专利名称：耐逆性相关的14-3-3蛋白grf9及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体地说，是耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9及其在培育耐土壤低磷和耐土壤逆境植物中的应用。
背景技术：
我国设施农业迅速发展。同时，设施农业生产也出现了比较严重的问题。与露地土壤相比，设施土壤的最大特点在于其密闭性、可控性、缺少雨水淋洗及复种指数高。且设施栽培大多在冬春反季节进行，低温弱光条件抑制了蔬菜根系对土壤养分的吸收。加之设施园艺有着“高投入、高产出、高效益”的特性，在市场经济压力下，各地设施农业普遍向规模化和单一化栽培发展，为保证作物的经济产量，往往会施用高量磷肥，使生产成本增加， 磷肥利用率低。并且，长期过量磷肥对土壤环境和周围水体造成了巨大的压力。这种现象在设施农业生产中尤其明显。陷入了不施肥则作物产量下降，施肥则可能带来土壤次生盐渍化和酸化等土壤质量退化的两难境地。这些环境中非生物胁迫严重制约着植物的生长发育，其中低磷、干旱、低温、高盐及重金属等非生物胁迫造成粮食减产量高达50 %。利用基因工程技术改造农作物对土壤中养分的吸收利用能力已经成为国际上农业科学研究的重要课题。植物通过长期的进化，形成了一系列完善的逆境胁迫应答机制，包括细胞水平的耐受和植株整体水平的调控。在调控过程中，转录后水平的调节是最重要的。植物对低磷、 干旱及低温耐受性的强弱往往不取决于某一单一因子，其性状受许多因子影响。生长调节因子(14-3-3蛋白)可以调控多个生理过程。例如14-3-3蛋白可通过调控SSIII (淀粉合成过程中的重要酶)，降低它的酶活性，从而减少叶绿体中淀粉的累积，提高蔗糖的合成和向根中的运输；可以激活质膜H+-AIPase酶；参与ABA和胁迫信号调节等。通过增强生长调节因子(14-3-3蛋白)的作用来促进这些抗逆基因资源发挥作用，使植物的抗逆性得到综合的、根本性的改良。在提高作物对环境胁迫的分子育种中，与导入或改良个别基因功能来提高某种抗性的传统方法相比，从改良或增强一个关键的生长调节因子(14-3-3蛋白)的调控能力着手，提高植物的抗逆性将是一种更为有效的方法和途径。
发明内容
解决的技术问题本发明的目的是提供植物耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9及其编码基因，和其在培育耐土壤低磷和耐土壤逆境植物中的应用。技术方案耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。编码权利要求1所述耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9的基因。编码权利要求1所述耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9的基因，序列如SEQ ID No. 2 所示。含上述耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9的基因的真核表达载体。上述的真核表达载体，所述载体是将所述植物耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9的编码基因插入PBI121的多克隆位点得到的重组质粒。上述耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9在提高植物耐低磷、耐干旱或耐低温性能的应用。上述植物为单子叶植物或双子叶植物。上述双子叶植物可为番茄。提高植物耐低磷、耐干旱或耐低温性能的方法，该方法包括将所述植物耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9的编码基因通过pBI121_GRF9导入所述目的植物中。有益效果目前的研究虽然获得了许多耐逆相关基因，但是，这些基因并不能同时提高转基因作物的耐低磷和/或耐干旱和/或耐低温的能力。所以，需要深入研究现有基因的耐性机制，挖掘耐逆基因的新功能。本发明从模式植物拟南芥中选取一个生长调节因子(14-3-3蛋白)GRF9，构建植物表达载体，通过农杆菌介导转化法将GRF9导入番茄，经过卡那霉素初筛、分子检测、低磷胁迫、干旱胁迫和低温胁迫等手段，筛选到耐低磷、抗干旱和耐低温能力显著提高的转基因番茄。获得能高效利用土壤磷素资源、并且抗干旱和耐低温能力的转基因农作物新品种，对于降低农业种植的生产成本和减轻大量磷肥施用造成的水土污染具有重要意义。
图1为pBI121载体上的grf9基因构建示意图；图2为含目的条带的琼脂糖凝胶电泳图，其中出现约474bp的grf9基因带，以野生型番茄的总DNA为负对照进行PCR反应，未出现474bp的grf9基因条带(NC)；图3为经改造的番茄在低温条件下的存活示意图。
具体实施例方式实施例1 拟南芥14-3-3蛋白grf9基因克隆和植物表达载体构建根据NCBI已发表的拟南芥(Arabidopsis thaliana) grf9基因的DNA信息 (NM_001036456)设计特异引物，上游引物5'端加入^CbaI酶切位点，下游引物5‘端加入 SacI 酶切位点。PCR产物为 1332bp。上游引物Fl 5' -GCTCTAGAGTAGTAATTACCCCGTTTAACCC G-3'(加入XbaI 酶切位点)，下游引物Rl 5' -GCGAGCTCCTCAGCAATTCAGMATGAAGGAAT-3‘ (加入McI酶切位点)。提取水培生长15天的拟南芥的总RNA并以其为模板，以Oligo(ClT)18 为引物反转录，得到反转录产物cDNA。以此cDNA为模板，以特异引物Fl和Rl进行PCR扩增。然后用PMD18 simple载体进行TA克隆。用^(bal/SacI双酶切回grf9基因片段；在连接酶催化下于16°C连接过夜。用连接混合物转化E. coli DH5a感受态细胞，挑选转化平板上的白色菌落。提取白色菌落的质粒，用^(bal/SacI双酶切产生2个片段，其中一个是约1300bp的grf9基因片段。从测序正确的阳性克隆中提取质粒，完成PBI121载体上的grf9基因构建(GRF9_pBI 121，T-DNA区示意图见图1)。用常规方法转化农杆菌LBA4404，获得工程农杆菌LBA4404: :GRF9_pBI121，用于植物转化。实施例2 转基因番茄的制备用LBA4404: :GRF9_pBI121转化番茄的步骤如下
(1)农杆菌的培养从平板上挑取LBA4404::GRF9-pBI121单菌落，接种于含 100mgL_1kanamycin (Kan), 25mg L-1 rifampicin (Rif)禾口 50mg L-1 streptomycin (Strep) 的Luria-Bertani (LB)液体培养基中，观°C，250rpm震荡培养至OD600nm = 1. 0，用LB液体培养基稀释菌液10倍，继续震荡培养4h;将菌液倒入无菌螺口带盖离心管内，盖上管盖， 4000rpm离心IOmin ；弃去上清，倒置离心管lmin，流尽残余液体；向离心管中加入适量共培养培养基_I(MS，30g L—1蔗糖，pH 5. 8)，悬浮起菌体，转入无菌容器中，用共培养液体培养基-I，再次稀释至OD6tltlnm = 0.1。(2)子叶的预培养番茄种子在自来水下冲洗15min，转移至超净工作台。用无菌水冲洗4次，先用75%酒精浸泡30s，无菌水冲洗4次；再用2% (g/100mL)的次氯酸钠剧烈振荡灭菌15-20min，无菌水冲洗8次且持续时间不少于30min。表面灭菌后的种子接种于种子萌发培养基(MS，30g L—1蔗糖，8g L—1琼脂，pH 5. 8)上。放置培养室培养，光周期16h/8h， 光照强度为72μπι01 HT2iT1，培养温度为23 士 1°C。将6_8d苗龄的番茄无菌苗的子叶剪成约 25mm2的块状，正向放置在预培养培养基(MS培养基，2mg L—1玉米素，30g L—1蔗糖，8g L—1琼脂，pH 5. 8)上预培养Id。(3)农杆菌介导的转化将经过预培养的子叶浸入制备好的菌悬液中，浸染 15min。将浸染后的子叶在无菌滤纸上轻轻吸干，接种到共培养培养基-II (MS培养基， 100 μ M乙酰丁香酮，2mg L—1玉米素，0. Img L—1吲哚乙酸，30g L—1蔗糖，8g L—1琼脂，pH 5. 2) 上共培养3d。(4)转基因植株的再生和培育将经过3d共培养的子叶转接到再生培养基(MS培养基，50mg Γ1 kanamycin,200mg Γ1 timentin, Img Γ1 玉米素，0. Img 厂1 吲哚乙酸，30g 厂1 蔗糖，8g L—1琼脂，pH 5. 8)上，每3周继代培养一次。直到抗性芽出现，并长到约5mm高时，将其自子叶切下，插入到生根培养基-I (MS培养基，50mg Γ1 kanamycin,200mg Γ1 timentin, 0. 2mg Γ1吲哚乙酸，30g L—1蔗糖，8g L—1琼脂，pH 5.8)中诱导生根。再将生根的植株转接到生根培养基-II (MS培养基，50mg L-1 kanamycin, 30g L—1蔗糖，8g L—1琼脂，pH 5.8)上继续培养1周。将完整的转基因植株移栽在温室菜园土中，继续培养至开花、结实。(5)转基因番茄植株的PCR检测分别剪取每棵转化植株的一片叶片，提取总 DNA,以总DNA为模板，用引物上游引物F206 :AAGAGCGTGACACTTTCG，下游引物R679 CAGCAGCAGTAGTAGCAATC进行PCR反应，然后进行琼脂糖凝胶电泳，出现约474bp的grf9基因带，以野生型番茄的总DNA为负对照进行PCR反应，未出现融合基因条带，证明目的基因的片段已经整合到植物基因组中(见图2)。实施例3 转grf9基因番茄耐低磷和/或耐干旱和/或耐低温能力检测(1)转基因番茄的含磷量测定T2代转基因番茄栽种于中国科学院南京土壤研究所温室内。温室盆栽所用土壤采自江苏省宜兴市的蔬菜种植区(温室大棚土)。T2代转基因番茄移栽至土壤中1个月后，收获转基因番茄的地上部样品和对照样品，用去离子水洗净，分成不同的部分，105°c杀青30min，65°C烘干至恒重；粉碎；称重。结果表明，在相同的供磷条件下，转基因番茄的生物量明显提高(表1)。说明了转GRF9基因番茄有高效吸收磷的能力、耐低磷胁迫能力明显提高。表1转GRF9基因番茄耐低磷胁迫能力
权利要求
1.耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9，其特征在于其氨基酸序列如SEQID No. 1所示。
2.编码权利要求1所述耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9的基因。
3.编码权利要求1所述耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9的基因，其特征在于序列如SEQ ID No. 2 所示。
4.含权利要求2所述耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9的基因的真核表达载体。
5.根据权利要求4所述的真核表达载体，其特征在于所述载体是将所述植物耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9的编码基因插入pBI121的多克隆位点得到的重组质粒。
6.权利要求1所述耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9在提高植物耐低磷、耐干旱或耐低温性能的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述双子叶植物可为番茄。
9.提高植物耐低磷、耐干旱或耐低温性能的方法，其特征在于该方法包括将所述植物耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9的编码基因通过pBI121_GRF9导入所述目的植物中。
全文摘要
耐逆性相关的14-3-3蛋白GRF9及其应用，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本技术方案通过基因技术，利用14-3-3蛋白GRF9，筛选到耐低磷、抗干旱和耐低温能力显著提高的转基因番茄。获得能高效利用土壤磷素资源、并且抗干旱和耐低温能力的转基因农作物新品种，对于降低农业种植的生产成本和减轻大量磷肥施用造成的水土污染具有重要意义。
文档编号C12N15/84GK102391369SQ201110403699
公开日2012年3月28日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者强晓敏, 施卫明, 许卫峰, 闵炬, 高南 申请人:中国科学院南京土壤研究所