用水至100ml，搅拌均匀后分装待用，分别制成rhGH眼用膏剂或rhGM-CSF眼用膏剂。
外用rhGH及rhGM-CSF对角膜损伤及角膜溃疡的治疗作用1、实验方法(1)兔无菌角膜溃疡动物模型的制作采用氯胺酮0.5ml/Kg+安定0.5ml/Kg肌肉注射麻醉兔。在无菌条件下，使用显微器械在显微镜下操作。将家兔的右眼角膜中央用5mm环钻制作成大小为5mm、深度为0.1mm(约1/3角膜厚度)的无菌性穿孔伤及角膜溃疡。术毕点用托百士。
(2)动物分组将64只新西兰大白兔(体重2.0-2.5Kg)随机分成8组，每组8只。第一组为生理盐水组，第二组为阳性对照药(贝复舒)组，第三组为实施例1的rhGH滴眼液组，第四组为实施例2的rhGM-CSF滴眼液组，第五组为实施例14的rhGH凝胶剂组，第六组为实施例7的rhGM-CSF凝胶剂组，第七组为实施例18的rhGH软膏剂组，第八组为实施例15的rhGM-CSF软膏剂组。
(3)术后点药术后当天8组48只兔点用托百士3次。自术后第一天开始分别点用如上述制备的rhGH或rhGM-CSF滴眼液、凝胶剂及膏剂，并用0.9％的生理盐水和贝复舒分别作为阴性和阳性对照，具体给药方法如下第一组0.9％生理盐水 每日3次+托百士每日3次第二组贝复舒 每日3次+托百士每日3次第三组rhGH滴眼液 每日3次+托百士每日3次第四组rhGM-CSF滴眼液 每日3次+托百士每日3次第五组rhGH凝胶剂 每日3次+托百士每日3次第六组rhGM-CSF凝胶剂 每日3次+托百士每日3次第七组rhGH膏剂 每日3次+托百士每日3次第八组rhGM-CSF膏剂 每日3次+托百士每日3次观察记录8组64只兔角膜溃疡在术后第3、7、10、14、18、21和28天的愈合情况，结果见附图1。
(4)观察及照相记录术后第3天、第7天、第10天、第14天、第18天、第21天和第28天、观察记录8组64只兔角膜溃疡愈合情况，包括角膜溃疡面大小变化、有无感染及穿孔。每组选取2只兔使用TOPCON裂隙灯照相系统记录在柯达胶片上，扫描入计算机，备图像分析使用。
2、实验结果3.1愈合标准(1)基本愈合无明显溃疡面、仅有上皮粗糙或点状着染。(2)完全愈合无溃疡面、无上皮粗糙无点状着染。
3.2观察结果8组64只眼无1例感染。兔角膜溃疡面宽和高的测量记录见表1、图1和2。
表1.外用rhGH及rhGM-CSF与阳性和阴性对照组治疗角膜溃疡的不同时间的观察结果
续表1
第一组从第7天开始角膜溃疡面积逐渐减小；第18天1只眼基本愈合；第21天4只眼基本愈合；至第28天实验结束时4只眼基本愈合，4只眼完全愈合。
第二组从第3天开始角膜溃疡面积逐渐减小；第14天1只眼基本愈合；第18天3只眼基本愈合；第21天3只眼基本愈合，2只眼完全愈合，至第28天实验结束时2只眼基本愈合，6只眼完全愈合。
第三组从第3天开始角膜溃疡面积明显减小；第7天1只眼基本愈合；第10天2只眼基本愈合；第14天3只眼基本愈合，5只眼完全愈合；第18天1只眼基本愈合，7只眼完全愈合；第21天2只眼基本愈合，6只眼完全愈合；至第28天实验结束时8只眼完全愈合。
第四组从第3天开始角膜溃疡面积逐渐减小；第7天1只眼基本愈合；第10天1只眼基本愈合；第14天3只眼基本愈合，1只眼完全愈合；第18天4只眼基本愈合，2只眼完全愈合；第21天6只眼基本愈合，2只眼完全愈合；至第28天实验结束时5只眼基本愈合，3只眼完全愈合。
第五组从第3天开始角膜溃疡面积明显减小；第7天3只眼基本愈合；第10天3只眼基本愈合，2只眼完全愈合；第14天2只眼基本愈合，6只眼完全愈合；第18天6只眼完全愈合；第21天1只眼基本愈合，7只眼完全愈合；至第28天实验结束时8只眼完全愈合。
第六组从第3天开始角膜溃疡面积逐渐减小；第7天2只眼基本愈合；第10天4只眼基本愈合；第14天3只眼基本愈合，1只眼完全愈合；第18天6只眼基本愈合，2只眼完全愈合；第21天4只眼基本愈合，4只眼完全愈合；至第28天实验结束时1只眼基本愈合，7只眼完全愈合。
第七组从第3天开始角膜溃疡面积明显减小；第7天2只眼基本愈合；第10天2只眼基本愈合，2只眼完全愈合；第14天2只眼基本愈合，6只眼完全愈合；第18天1只眼基本愈合，7只眼完全愈合；第21天8只眼完全愈合；至第28天实验结束时8只眼完全愈合。
第八组从第3天开始角膜溃疡面积逐渐减小；第10天3只眼基本愈合；第14天2只眼基本愈合，3只眼完全愈合；第18天4只眼基本愈合，4只眼完全愈合；第21天3只眼基本愈合，5只眼完全愈合；至第28天实验结束时2只眼基本愈合，6只眼完全愈合。
3、实验结论本实验将其应用于兔无菌性角膜溃疡的动物模型中，采用局部点药的方法，观察其对兔浅层角膜溃疡的治疗效果。从实验结果可以看出无论rhGH还是rhGM-CSF对角膜浅基质和上皮的修复都有明显的促进作用，具体得出以下结论3.1 rhGH(滴眼液、凝胶剂、膏剂)、rhGM-CSF(滴眼液、凝胶剂、膏剂)及贝复舒(阳性对照药)与阴性对照组相比，明显缩短了溃疡的愈合时间，溃疡面积平均值与阴性对照组相比存在显著性差异。由此可见，rhGH与rhGM在治疗无菌性角膜溃疡中有良好的应用前景。
3.2 rhGH(滴眼液、凝胶剂、膏剂)在促进溃疡愈合和抑制溃疡复发中作用优于有确定疗效的贝复舒阳性对照组，溃疡面积平均值存在显著性差异。rhGM-CSF(滴眼液、凝胶剂、膏剂)组与贝复舒阳性对照组相比对无菌角膜溃疡的愈合具有相似的疗效，溃疡面积平均值无显著性差异。
3.3 rhGH与rhGM-CSF的外用制剂(滴眼液、凝胶剂、膏剂)在促进溃疡愈合作用过程中，其凝胶剂与膏剂比液体制剂疗效稍佳，但在统计学上无显著性差异。
3.4在实验观察过程中，个别实验组中的个别实验兔在溃疡愈合过程中出现了反复，即溃疡在愈合后或面积减小后又出现上皮缺损或溃疡面积扩大的表现。这与兔角膜浅层溃疡愈合的病理过程有关。研究发现正常角膜上皮与基质的粘附作用对维持角膜表面的完整性有十分重要的意义，其中基底膜复合结构对维持这种紧密粘附起主要作用。当角膜上皮连同基底膜和浅层基质被去除后，虽然上皮层可以在4天内很快覆盖溃疡表面，但在8周或更长的时间内都不能与下方基质形成紧密连接，因此当受到轻微的外伤或摩擦时就可以导致上皮再次剥脱。因此上皮与基质间粘附形成的延迟是造成角膜溃疡复发的原因。提示在治疗角膜浅层溃疡时联合使用促进上皮与基质粘附形成的药物将会有效防止复发。
外用rhGH及rhGM-CSF对皮肤溃疡的疗效将男性22例，女性26例，年龄在10-42岁的口腔溃疡患者48例随机分成两组，分别用含有800μg/ml rhGH的膏剂+含有3mg/ml的地塞米松的糊剂和单独使用含有3mg/ml的地塞米松的糊剂作为对照，患者持续用药3天每天3次。结果列于表2中。
表2
由表2的结果可以看出，通过结合使用生长激素和地塞米松，可以加快创面的愈合。
权利要求
1.一种外用制剂，该制剂含有重组人生长激素或重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子，和外用制剂辅料。
2.如权利要求1所述的外用制剂，其中以外用制剂总重量的百分比计，所述外用制剂含有0.015-0.35％的生长激素或0.0003-0.002％的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子。
3.如权利要求1或2所述的外用制剂，其中单位制剂中的rhGH的浓度为150-3500μg/g基质，优选为350-3000μg/g基质，更优选为700-1400μg/g基质；或所述rhGM-CSF的浓度为3-20μg/g基质，优选为5-15μg/g基质，更优选为8-12μg/g基质。
4.如权利要求1或2所述的外用制剂，该外用制剂为眼用滴眼液、眼用凝胶剂或眼用膏剂。
5.如权利要求4所述的外用制剂，其中以制剂总重量的百分比计，所述眼用滴眼液含有0.015-0.35％的生长激素或0.0003-0.002％的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子，0.1-40％的制剂辅料，和余量的无菌注射用水。
6.如权利要求4所述的外用制剂，其中以制剂总重量的百分比计，所述眼用凝胶剂或眼用膏剂含有0.015-0.35％的生长激素或0.0003-0.002％的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子，30-90％的增稠剂，0.1-40％的除增稠剂以外的制剂辅料，和余量的无菌注射用水。
7.如权利要求6所述的外用制剂，其中作为基质成分用于凝胶剂的所述增稠剂为选自聚乙烯醇、聚维酮、纤维素衍生物、甲基纤维素、羟丙甲纤维素、羟乙纤维素、羟丙纤维素、羧甲基纤维素、卡波姆、西黄蓍胶、透明质酸钠、明胶、淀粉、丙二醇、甘油、黄原胶、壳聚糖类、海藻酸钠、磷脂、泊洛沙姆、液体石蜡、凡士林、羧甲基纤维素钠、羊毛脂、聚山梨脂、聚氧乙烯、脂肪油、胶体硅、铝皂或锌皂的物质。
8.如权利要求6所述的外用制剂，其中作为基质成分用于膏剂的所述增稠剂为选自豚脂、植物油、氢化植物油、硫酸化氢化蓖麻油、凡士林、石蜡、地蜡、液体石蜡、羊毛脂、羊毛醇、蜂蜡、白蜂蜡、鲸蜡、胆固醇、一价皂、鲸蜡醇、硬脂醇、十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠、甘油单硬脂酸酯、聚甘油硬脂酸酯、吐温-20、21、40、60、61、65、80、81、85、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯的物质、甘油明胶、淀粉甘油、海藻酸钠、聚乙二醇、甲基纤维素或羟甲基纤维素钠的物质。
9.如权利要求5或6所述的外用制剂，其中所述制剂辅料包括以制剂总重量计，0.1-10％的等渗调节剂、0-5％的蛋白稳定剂、0.5-5％的pH调节剂、0-30％的保湿剂、0-0.2％的防腐剂和0-2％的抗氧剂。
10.如权利要求8所述的外用制剂，其中所述制剂辅料选自甘露醇、甘油、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、人血白蛋白、环糊精、丙二醇、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、偏重亚硫酸钠、硫代硫酸钠、甲醛合次硫酸氢钠、氢氧化钠、盐酸、硫酸、枸橼酸、枸橼酸钠、硼酸、硼酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、马来酸、马来酸钠、组氨酸、三乙醇胺、氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨酸、山梨酸钾、苯乙醇、苯氧乙醇、三氯叔丁醇、溴化苯甲烃铵、杜灭芬、双氯苯双胍己烷、硝酸苯汞、硫柳汞、对羟基苯甲酸酯类的物质。
11.重组人生长激素及重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子在用于制备治疗皮肤损伤和/或溃疡的药物中的用途。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述损伤或溃疡为角膜外伤或角膜溃疡。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述角膜外伤为无菌性穿孔伤或溃疡。
14.如权利要求11-13任意一项所述的用途，其中将含有重组人生长激素或重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的外用制剂与选自具有促进上皮与基质粘附作用的药剂、抗生素或人工泪液合用。
15.如权利要求14所述的用途，其中将含有重组人生长激素或重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的外用制剂与选自地塞米松、氟米龙滴眼液、泰利必妥滴眼液、阿托品滴眼液或人工泪液合用。
16.权利要求5所述的外用滴眼液的制备方法，该方法包括基于组合物总重量的百分比，在含有0.015-0.35％的生长激素或0.0003-0.002％的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子的溶液中，加入根据需要的0.1-40％的制剂辅料，然后加入无菌注射用水至定量，混合均匀后进行除菌处理。
17.权利要求6所述的外用制剂的制备方法，该方法包括基于组合物总重量的百分比，将30-90％的作为基质成分的增稠剂熔融或溶涨，根据需要将0.1-40％的制剂辅料加至熔融或溶涨的基质中，并加入无菌注射用水，混合均匀后进行除菌处理，然后在常温下，加入经过除菌的含0-5％的蛋白稳定剂和0.015-0.35％的生长激素或0.0003-0.002％的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子溶液，再加入无菌注射用水补足余量，混合均匀。
全文摘要
本发明提供一种外用制剂及其制备方法，所述外用制剂含有重组人生长激素(rhGH)或重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(rhGM－CSF)和外用制剂的辅料。本发明的外用制剂可以是滴眼液、眼用凝胶剂或眼用药膏等。本发明还涉及重组人生长激素(rhGH)或重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子(rhGM－CSF)在用于治疗各种损伤和溃疡，特别是角膜损伤及角膜溃疡的药物制备中的用途。
文档编号A61P27/02GK1939534SQ20051010573
公开日2007年4月4日 申请日期2005年9月27日 优先权日2005年9月27日
发明者金磊, 裴瑾, 孟钢, 胡君梅 申请人:长春金赛药业有限责任公司