专利名称：提取莲细胞核dna的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域中提取DNA的方法，尤其涉及一种提取莲细胞核DNA 的方法；具体涉及了一种以莲黄化苗叶片为材料、有效提取高质量莲细胞核DNA的方法。
背景技术：
莲，俗称荷花，是被子植物中起源最早的植物之一，素有“活化石”之称。它在我国的栽培历史悠久，是重要的水生经济作物，集食用、药用、观赏于一身。因莲具有独特的经济、文化和观赏价值，已引起了人们广泛的重视，但就分子生物技术在莲研究中的应用，目前主要集中在品种鉴定及演化关系分析、种质间遗传多样性评估等方面，还未开展深层次的莲基因组学研究。随着Illumina公司发布了新一代测序仪Genome Analyzer (Solexa产品系列)之后，Genome Analyzer作为新一代测序技术平台，具有通量高、单位成本低、测序周期短和操作简单等优点，是植物全基因组测序最经济有效的测序平台；但其对DNA质量有比较高的要求。DNA质量是基因组测序技术的基础，分离纯度高(少多糖、少多酚、少色素和蛋白质)、 叶绿体DNA和线粒体DNA含量低的核DNA，是测序仪高效和准确工作的基础，也是使测序序列达到最高可用性的保证。CTAB (十六烷基三甲基溴化铵法)法是一种快速简便的提取植物总DNA的常规方法(包括磨样、裂解、萃取、沉淀DNA，去除RNA等过程)，但通过CTAB法所获得的莲DNA样品含有较多的叶绿体DNA和线粒体DNA，而且杂质多、纯度低，在很大程度上影响莲基因组测序的均一性、无偏性和序列的有用性，从而最终影响序列的拼接质量，不适合用于莲基因组测序。因此，需要一种新方法提取高质量的莲细胞核DNA用于基于新一代测序技术的莲基因组测序。
发明内容
本发明的目的就在于克服现有技术存在的问题和不足，提供一种提取莲细胞核 DNA的方法。本发明的目的是这样实现的一、提取莲细胞核DNA的方法本方法包括下列步骤①称取20克黑暗条件下培养的剔除叶柄的莲黄化苗叶片，放置到经_20°C预冷 5-6小时的研钵中，再倒入适量的液氮，经快速研磨后得到细粉状样品；②将细粉状样品转移至装有200毫升、经4°C预冷1-2小时的细胞核提取缓冲液 Solution I的烧杯中，并在冰上用磁力搅拌器搅拌20分钟，得搅拌混合液；③将搅拌混合液用两层纱布和两层Miracloth滤布(美国Caibiochem公司产品) 过滤后，收集滤液，并转至50毫升离心管中，置于冷冻离心机上在4°C、ISOOrpm离心20分钟，离心管内溶液上下分层，上层为溶液，下层为白色沉淀物，弃去上层溶液；
④向白色沉淀物中加入40毫升Solution I缓冲液，轻轻晃动使之混合均勻，置于冷冻离心机上在4°C、ISOOrpm离心20分钟，离心管内溶液上下分层，上层为溶液状，下层为白色沉淀物，弃去上层溶液；重复步骤④两次，得到的白色沉淀物，即为纯化的细胞核；⑤向纯化细胞核内加入5毫升65°C的细胞核裂解缓冲液Solution II，并加入10 微升、浓度为10mg/ml的核糖核酸酶(RNase)溶液，轻轻转动使之混合均勻，在65°C的水浴锅中放置30分钟，期间上下颠倒混合一次，得混合液；⑥向混合液中加入5毫升的氯仿异戊醇=体积比为M 1的萃取液，上下颠倒混勻，然后在室温下静置5分钟，再于离心机上12000rpm离心15分钟，离心管内溶液上下分层，上层为水相，下层为有机相；⑦吸取上层水相至另一 50毫升离心管中，并加入4毫升的异丙醇，轻轻摇动混勻， 再置于-20°C的冰柜中30分钟，沉淀出絮状的莲细胞核DNA ；⑧用牙签挑出絮状的DNA沉淀物至另一容量为2毫升的离心管中，加入1毫升 70%乙醇洗涤液，轻轻摇动以充分洗涤DNA沉淀物，然后倾斜离心管，小心倒出洗涤液；⑨再次加入1毫升70%乙醇洗涤液，对DNA沉淀物进行洗涤，然后倾斜离心管，小心倒出洗涤液，将离心管放置于超净工作台上3-4小时，以吹干离心管内残留的乙醇洗涤液，并干燥DNA沉淀物；⑩向离心管中加200微升的Tris-EDTA(三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)缓冲液，轻轻摇动至DNA沉淀物充分溶解，然后将离心管放入-20°C冰柜中保存。工作原理经液氮研磨的莲黄化苗叶片用细胞核提取缓冲液提取和纯化细胞核，加入细胞核裂解缓冲液在65°C下裂解细胞核，再经过氯仿异戊醇的萃取、异丙醇的沉淀，得到絮状的 DNA沉淀，最后利用70%乙醇的洗涤DNA沉淀，即得高质量的莲细胞核DNA。本发明可分离到高纯度(少多糖、少多酚、少色素和蛋白质)、低叶绿体DNA和线粒体DNA含量的细胞核 DNA，满足莲基因组测序与研究所需要的高质量细胞核DNA。实验证明，通过本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果①通过本发明所获得的DNA为莲细胞核DNA，叶绿素DNA和线粒体DNA含量低；②通过本发明所获得的莲细胞核DNA质量和纯度高，所含多糖、多酚、色素和蛋白质少。③本发明适用于构建BAC文库和基因组测序等方面所需高质量细胞核DNA的提取。
具体实施例方式一、两种缓冲液1、细胞核提取缓冲液Solution I(1)细胞核提取缓冲液Solution I的组分
5三羟甲基氨基甲烷(Tris-base) 乙二胺四乙酸(EDTA) 氯化钾(KCl) 蔴糖(Sucrose)
聚乙二醇辛基苯基醚(iTritonX-IOO) 聚乙烯醇吡咯烷酮-30 (PVP-30) 亚精胺(Spermidine) 精胺(Spermine)
β -巯基乙醇(β -Mercaptoethanol)
2%；
1毫摩尔/升; 1毫摩尔/升; 0. 15% O
10毫摩尔/升; 10毫摩尔/升； 80毫摩尔/升； 0.5摩尔/升；(2)细胞核提取缓冲液Solution I的制备方法①前5种组分溶解和混合后，将pH调至9. 4-9. 5，然后置于灭菌瓶中在121 °C、 0. IMpa灭菌12-16分钟；②加入后4种组分混合；③密封备用。2、细胞核裂解缓冲液Solution II(1)细胞核裂解缓冲液Solution II的组分(2)细胞核裂解缓冲液Solution II的制备方法①前6种组分溶解和混合后，将pH调至7. 9-8. 0，然后置于灭菌瓶中在121 °C、 0. IMpa灭菌20分钟；②加入最后1种组分混合；③密封备用。二、实验结果将通过本发明获得的莲细胞核DNA和通过CTAB常规法获得的莲基因组DNA分别置于紫外分光光度计(型号为Ultrospec 1100)上测定其在波长260纳米、230纳米和观0 纳米的吸光值，并比较两种方法所得DNA的A260/A280和A260/A230的比值，结果见下表
三羟甲基氨基甲烷(Tris-base) 乙二胺四乙酸(EDTA) 山梨糖醇(Sorbitol) 氯化纳(NaCl) 十二烷基硫酸钠(SDS) 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) β -巯基乙醇(β -Mercaptoethanol)
50毫摩尔/升； 5毫摩尔/升； 350毫摩尔/升; 710毫摩尔/升;
权利要求
1.提取莲细胞核DNA的方法，其特征在于下列步骤①称取20克黑暗条件下培养的剔除叶柄的莲黄化苗叶片，放置到经_20°C预冷5-6小时的研钵中，再倒入适量的液氮，经快速研磨后得到细粉状样品；②将细粉状样品转移至装有200毫升、4°C预冷1-2小时的细胞核提取缓冲液 Solution I的烧杯中，并在冰上用磁力搅拌器搅拌20分钟，得搅拌混合液；③将搅拌混合液用两层纱布和两层Miracloth滤布过滤后，收集滤液，并转至50毫升离心管中，置于冷冻离心机上在4°C、1800 rpm离心20分钟，离心管内溶液上下分层，上层为溶液，下层为白色沉淀物，弃去上层溶液；④向白色沉淀物中加入40毫升SolutionI缓冲液，轻轻晃动使之混合均勻，置于冷冻离心机上在4°C、1800 rpm离心20分钟，离心管内溶液上下分层，上层为溶液状，下层为白色沉淀物，弃去上层溶液；重复步骤④两次，得到的白色沉淀物，即为纯化的细胞核；⑤向纯化细胞核内加入5毫升65°C的细胞核裂解缓冲液SolutionII，并加入10微升、 浓度为10mg/ml的核糖核酸酶溶液，轻轻转动使之混合均勻，在65°C的水浴锅中放置30分钟，期间上下颠倒混合一次，得混合液；⑥向混合液中加入5毫升的氯仿异戊醇萃取液，上下颠倒混勻，然后在室温下静置5 分钟，再于离心机上12000 rpm离心15分钟，离心管内溶液上下分层，上层为水相，下层为有机相；⑦吸取上层水相至另一50毫升离心管中，并加入4毫升的异丙醇，轻轻摇动混勻，再置于-20°C的冰柜中30分钟，沉淀出絮状的莲细胞核DNA ；⑧用牙签挑出絮状的DNA沉淀物至另一容量为2毫升的离心管中，加入1毫升70%乙醇洗涤液，轻轻摇动以充分洗涤DNA沉淀物，然后倾斜离心管，小心倒出洗涤液；⑨再次加入1毫升70%乙醇洗涤液，对DNA沉淀物进行洗涤，然后倾斜离心管，小心倒出洗涤液，将离心管放置于超净工作台上3-4小时，以吹干离心管内残留的乙醇洗涤液，并干燥DNA沉淀物；⑩向离心管中加200微升的Tris-EDTA缓冲液，轻轻摇动至DNA沉淀物充分溶解，然后将离心管放入_20°C冰柜中保存；其中细胞核提取缓冲液Solution I的组分三羟甲基氨基甲烷10毫摩尔/升乙二胺四乙酸10毫摩尔,/升氯化钾80毫摩尔./升蔗糖0. 5摩尔/'升;聚乙二醇辛基苯基醚0. 5% ；亚精胺1毫摩尔/升；精胺1毫摩尔/升；聚乙烯醇吡咯烷酮-302% ；β-巯基乙醇0. 15% ；pH 为 9. 4-9. 5 ；细胞核裂解缓冲液Solution II的组分三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸山梨糖醇氯化纳十二烷基硫酸钠十六烷基三甲基溴化铵 β-巯基乙醇 ρΗ 为 7. 9-8. 0。50毫摩尔/升； 5毫摩尔/升； 350毫摩尔/升 710毫摩尔/升 1% ； 0. 1% ； 0. 1% ；
全文摘要
本发明公开了一种提取莲细胞核DNA的方法；涉及分子生物学领域中提取DNA的方法。其主要步骤是向研磨成细粉状的莲黄化苗叶片中加入细胞核提取缓冲液，经磁力搅拌、过滤、离心、漂洗后，得到纯化细胞核；加入细胞核裂解缓冲液于65℃水浴，经氯仿异戊醇萃取和异丙醇沉淀后，得到絮状DNA沉淀物；经70%乙醇洗涤和室温干燥后，加Tris-EDTA缓冲液溶解DNA，于-20℃保存备用。通过本发明所获得的DNA为高质量的莲细胞核DNA，叶绿素DNA和线粒体DNA含量低，所含多糖、多酚、色素和蛋白质少。本发明适用于构建BAC文库和基因组测序等方面所需高质量细胞核DNA的提取。
文档编号C12N15/10GK102206629SQ20111008754
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月6日 优先权日2011年4月6日
发明者刘艳玲, 徐立铭, 杨美 申请人:中国科学院武汉植物园