专利名称：一种提取梨花粉管细胞核的方法
技术领域：
本发 明属于植物生物化学领域，涉及一种提取梨花粉管细胞核的方法，具体涉及一种利用细胞化学处理及亚细胞器分级筛选技术从梨花粉管中提取纯化细胞核的方法。
背景技术：
细胞核几乎含有所有的遗传信息，对基因表达和调控极其重要。随着基因组测序的发展，DNA纤维荧光原位杂交及大片段基因组文库的构建对植物全基因组测序具有重要推动作用。而提取纯化的细胞核是制作DNA纤维和构建大片段基因组文库的基础。细胞核除了含有DNA和RNA外，还含有一些蛋白质，并且这些蛋白随着胞内及胞外环境不同呈现出动态变化，从而参与不同的细胞行为调控。这些蛋白涉及信号转导、基因调控、蛋白水解及程序性细胞死亡(programmed cell death，P⑶)等。因此提取纯化细胞核对于从基因组及蛋白质组学水平研究其生理调控机制具有重要意义。目前细胞核提取技术多数采用传统研磨植物组织或是先通过酶解法提取原生质体，然后经绸布过滤、离心获得细胞核，如大豆下胚轴组织(1981)、爬山虎冠瘿瘤愈伤组织 (1981)、大豆SB-I细胞系(1988)、蒜瓣(1990)细胞核提取。此外，棉花子叶(2009)细胞核提取技术主要采用刀片将子叶切成碎释放细胞核，并通过滤膜过滤获得细胞核。梨花粉管是一种特殊的植物细胞，添加提取液后采用传统的研钵研磨手段难以完全将花粉管破壁， 让细胞核随着胞质释放。同时采用传统的液氮研磨会将细胞器损坏，不适宜细胞核分离。而预先提取花粉管原生质体后再破壁提取细胞核，需要大量的纤维素酶、离析酶等，成本高， 步骤复杂。细胞研磨液过滤后直接离心，纯化效果不佳，往往含有大量杂质。而密度离心具有较好的效果，但是传统的蔗糖等密度梯度不好控制，纯化得到的细胞核质量不佳。目前细胞核提取技术有许多不足，且不适宜花粉管细胞核提取，因此建立一套花粉管细胞核提取纯化技术对于研究梨花粉管生长代谢及自交不亲和反应具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取梨花粉管细胞核的方法。本发明的目的可以通过以下技术方案实现一种提取梨花粉管细胞核的方法，该方法包括以下步骤1)采集花粉采集大蕾期花药，干燥；干燥方法有多种可以采用白炽灯照射或干燥硅胶阴干等。2)花粉培养分离干燥花药中的花粉，将其加入到花粉培养基中，避光条件下， 25 28°C，140 180rpm，培养 3 4h ；3)细胞核的释放将培养好的花粉连同培养基倒入孔径为50 μ m的细胞筛a内， 并使培养基通过细胞筛流出，迅速在细胞筛a底部加一个孔径为40 μ m的细胞筛b，将两个细胞筛放置于比其直径稍大的培养皿上，迅速将细胞核研磨液加入到细胞筛a中，用玻璃研棒以60 IOOrpm速度研磨，同时再次添加细胞核研磨液使释放的细胞核不断流出经细胞筛b过滤到培养 皿中，以上操作均在4°C下进行；4)细胞核纯化将步骤3)所述培养皿中得到的液体加入到离心管中，在漩涡仪上微震动20 40秒，迅速离心(200g，4°C，5min)得上清即为粗细胞核；将上清液转移到 Percoll (乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒)密度梯度工作液顶部离心(3500g，4°C，25min)；离心后，Percoll密度梯度工作液顶部为淡黄色的细胞质，底部沉淀为纯化的细胞核；5)Percoll的去除将纯化的细胞核悬浮于细胞核研磨液进行洗涤，并迅速离心 (3500g,4°C,25min)；沉淀即为纯化后去除Percoll的梨花粉管细胞核，用研磨液悬浮备用。上述的提取梨花粉管细胞核的方法，所述的花粉培养基配方为100g/L蔗糖， 0. 3g/LCa (NO3) 2 · 4H20，30mM MES ( α -磺基甲脂磺酸钠)，150g/L PEG 4000 (聚乙二醇 4000), 0. lg/L硼酸溶于蒸馏水中并定容，用Tris碱调整pH值至5. 8 6. 5。上述的提取梨花粉管细胞核的方法，所述的细胞核研磨液配方为0.3M蔗糖， IOmMNaCl (氯化钠)，IOmM MES ( α -磺基甲脂磺酸钠)，5mM EDTA (乙二胺四乙酸)，0. 2mM 精胺，0. 5mM亚精胺，0. 2mM PMSF(苯甲基磺酰氟)，5mM DTT (二硫苏糖醇)，0. 2 % (ν/ν) Triton-X-100,以 NaOH(氢氧化钠)调整 pH 至 6. 0。上述的提取梨花粉管细胞核的方法，所述Percoll密度梯度工作液的配方为将 percoll 溶于 IOmM MES-NaOH(pH6. 0)缓冲液中制成 28. 5% (ν/ν)的 percoll 溶液，所述 MES-NaOH(pH6. 0)缓冲液中包含 0. 25M 蔗糖，IOmM NaCl, 3mM EDTA，0. 2mM PMSF，3mMDTT。1)关键技术提取植物细胞核关键是将其从细胞中释放出来，然后进行提纯。本发明采用了单细胞研磨及双细胞筛过滤方法释放细胞核，并通过梯度及percoll (乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒)密度离心得到质量较高的梨花粉管细胞核。细胞筛a和细胞筛b的孔径组合对技术方案的效果影响较大。细胞筛a作用为研磨及过滤，若其孔径大于50 μ m，会导致有些花粉管漏掉，从而不能确保更多的花粉管破裂释放细胞核，影响提取细胞核的量；若小于50 μ m,会导致已释放的细胞核未过滤至细胞筛 b而被再次研磨，影响提取细胞核的完整性。细胞筛b的作用为再次过滤已释放的细胞核， 使其更纯净。若其孔径大于40 μ m,则过滤后的细胞核含杂质较多，若小于40 μ m,则过滤细胞核不完全，影响提取细胞核的量。本发明技术方案中，仅用50mg花粉，采用孔径为50μπι 的细胞筛a和孔径为40 μ m的细胞筛b组合可提取860 μ g且纯度高的梨花粉管细胞核。2)实施方案我们采用了单细胞筛研磨及双细胞筛过滤技术对细胞核进行释放并过滤杂质，然后再进行梯度和percoll密度离心步骤进行纯化细胞核。以DNA特异性荧光探针DAPI ( 二脒基苯基吲哚)染色，荧光显微镜观察得到的细胞核完整性，以及测定细胞质标志性酶(乙醇脱氢酶，ADH)检测细胞核纯度。该技术方案主要包括花粉培养，细胞筛研磨过滤细胞核，percoll密度离心，清洗percoll，提取细胞核完整性及纯度检测(见图1)。本发明的有益效果(1)该发明采用单细胞筛研磨和双细胞筛过滤释放梨花粉管细胞核并滤除杂质， 仅用50mg花粉便可提取860 μ g且高质量的梨花粉管细胞核。该方法不涉及酶解提取原生质体，及传统研磨过滤技术。这种细胞核释放技术比传统方法具有许多优点，如节省植物材料、操作简便、快捷、成本低等。(2)该方法采用percoll密度离心技术结合梯度离心纯化梨花粉管细胞核。 Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒，形成密度梯度稳定，不穿透细胞膜，对细胞无毒害。本技术采用了 28.5%的percoll溶液得到了较高纯度的梨花粉管细胞核。
(3)该方法提纯后的细胞核几乎没有细胞质部分污染，不仅可以应用DNA纤维制备，还可以应用于细胞核蛋白质组学研究，为细胞核分子生物学及蛋白质组研究提供保障。(4)该方法不仅适用于梨花粉管细胞核提取纯化，同时还可以为其他植物组织及花粉管细胞核提取提供重要参考。
图1为梨花粉管细胞核提取技术方案简图。图2为单细胞筛研磨双细胞筛过滤。a为孔径50 μ m细胞筛，b为孔径40 μ m细胞筛，Bar = 1cm。图3为提取前梨花粉管细胞核DAPI染色。箭头所指为细胞核，a为荧光图，b为明场图，Bar = 20 μ m。图4为提取纯化后梨花粉管细胞核DAPI染色检测细胞核完整性。箭头所指为细胞核，a为荧光图，b为明场图，Bar = 20 μ m。图5为梨花粉管细胞核提取物中ADH酶活性检测。以本方法获得的细胞质提取物为对照，细胞质部分ADH含量为 28. eSnmolmir^mg—protein，而细胞核部分 ADH 含量仅为 0. g^molmir^mg—protein。
具体实施例方式1)采集花粉采集大蕾期花药，用白炽灯照射干燥。2)花粉培养分离干燥花药中的花粉，取50mg花粉，将其加入到50ml花粉培养基中，避光条件下，25 28°C，140 180rpm，培养3 4h ；花粉培养基的配方100g/L蔗糖，0. 3g/LCa (NO3) 2 · 4H20，30mM MES ( α -磺基甲脂磺酸钠)，150g/L PEG 4000 (聚乙二醇 4000), 0. lg/L硼酸溶于蒸馏水中并定容，用Tris碱调整pH值至5. 8 6. 5。3)细胞核的释放将培养好的花粉连同培养基倒入孔径为50 μ m的细胞筛a内， 并使培养基通过细胞筛流出，迅速在细胞筛a底部加一个孔径为40 μ m的细胞筛b，将两个细胞筛放置于比其直径稍大的培养皿上，迅速将细胞核研磨液加入到细胞筛a中，用玻璃研棒以90rpm速度研磨，同时再次添加细胞核研磨液使释放的细胞核不断流出经细胞筛b 过滤到培养皿中(如图2所示)，以上操作均在4°C下进行；细胞核研磨提取液的配制0.3M蔗糖，IOmM NaCl (氯化钠)，IOmM MES(α-磺基甲脂磺酸钠)，5mM EDTA(乙二胺四乙酸)，0· 2mM精胺，0. 5mM亚精胺，0. 2mM PMSF (苯甲基磺酰氟)，5mM DTT ( 二硫苏糖醇),0.2% (v/v) Triton-X-100,以NaOH (氢氧化钠)调整pH至 6. 0。4)细胞核纯化将步骤3)所述培养皿中得到的液体加入到离心管中，在漩涡仪上微震动30秒，迅速离心(200g，4°C，5min)得上清即为粗细胞核；将上清液转移到Percoll 密度梯度工作液顶部离心(3500g，4°C，25min)；离心后，Percoll密度梯度工作液顶部为淡黄色的细胞质，中间为其他杂质，底部沉淀为纯化的细胞核；所述Percoll密度梯度工作液的配方为Jfpercoll溶于IOmM MES-NaOH (ρΗ6. 0) 缓冲液中制成28. 5% (ν/ν)的percoll溶液，所述MES-NaOH(ρΗ6· 0)缓冲液中包含0. 25Μ 蔗糖，IOmMNaCl，3mMEDTA，0. 2mMPMSF, 3mMDTT。 5)Percoll的去除将纯化的细胞核悬浮于细胞核研磨液进行洗涤，并迅速离心 (3500g,4°C,25min)；沉淀即为纯化后去除Percoll的梨花粉管细胞核，用研磨液悬浮备用。6)细胞核完整性检测取100 μ 1纯化得到的梨花粉管细胞核，加入终浓度为 0. 05 μ g/ml的DAPI，进行染色，同时取200 μ 1已培养好的花粉管以同样条件用DAPI染色， 作为对照。并用荧光显微镜(Zeiss Axioakop40)观察拍照(见图3、4)。与对照相比，提纯后的梨花粉管细胞核具有较好的完整性。7)细胞核纯度检测将提取纯化后的细胞核用200 μ 1细胞核抽提液(25mM磷酸缓冲液，PH7. 8，40mM KCl，200g/L甘油，15g/L植物蛋白酶抑制剂混合物，0. 5M (NH4) 2S04) 冰浴251^11，1300(^，41，离心301^11，上清即为细胞核提取物。测定细胞核提取物和细胞质中的乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase, ADH)活性，以检测提取细胞核的纯度。ADH 活性参照Kimmererk 1987方法测定。ADH为细胞质部分的标志酶，检测细胞核提取物中该酶的活性以判断提取纯化梨花粉管细胞核的纯度。以本方法获得的细胞质提取物为对照，细胞质部分ADH含量为28. eSnmolmin^W'protein,而细胞核部分ADH含量仅为 0. g^molmir^mgHprotein(见图5)。表明纯化后细胞核部分胞质等组分很少，提纯效果明显。
权利要求
1.一种提取梨花粉管细胞核的方法，其特征在于该方法包括以下步骤1)采集花粉采集大蕾期花药，干燥；2)花粉培养分离干燥花药中的花粉，将其加入到花粉培养基中，避光条件下，25 28 0C，140 180rpm，培养 3 4h ；3)细胞核的释放将培养好的花粉连同培养基倒入孔径为50μ m的细胞筛a内，并使培养基通过细胞筛流出，迅速在细胞筛a底部加一个孔径为40 μ m的细胞筛b，将两个细胞筛放置于比其直径稍大的培养皿上，迅速将细胞核研磨液加入到细胞筛a中，用玻璃研棒以60 IOOrpm速度研磨，同时再次添加细胞核研磨液使释放的细胞核不断流出经细胞筛 b过滤到培养皿中，以上操作均在4°C下进行；4)细胞核纯化将步骤3)所述培养皿中得到的液体加入到离心管中，在漩涡仪上微震动20 40秒，迅速离心(200g，4°C，5min)得上清即为粗细胞核；将上清液转移到Percoll 密度梯度工作液顶部离心(3500g，4°C，25min)；离心后，Percoll密度梯度工作液顶部为淡黄色的细胞质，底部沉淀为纯化的细胞核； 5)Percoll的去除将纯化的细胞核悬浮于细胞核研磨液进行洗涤，并迅速离心 (3500g,4°C,25min)；沉淀即为纯化后去除Percoll的梨花粉管细胞核，用研磨液悬浮备用。
2.根据权利要求1所述的提取梨花粉管细胞核的方法，其特征在于所述的花粉培养基配方为:100g/L 蔗糖，0. 3g/LCa (NO3)2 ·4Η20，30πιΜ MES, 150g/L PEG 4000,0. lg/L 硼酸溶于蒸馏水中并定容，用Tris碱调整pH值至5. 8 6. 5。
3.根据权利要求1所述的提取梨花粉管细胞核的方法，其特征在于所述的细胞核研磨液配方为0.3M 蔗糖，IOmM NaCl, IOmM MES, 5mM EDTA，0. 2mM 精胺，0. 5mM 亚精胺，0. 2mM PMSF, 5mM DTT,0. 2% (v/v) Triton-X-100，以 NaOH 调整 pH 至 6. 0。
4.根据权利要求1所述的提取梨花粉管细胞核的方法，其特征在于Percoll密度梯度工作液的配方为将percoll溶于IOmM MES-NaOH(ρΗ6· 0)缓冲液中制成28. 5% (ν/ν) 的 percoll 溶液，所述 MES-NaOH(pH6. 0)缓冲液中包含 0. 25M 蔗糖，IOmM NaCl, 3mMEDTA, 0. 2mMPMSF，3mMDTT。
全文摘要
本发明公开了一种提取梨花粉管细胞核的方法，包括以下步骤1)采集花粉采集大蕾期花药，干燥；2)花粉培养；3)细胞核的释放单细胞筛研磨和双细胞筛过滤释放细胞核；4)细胞核纯化采用Percoll密度梯度离心；5)清洗Percoll。该方法不涉及酶解提取原生质体，及传统研磨过滤技术。该方法具有操作简便、快捷、成本低、提纯效果明显等优点。提纯后的细胞核几乎没有细胞质部分污染，不仅可以应用DNA纤维制备，还可以应用于细胞核蛋白质组学研究，对于研究梨花粉管生长代谢及自交不亲和反应具有重要的意义。
文档编号C12N5/04GK102443564SQ20111040296
公开日2012年5月9日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者吴俊 , 周宏胜, 张绍铃, 王春雷, 陶书田, 高永彬, 齐开杰 申请人:南京农业大学