专利名称：食品及饲料中鹅成分的实时荧光pcr检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域。具体地，本发明涉及食品或饲料中鹅成分的实时荧光PCR检测方法和试剂盒。
背景技术：
为确保食品成分的真实性，质检“十二五”规划纲要明确指出“十二五”期间需重点加强开展食品掺假鉴别技术研究。《中华人民共和国产品质量法》、《中华人民共和国食品卫生法》和《食品标识管理规定》(国家质量监督检验检疫总局令第102号)等法律法规禁止产品的造假掺假行为和正确标识食品标签。然而，由于经济利益驱动，一些不法商在食品的加工过程中，常常以价格低廉的原料替代或掺入高价格的原料，或者根本就不添加标注的原料成分。在加工产品的造假掺假过程中，经常会使用有毒有害物质(如染色馒头等)， 危害人民身体健康。在动物产品原料和加工产品中，经常出现成分的掺假造假和无意污染现象。人为搀假主要是不法商要降低成本或增加品质，以谋取巨额的经济利益。这种掺假造假、以次充好的行为除了影响我国经济，另一个最主要的是影响人体健康和畜禽安全。疯牛病和禽流感的世界性爆发和流行，人们越来越关注食品安全和饲料安全。部分人群因为健康缘故也只食用素食部分。疯牛病的发生是由于反刍动物食用了含有动物成分的饲料，所以各国禁止含有动物成分的饲料喂养动物。含有禽成分的饲料可能具有传播禽流感的风险。用这些掺假的饲料喂养动物，会影响畜禽的健康生长及我们的畜牧业安全。因此迫切需要开发有效的鉴定各种禽类成分的方法，以规范市场，保护消费者权
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发明内容
本发明的目的在于提供食品及饲料中鹅成分的实时荧光PCR检测方法。本发明的另一目的在于提供食品及饲料中鹅成分的实时荧光PCR检测的试剂盒。在本发明的第一方面，提供一种鉴定鹅成分的方法，所述方法包括以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物进行PCR 扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鹅成分。在一个优选例中，在以SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物以及SEQID NO 3所示的Taqman MGB探针进行实时荧光PCR检测。在另一优选例中，所述的待测样品是食品或饲料。在另一优选例中，所述方法的检测灵敏度为10_4ng/y L DNA。在本发明的另一方面，提供一种引物，所述引物是引物对，其序列如SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示。在本发明的另一方面，提供一种Taqman MGB探针，所述的探针序列如SEQ ID NO 3所示。
在本发明的另一方面，提供所述的引物和/或所述的Taqman MGB探针的用途，用于从待测样品中鉴定鹅成分。在本发明的另一方面，提供一种鉴定鹅成分的试剂盒，其中包括所述的引物；和/ 或所述的iTaqman MGB探针。在一个优选例中，所述试剂盒中还包括含有鹅成分的检测标准品(该标准品中鹅成分含量是确定的)。在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂DNA提取试剂(或试剂盒)，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定鹅成分的方法的使用说明书。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、鹅源性引物探针特异性实时荧光PCR检测图谱。仅在鹅DNA中产生扩增产物，而在其它物种DNA样品中均无扩增。图2、鹅源性引物探针灵敏度实时荧光PCR检测图谱。扩增曲线(平滑的弧形线)由左至右分别对应于10%鹅DNA，1%鹅DNA，0. 鹅 DNA, 0. 01%· ΝΑ，0. 001%鹅 DNA，0. 0001%鹅 DNA。图3、鹅肉粉重量比的实时荧光PCR检测灵敏度图。扩增曲线从左到右(平滑的弧形线)分别(平滑的弧形线)以下样品的DNA 10% 鹅肉粉；鹅肉粉；0.鹅肉粉；0. 01%鹅肉粉；0. 001%鹅肉粉。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究和试验，首次揭示一种可特异性鉴定鹅成分的引物，所述引物针对含有鹅成分的DNA可发生特异性扩增(获得阳性结果)，而对没有鹅成分的DNA不发生特异性扩增(获得阴性结果)。为了简化PCR扩增方法，本发明人还设计了配合所述引物的、用于进行实时荧光PCR的Taqman MGB探针。采用所述的引物配合Taqman MGB探针，可良好地应用于鉴定鹅成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。目前开发有效的鉴定各种禽类成分的方法的难点在于这些成分通常在外观、品质上非常相近，导致人们难分真伪。即使采用一些基因或蛋白水平上的技术，也由于许多禽类在亲缘关系上较近，难以找到符合标准的、检测准确性高、实用性强的检测靶标。为此，本发明人经过深入的研究和大量的筛选，找到了合适的检测靶标，基于此开发了实时荧光PCR 检测鹅成分的方法。本发明人通过对引物的筛选，获得一类可特异性鉴定鹅成分的引物，其对于鹅的 DNA发生特异性扩增，而对没有鹅成分的DNA不发生特异性扩增。因此，本发明提供一种引物，所述的引物具SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的核
苷酸序列。本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。本发明还提供一种探针，所述的探针具SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列；较佳地，所述的探针是iTaqman MGB探针，从而便于实时荧光检测。利用本发明的引物及探针，只需进行常规的PCR反应和/或琼脂糖凝胶电泳，并通过判断相应的PCR产物的有无，就可以准确、快速地判断待测样品是否含有鹅成分，而且所需的样品量很少。基于本发明所提供的适用于鉴定鹅成分的特异性引物及探针，本发明还提供了一种鉴定鹅成分的方法，所述方法包括以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID N0:1和SEQ ID NO 2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鹅成分。聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明的方法可采用常规的PCR技术进行。作为本发明的优选方式，利用所述引物，采用Taqman MGB实时荧光PCR方法来进行鹅成分的鉴定。TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的 3' -5'外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。TaqMan探针根据其3'端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种普通的iTaqMan探针和TaqMan MGB探针。TaqMan MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团。获取待测样品的DNA的方法是本领域技术人员所熟知的技术，例如可采取传统的酚/氯仿/异戊醇法，或者可采用一些商购的DNA提取试剂盒，这类试剂盒是本领域技术人员熟知的。本发明还涉及一种用于鉴定鹅成分的试剂盒，所述试剂盒中含有SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO :2所示的引物；更佳地，所述的试剂盒中还含有SEQ ID NO :3所示的探针。此外，所述的试剂盒还可含有其它鉴定鹅成分的试剂，如(但不限于)(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等； 或(B)各种提取DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于酚、氯仿、 异戊醇、NaCl等；或(C)提取DNA的试剂盒。此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定鹅成分的使用说明书和/或标准操作程序。本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测鹅成分的目的。本发明的主要优点在于(1)首次揭示一种可特异性鉴定鹅成分的引物，所述的引物特异性良好，对于鹅能够实现特异性扩增，而对于鹅以外的其它通常用作仿制鹅成分的物质则不能特异性扩增。 并且，所述引物具有良好的再现性、结果稳定可靠。(2)利用所述的引物或含有所述引物的检测试剂盒，可快速、大批量地检测鹅成分，从待测样品中快速准确地区分真假鹅成分，并且所需样品量少，操作简单。(3)较佳地，本发明应用Taqman MGB实时荧光PCR技术，可快速实现食品中鹅源性成分的准确鉴定。(4)本发明的方法的推广应用对保障产品的质量，保护消费者知情权和选择权，维护正常的经济秩序等提供了技术支持。
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下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I.材料与方法1. 1样品收集和制备鹅肉、鸡肉、鸭肉、火鸡、鸽子、鹌鹑、牛肉、猪肉、山羊肉、绵羊肉、梅花鹿肉、骆驼肉、马肉、驴肉、兔肉、野兔肉、野猪肉、貉肉、蛇肉、牛蛙、蛤蟆肉、草虾、螃蟹、甲鱼、牡蛎、贻
贝、蜗牛等27种常见动物材料和大豆、玉米、大麦、小麦、大米、马铃薯、番茄、豌豆、棉花、油菜等10种常见植物材料购自上海的农贸市场或超市。6种鸡肉和蛋产品，各4种鸭肉、火鸡肉、鸽子、鹌鹑肉和蛋产品，15批其他成分食品(肉干、肉酱、饼干等)购自上海的超市。12批进口鹅肝、鹅脯肉，15批禽肉骨粉饲料，20 批其他成分饲料(包括猪肠膜蛋白粉、多福蛋白、乳清粉、宠物饲料等)由上海市海关口岸抽样提供。1. 2 试齐[J(1)实时荧光PCR检测的引物和MGB荧光探针序列设计了许多种引物和探针，经过反复比较筛选，获得了适用于扩增鹅源性成分的特异性PCR引物和探针，序列为正向引物5，-TTAAAACTCTAAGGACTTGGCGGT-3，(SEQID NO 1)；反向引物5，-CTTGTTAGCGGTGTGCTATTGTGT-3，(SEQID NO 2)；探针5，-FAM-CTAGAGGAGCCTGTTCT-MGB-3，(SEQID NO 3)；(2)液氮；(3)CTAB 提取缓冲液20g/L CTAB，，1. 4mol/L NaCL,0. lmol/L Tris-HCL, 0. 02mol/L Na2EDTA, pH8. 0 ； (4)蛋白酶 K 溶液(20mg/mL)；(5) CTAB 沉淀液5g/L CTAB, 40mmol/L NaCl ；(6) NaCl 溶液(1. 2mol/L)；(7)异丙醇；(8) 70% 乙醇；(9)TE 缓冲液，ρΗ8·0 ；(IO)ABI TaqMan Universal PCR Master Mix(Part Number 4304437)；(11)超纯水(ddH20)。1. 3仪器设备ABI 7300实时荧光PCR仪；天平；移液枪；离心机；恒温孵育器；冷冻碾磨机；DNA 冷冻干燥离心机；核酸蛋白浓度分析仪；Eppendorf离心管；PCR反应管。1.4样品的DNA提取
将样品(各种动物或植物材料)研磨后，称取200mg左右固体样品或200 μ L液体样品于 2mL离心管中，加入 1. 5mL CTAB提取缓冲液(20g/L CTAB, 1. 4mol/L NaCL，0. lmol/L Tris-HCL,0. 02mol/L Na2EDTA,pH8. 0)和 10 μ L 蛋白酶 K(20mg/mL)溶液。60°C振荡过夜后 13000g离心lOmin，转移上清液到新的离心管中。加入750 μ L氯仿后用力振荡，13000g离心5min，将上清转移到新的离心管中。加入2倍体积的CTAB沉淀溶液(5g/L CTAB, 40mmol/ L NaCl)，室温静置60min，13000g离心15min，弃去上清。加入350 μ L NaCl溶液将沉淀进行悬浮。再加入350 μ L氯仿，涡旋振荡进行混勻，13000g离心IOmin。转移上清后加入0. 6 倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心lOmin，弃去上清。加入500 μ L 70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于200 μ L TE溶液中用核酸蛋白含量测定仪测定DNA浓度。也可用等效的商业化DNA提取试剂盒提取模板DNA。其中，鹅肉DNA 溶液分别稀释成 10ng/yLUng/yL,0. Ing/μ L、0. Olng/μ L、 0. OOlng/μ L、0. OOOlng/μ L、0. OOOOlng/μ L 的 DNA 样品。用于灵敏度测试。其中，用鸡肉粉与鹅肉粉混合，配制成分别含有10%U%>0. 1%,0.01%,0. 001% 和0.0001%鹅肉粉含量(W/W)的混合样品。上述方法提取DNA。1. 5鹅实时荧光PCR测试1. 5. IPCR 反应体系进行实时荧光PCR检测的反应体系见表1。表1、实时荧光PCR检测的反应体系
_试剂名称_25μ1反应体系(JiL)
2 χ Real Time PCR Buffer12.5
正向引物(5μΜ)1.5 正向引物(5μΜ)1.5
探针(5μΜ)0.5
H2O8.0
模板 DNA(约 IOOng DNA)1.01. 5. 2PCR反应循环参数实时荧光PCR 反应循环参数50°C，2min ;95°C，10min ;95°C 15s, 60°C lmin，循环
40次。1. 618S rRNA基因PCR扩增与检测使用18S rRNA基因扩增真核生物内源基因，以确保所提取的DNA适合于PCR扩增。 检测所用18S rRNA基因引物序列为5，-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3，(SEQ ID NO 4)；5，-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3，(SEQ ID NO 5)；18S rRNA 基因引物 PCR 反应体系1XPCR 缓冲液，2. 5mmol/L Mg2+，IU Taq 酶， 200ymol/L dNTPs，引物100nmol/L，模板lOOng，反应体积为25 μ 1。扩增条件为-MV, 3min ；94°C，20s, 54°C，40s, 72°C，40s, 40 个循环；72°C，5min。
取10 μ L PCR产物，加1 μ LlOX上样缓冲液点样进行电泳。PCR产物电泳检测所用的凝胶浓度为1.5-2.0%。II.实施例实施例1、真核生物特异引物18S rRNA引物的检测结果用真核生物18S rRNA特异引物扩增本实验提取的所有DNA溶液(包括各种动物或植物材料的DNA溶液)，所有DNA溶液均能出现137bp的特异扩增条带。上述结果表明，所有抽提的DNA溶液适合于PCR测试。实施例2、鹅成分的实时荧光PCR特异性检测用本发明建立的实时荧光PCR检测鹅源性成分的引物和MGB荧光探针，对鹅和供试的其他26种常见动物和10种常见植物进行检测。结果发现，采用所述的特异性引物和探针，仅在鹅DNA中产生扩增产物，而在其它物种DNA样品中均无扩增，如图1。上述结果说明，本发明建立的检测方法具有物种特异性。实施例3、鹅成分的实时荧光PCR检测灵敏度对IOng/μ L(10% )，Ing/μ L(1 % ) ,0. lng/μ L(0. 1 % ) ,0. Olng/μ L(0. 01 % ), 0. OOlng/μ L(0. 001% ) ,0. OOOlng/μ L(0. 0001% ),0. OOOOlng/μ L (0. 00001% )鹅 DNA 进行检测。结果如图2，在大于0. 0001%的鹅DNA中出现扩增。上述结果表明，鹅源性检测引物具有物种特异性，且检测灵敏度为0. OOOlng/ UL(0. 0001% )鹅DNA，可见本发明的检测引物及检测方法灵敏度高。用鸡肉粉10倍系列混合配制不同含量的鹅肉粉样品，提取获得DNA溶液。使用鹅成分引物和探针对对应于10%u%>0. 1%,0.01%,0. 001%和0. 0001%鹅肉粉含量(W/W) 的样品DNA分别进行检测。结果如图3，10%、1 %、0. 1%、0. 01 %和0.001 %鹅肉粉均出现扩增曲线，而 0. 0001%鹅肉粉未出现扩增曲线。上述结果表明，在重量百分比水平上，该方法的检测灵敏度为0.001%鹅肉粉(W/ W)，可见本发明的检测引物及检测方法灵敏度高，不受相近成分的影响。实施例4、食品中鹅成分检测的应用采用本方法对12批海关口岸的进口鹅肝、鹅脯肉进行检测，均检出鹅成分。在6 种鸡肉和蛋产品，各4种鸭肉、火鸡、鸽子、鹌鹑肉和蛋产品，15批其他成分食品中未检出鹅成分。在1批美国进口的禽肉骨粉和1批澳大利亚进口的禽肉骨粉饲料检出鹅成分，在其他的14批禽肉骨粉饲料和20批其他成分饲料未检出鹅成分。经比较和跟踪，这些分析检测结果是准确的。综上，本发明的食品和饲料中鹅成分实时荧光PCR检测方法，特异性强，灵敏度高，能准确检测出食品和饲料中的鹅成分，为食品和饲料中鹅成分检测方法标准化提供了依据。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种鉴定鹅成分的方法，其特征在于，所述方法包括以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的引物进行PCR扩增； 若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含鹅成分。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在以SEQID NO 1和SEQ ID NO 2所示的引物以及SEQ ID NO :3所示的Taqman MGB探针进行实时荧光PCR检测。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样品是食品或饲料。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的检测灵敏度为lOlng/yLDNA0
5.一种引物，其特征在于，所述引物是引物对，其序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2 所示。
6.一种Taqman MGB探针，其特征在于，所述的探针序列如SEQ ID N0:3所示。
7.权利要求5所述的引物或权利要求6所述的TaqmanMGB探针的用途，用于从待测样品中鉴定鹅成分。
8.一种鉴定鹅成分的试剂盒，其特征在于，其中包括权利要求5所述的引物；和/或权利要求6所述的Taqman MGB探针。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括含有鹅成分的检测标准品。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂 DNA提取试剂，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定鹅成分的方法的使用说明书。
全文摘要
本发明涉及食品及饲料中鹅成分的实时荧光PCR检测方法和试剂盒。本发明首次揭示一种可特异性鉴定鹅成分的引物及探针，所述引物及探针针对含有鹅成分的DNA可发生特异性扩增，而对没有鹅成分的DNA不发生特异性扩增。因而，所述引物可良好地应用于鉴定鹅成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。
文档编号C12Q1/68GK102382897SQ201110403988
公开日2012年3月21日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者张舒亚, 蒋静, 韩丽, 高琴 申请人:上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心