专利名称：一种细胞信号通路抑制剂诱导猪脂肪细胞形成的方法
技术领域：
本发明公开一种细胞信号通路抑制剂诱导猪脂肪细胞形成的方法，将猪胚胎成纤维细胞转化脂肪细胞，属于细胞诱导技术领域。
背景技术：
由于临床治疗的需要，人们需要特殊分化的细胞来治疗疾病，所以干细胞诱导及分化技术逐渐成熟，但随之发现，一些细胞能够不通过干细胞状态直接分化成另一种类型的分化细胞，所报道的方法都是以转基因的手段来实现的，直接将终末分化的细胞转化为其他类型的功能细胞如将胚胎成纤维细胞、成软骨细胞和视网膜上皮细胞转变为具收缩特性的肌细胞；将B淋巴细胞转变为巨噬细胞；将胰岛外分泌细胞转化为β胰岛细胞样细胞；将小鼠成纤维细胞转化为功能性的神经细胞；将小鼠心肌内成纤维细胞重新编程为心肌细胞来修复受损的心脏。由于诱导细胞编程都是以转基因为主，其转基因后导致的外源基因插入突变对生物安全性有严重的影响，并且该方法获得的细胞在疾病治疗或者器官移植中都是不可用的，这就导致了目前的方法只适用于研究而不适用于临床治疗。目前，对脂肪细胞分化及调控方面的研究主要使用体外分化系统。现在已经建立起来的最有代表性的两个前脂肪细胞系是Green和Kehinde从17 — 19天小鼠胚胎的中胚层多能干细胞中分离并诱导分化出来的，即3T3-F442A和3T3-L1小鼠前脂肪细胞系，当用适当的诱导剂进行诱导刺激时，约经过一周左右的时间就可分化成为充满着脂肪滴的脂肪细胞。如利用该方法得到脂肪细胞，就必须预先分离得到前脂肪祖细胞，这就使得获得脂肪细胞的难度大大增加，并且前脂肪细胞在动物体内含量较少且不易分离纯化，所以人们通常使用前脂肪细胞系由于研究，但其作为一种成系细胞，具有一定的致瘤性，并不适用于疾病治疗。
发明内容
本发明提供一种细胞信号通路抑制剂诱导猪脂肪细胞形成的方法，通过细胞信号通路抑制剂作于细胞，获得的猪脂肪细胞没有外源基因的插入，解决了转基因后导致的外源基因插入突变对生物安全性影响的问题。本发明的技术解决方案如下
将猪胚胎成纤维细胞以Γ6Χ IO4个/ cm2的比例均勻的接种到Corning细胞培养板中，使用诱导培养基培养；37°C ,5% CO2培养箱中培养20天时，对细胞进行观察并油红0染色，可发现油红0着色细胞，证明其确实为脂肪细胞；
诱导培养基配方为15% (v/v) Knockout Serum Replacement (Invitrogen)血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培养基，0. ImM 非必须氨基酸 Gnvitrogen)， 0. 055πιΜβ -巯基乙醇(Invitrogen)，2 mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0. 2-1 μ M SB431542 (Stemgent)。所述细胞信号通路抑制剂诱导猪脂肪细胞形成的方法，还可加入0. 5-2 μ M通路抑制剂Thiazovivin后使其效率增加。细胞信号通路抑制剂SB431542和Thiazovivin分别作用于TGF-β /smad信号通路和ROCK信号通路。Smad3能够与通过C/E B P β的Mad homology 1区域的结合，影响C/ E BP β与DNA的结合，从而抑制其活性，抑制脂肪细胞转化。因此通过细胞信号通路抑制剂 SB431542的处理，可以抑制TGF- β /smad信号通路的活性，促进脂肪细胞的形成。而ROC家族成员能够直接调节细胞骨架中的肌动蛋白进行重组，还能够调节如细胞能动性、粘附力、 胞质分裂等多种与肌动蛋白细胞骨架相关的细胞功能。ROCK介导的他0信号肽是通过磷酸化某些参与肌动蛋白丝组装及收缩的底物来调节肌动蛋白细胞骨架的。而在脂肪形成的过程中丝状的肌动蛋白结构发生改变，从长的张力纤维变成皮质肌动蛋白。因此抑制ROCK信号通路可促进脂肪细胞的形成。本发明的积极效果在于利用细胞信号通路抑制剂而非转基因来诱导细胞转化， 可有效的防止细胞基因组因插入外源基因而导致的基因突变。同时该方法对于研究脂肪细胞的形成机制有一定的促进作用，其简便性和安全性可被广泛的应用，可用于脂肪形成机制的研究，也能在疾病治疗等临床应用上发挥作用。
图1为实施例1诱导得到的脂肪细胞；
图2为实施例1诱导得到的脂肪细胞油红0染色； 图3为实施例IRT-PCR分析脂肪特异基因表达； 图4为实施例1细胞免疫荧光染色分析脂肪特异基因表达； 图5为实施例2诱导得到的脂肪细胞油红0染色； 图6为实施例3诱导得到的脂肪细胞油红0染色； 图7为实施例4诱导得到的脂肪细胞油红0染色； 图8为实施例5诱导得到的脂肪细胞油红0染色； 图9为实施例6诱导得到的脂肪细胞油红0染色； 图10为实施例7诱导得到的脂肪细胞油红0染色； 图11为实施例8诱导得到的脂肪细胞油红0染色。
具体实施例方式下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。实施例1
0. 5 μ M细胞信号通路抑制剂SB431542可诱导猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞将猪胚胎成纤维细胞以5 X IO4个/ cm2的比例均勻的接种到6cm细胞培养板中，使用诱导培养基培养。诱导培养基配方为15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培养基，0. ImM 非必须氨基酸 Gnvitrogen)， 0·055πιΜβ-巯基乙醇 Gnvitrogen)，2mM L-谷氨酰胺 Qnvitrogen)，0. 5 μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培养箱中培养。
结果表明诱导培养20天时，经观察可发现有明亮的、富含脂滴的细胞的形成 (参见图1、图2)。油红0染色后可观察到被染成红色的圆形的脂滴，猪脂肪特异性基因 (PPAR γ，C/EBP α、β、δ，LPL, ΑΡ2, Adipoq, CFD, SLC2A4)经 PCR 后分另Ij为 172，130，148， 127，150，114，229，88，83bp处出现特异性条带，细胞免疫荧光呈阳性。证明0.5μΜ的 SB431542能够促使猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞，计算得到的效率为17. 3%。参见图3、20天时，诱导的到的脂肪细胞表达脂肪特异性基因，β-actin作为对照。特异基因 PPAR γ，C/EBP α、β、δ，LPL, ΑΡ2, Adipoq, CFD, SLC2A4, β -actin 片段的大小分别为 172,130,148,127,150,114,229,88,83,173 bp。图4 用三种脂肪特异性基因蛋白抗体对诱导得到的脂肪细胞进行免疫荧光染色，从左到右分别为亮视野对照；DAPI染色；细胞免疫荧光染色。实施例2
0. 2 μ M细胞信号通路抑制剂SB431542可诱导猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞将猪胚胎成纤维细胞以5 X IO4个/ cm2的比例均勻的接种到6cm细胞培养板中，使用诱导培养基培养。诱导培养基配方为15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培养基，0. ImM 非必须氨基酸 Gnvitrogen)， 0·055πιΜβ-巯基乙醇 Gnvitrogen)，2mM L-谷氨酰胺 Qnvitrogen)，0. 2 μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培养箱中培养。结果表明诱导培养20天时，经观察可发现有明亮的、富含脂滴的细胞的形成。油红O染色后可观察到被染成红色的圆形的脂滴，证明0. 2 μ M的SB431542能够促使猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞，计算得到的效率为15. 8%。参见图5.
实施例3
1 μ M细胞信号通路抑制剂SB431542可诱导猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞将猪胚胎成纤维细胞以5Χ IO4个/ cm2的比例均勻的接种到6cm细胞培养板中，使用诱导培养基培养。诱导培养基配方为15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培养基，0. ImM 非必须氨基酸 Gnvitrogen)， 0. 055πιΜβ -巯基乙醇 Gnvitrogen)，2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，1 μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培养箱中培养。结果表明诱导培养20天时，经观察可发现有明亮的、富含脂滴的细胞的形成。油红O染色后可观察到被染成红色的圆形的脂滴，证明1 μ M的SB431542能够促使猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞，计算得到的效率为19. 1。参见图6。实施例4
0. 5 μ M细胞信号通路抑制剂SB431542和0. 5 μ M细胞信号通路抑制剂Thiazovivin可诱导猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞
将猪胚胎成纤维细胞以5 X IO4个/ cm2的比例均勻的接种到6cm细胞培养板中，使用诱导培养基培养。诱导培养基配方为15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培养基，0. ImM 非必须氨基酸 Gnvitrogen)， 0. 055πιΜβ -巯基乙醇(Invitrogen) ,2mM L-谷氨酰胺 Qnvitrogen)，0. 5 μ M Thiazovivin (Stemgent)，0· 5μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培养箱中培养。结果表明诱导培养20天时，经观察可发现有明亮的、富含脂滴的细胞的形成。油红0染色后可观察到被染成红色的圆形的脂滴，证明同时加入0. 5 μ M SB431542和0. 5 μ M Thiazovivin能够促使猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞，计算得到的效率为25. 5%。 参见图7。实施例5
0. 5 μ M细胞信号通路抑制剂SB431542和ΙμΜ细胞信号通路抑制剂Thiazovivin可诱导猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞
将猪胚胎成纤维细胞以5 X IO4个/ cm2的比例均勻的接种到6cm细胞培养板中，使用诱导培养基培养。诱导培养基配方为15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培养基，0. ImM 非必须氨基酸 Gnvitrogen)， 0. 055πιΜβ -巯基乙醇(Invitrogen) ,2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，1 μ M Thiazovivin (Stemgent)，0· 5μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培养箱中培养。结果表明诱导培养20天时，经观察可发现有明亮的、富含脂滴的细胞的形成。油红0染色后可观察到被染成红色的圆形的脂滴，证明同时加入0.5μ M SB431542和ΙμΜ Thiazovivin能够促使猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞，计算得到的效率为27. 0%。 见图8.
实施例6
0. 5 μ M细胞信号通路抑制剂SB431542和2 μ M细胞信号通路抑制剂Thiazovivin可诱导猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞
将猪胚胎成纤维细胞以5Χ IO4个/ cm2的比例均勻的接种到6cm细胞培养板中，使用诱导培养基培养。诱导培养基配方为15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培养基，0. ImM 非必须氨基酸 Gnvitrogen)， 0·055πιΜβ-巯基乙醇(Invitrogen) ,2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，2 μ M Thiazovivin (Stemgent)，0· 5μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培养箱中培养。结果表明诱导培养20天时，经观察可发现有明亮的、富含脂滴的细胞的形成。油红O染色后可观察到被染成红色的圆形的脂滴，证明同时加入0. 5 μ M SB431542和2 μ M Thiazovivin能够促使猪胚胎成纤维细胞转化成为脂肪细胞，计算得到的效率为27. 4%。 见图9.
实施例7
猪胚胎成纤维细胞密度为4X IO4个/ cm2时经细胞信号通路抑制剂SB431542(0. 5μΜ) 诱导可转化成为脂肪细胞
将猪胚胎成纤维细胞以4Χ IO4个/ cm2的比例均勻的接种到6cm细胞培养板中，使用诱导培养基培养。诱导培养基配方为15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培养基，0. ImM 非必须氨基酸 Gnvitrogen)， 0·055πιΜβ-巯基乙醇 Gnvitrogen)，2mM L-谷氨酰胺 Qnvitrogen)，0. 5 μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培养箱中培养。结果表明诱导培养20天时，经观察可发现有明亮的、富含脂滴的细胞的形成。油红O染色后可观察到被染成红色的圆形的脂滴，证明猪胚胎成纤维细胞密度为4X IO4个/ cm2时经诱导能够得到脂肪细胞，计算得到的效率为15. 9%。见图10.
实施例8猪胚胎成纤维细胞密度为6X104个/ cm2时经细胞信号通路抑制剂SB431542(0. 5μΜ) 诱导可转化成为脂肪细胞
将猪胚胎成纤维细胞以6 X IO4个/ cm2的比例均勻的接种到6cm细胞培养板中，使用诱导培养基培养。诱导培养基配方为15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培养基，0. ImM 非必须氨基酸 Gnvitrogen)， 0·055πιΜβ-巯基乙醇 Gnvitrogen)，2mM L-谷氨酰胺 Qnvitrogen)，0. 5 μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培养箱中培养。结果表明诱导培养20天时，经观察可发现有明亮的、富含脂滴的细胞的形成。油红0染色后可观察到被染成红色的圆形的脂滴，证明猪胚胎成纤维细胞密度为6X IO4个/ cm2时经诱导能够得到脂肪细胞，计算得到的效率为16. 7%。见图11。通过以下试验例证明本发明的效果 试验例1 油红0染色鉴定猪脂肪细胞
1试验过程在20天时对诱导的细胞进行油红0染色。首先使用10%甲醛(V· :V 水=1:9) 1 30min，用60%胃丙酉享(V异丙醇V水= 3 2)清洗、晾干，然后0. 6g/ml油红0染色 30min，用30%异丙醇(V胃:V7K=3:7)快速清洗一遍，最后用蒸馏水清洗五遍后用显微镜观察。2试验结果油红0染料可与脂肪细胞特异性的结合。所以猪胚胎成纤维细胞经油红0染色不着色，脂肪细胞的脂滴可被油红0染成红色。结果表明在显微镜下可观察到被染成红色的圆形的脂滴，证明其确实是脂肪细胞。试验例2 油红0染色测定脂肪细胞的形成效率
1试验过程在20天时对诱导的细胞进行油红0染色后。在同组的3个细胞培养板中(10X20)倍显微镜下随机选取10个视野(1. 35mm2)进行油红0染色细胞计数，取得平均数后计算每平方厘米(cm2)的脂肪细胞数目，除以起始的细胞密度(Γ6Χ104个/ cm2)，得到的结果即诱导效率。试验例3 RT-PCR检测猪脂肪细胞特异基因的表达
1试验过程提取诱导20天的细胞总RNA作为模板，利用猪脂肪特异性基因(PPARy， C/EBP α、β、δ，LPL, ΑΡ2, Adipoq, CFD, SLC2A4)的引物进行 RT-PCR 鉴定。采用 Trizol (Invitrogen) i式齐Ll提取 RNA，米用 SuperScript IIIFirst-Strand SynThiazovivinesis System (Invitrogen)反转录试剂盒获得 cDNA，PCR 反应采用 Taq DNA polymerase (Fermentas)试剂。具体操作步骤参照说明书。PCR产物委托北京天根公司进行测序，证明其序列正确。 RT-PCR反应的引物和大小分别为
基因上游引物(5，to3')下游引物(5’ to3')AmpliconSize(bp)PPARyCTGACCAMGCAAAGGCGAGACCCCTGAAAGATGCGAATG172C/EBPαCAAGAACAGCAACGAGTAGTCATTGTCACTGGTCAG130C/EBPβCAGCGACGAGTACAAGATCTGCTCCACCTTCTTCTG148C/EBPδGCTATCGTCAGGTCAGTTATCTCCATAATCAGTGTCCAA127LPLGCGTGTGGCTTCAGAGTCCAGGAATGAGATGGCAAGTGT150AP2CGAACTCTACAACACTCTGACCAACAAGCATATTGAACA114adipoqACTTGAAGGATGTGAAGGTATGTTGTGGTAGAGAAGGAA229CFDCATGATCTCCTCCTGCTGAAGCCTCGTGGTCCTCTCGTT88
权利要求
1.一种细胞信号通路抑制剂诱导猪脂肪细胞形成的方法，包括以下步骤将猪胚胎成纤维细胞以Γ6Χ IO4个/ cm2的比例均勻的接种到Corning细胞培养板中， 使用诱导培养基培养；37°C，5% C02培养箱中培养20天时，对细胞进行观察并油红0染色证明其为脂肪细胞；诱导培养基配方为15% (v/v) Knockout Serum Replacement (Invitrogen)血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培养基，0. ImM 非必须氨基酸 Gnvitrogen)， 0. 055πιΜβ -巯基乙醇(Invitrogen)，2 mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0. 2-1 μ M SB431542 (Stemgent)。
2.如权利要求1所述细胞信号通路抑制剂诱导猪脂肪细胞形成的方法，其特征在于 在诱导培养过程中还加入0. 5-2 μ M通路抑制剂Thiazovivin。
全文摘要
本发明提供一种细胞信号通路抑制剂诱导猪脂肪细胞形成的方法，将猪胚胎成纤维细胞以4~6×104个/cm2的比例均匀的接种到Corning细胞培养板中，使用诱导培养基培养；37℃，5％CO2培养箱中培养20天时，对细胞进行观察并油红O染色证明其为脂肪细胞。利用细胞信号通路抑制剂而非转基因来诱导细胞转化，可有效的防止细胞基因组因插入外源基因而导致的基因突变。同时该方法对于研究脂肪细胞的形成机制有一定的促进作用，其简便性和安全性可被广泛的应用，可用于脂肪形成机制的研究，也能在疾病治疗等临床应用上发挥作用。
文档编号C12N5/077GK102382800SQ201110404508
公开日2012年3月21日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者全龙泉, 周杨, 唐成程, 张明军, 朱建国, 欧阳红生, 逄大欣, 高飞 申请人:吉林大学