专利名称：一种去除哺乳动物卵母细胞细胞核的方法
技术领域：
本发明涉及一种去除哺乳动物卵母细胞细胞核的方法。
背景技术：
哺乳动物体细胞克隆技术(mammalian somatic cell cloning)又称体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transfer)，是指通过特殊的人工手段，即以显微操作、电融合、复合活性化处理等技术为主线，将体细胞作为核供体，移入到成熟的、去核的、未受精的卵母细胞中，进行体外重构、体外培养、胚胎移植，从而达到扩繁同种基因型哺乳动物种群的目的。
卵母细胞的去核是体细胞核移植技术的关键技术环节，去核效率的高低直接关系到所构建克隆胚胎体外发育和受体移植妊娠率及产犊率的高低。McGrath报道了一步法去核，即在注入核供体细胞的同时将卵母细胞核吸引除去(McGrath，Solter D.Nuclear transplantation in the mouse embryo bymicrosurgery and cell fusion.[J]Science.1983.2201300-1302)，此操作只需要一个显微操作管，显微操作针直接与受核卵母细胞质接触，显微操作针的前部尖端易造成卵母细胞质的直接损伤，去核率仅有68.7％，重构胚的囊胚发育率仅有18.0％。Willadsen报道的吸引除核法(Willadsen.S M.Nucleartransplantation in sheep embryos[J].Nature，32063-65)，其缺点是操作繁琐，第一步需要用显微操作针在受核卵母细胞透明带第一极体的附近切口，切好之后需更换显微操作管。Shiga建立的一步挤压除核法(Shiga K，Fujite T，Hirose K.Production of calves by transfer of nuclei from cultured somaticcells obtained from Japanese black bulls.[J].j Theriogenology.1999，52527-535)，是用显微切割针在第一极体附近，将卵母细胞透明带切开1/3，调准切口，使其与切割针成垂直方向，固定卵母细胞，调节显微切割针，将切割针横压在卵母细胞的直径部位，垂直向下微微轻压，除去第一极体连同下面的一小部分细胞质，此时要掌握好显微操作针下压的尺度，要求操作者树立微观意识，避免损伤卵母细胞质。上述吸引法和挤压法在操作过程中都需要与细胞质的直接或间接接触，容易对细胞质造成损伤。
发明内容
本发明的目的是提供一种去除哺乳动物卵母细胞细胞核的方法。
本发明所提供的去除哺乳动物卵母细胞细胞核的方法，是将刚放出第一极体的卵母细胞的裸卵的透明带，在第一极体处切开周长的1/3，再点击所述透明带，除去第一极体连同下面的核物质。
刚放出第一极体的卵母细胞的裸卵均可按照常规方法获得。
所述点击透明带的位置是3点钟的位置。
所述哺乳动物卵母细胞可来自于牛、羊、猫狗等动物。
所述哺乳动物卵母细胞优选来自于牛。
所述刚放出第一极体的牛卵母细胞可按照以下方法获得将牛的卵母细胞在CR2aa+10％SCS+0.01mg/ml FSH+100IU/ml青霉素+100μg/ml链霉素的培养基中成熟培养18-22小时，得到刚放出第一极体的卵母细胞。
所述成熟培养的时间优选为18小时。
本发明的点击去核法避开显微切割针与细胞质的接触，减少显微切割针对细胞质的损伤，而吸引法和挤压法在操作过程中都需要与细胞质的直接或间接接触，容易对细胞质造成损伤；操作简单，去核效率高；本发明的“点击去核法”恰恰解决了吸引法和挤压法所存在的不足，可大大的提高核移植胚胎的囊胚发育率，点击去核法的去核率为90％，显著高于挤压法的88％和吸引法的68.7％；点击去核法的囊胚发育率34.1％极显著的高于吸引法的20.9％，显著高于挤压法的18％。本发明的点击去核法对牛体外成熟培养18-22h的卵母细胞去核，效果明显，因为卵母细胞在体外成熟培养18-22h的时候，刚刚放出第一极体，纺锤体距离第一极体很近，去核时容易；成熟培养到24h的时候，纺锤体已经移行到卵母细胞质的中心，远离第一极体，使去核的难度增大。本发明的去核方法是高动物克隆效率的有效途径。
图1a为22h体外成熟培养的卵母细胞照片图1b为22h体外成熟培养的卵母细胞裸卵的Hoechlst 33342染色照片图1c为显微针在第一极体的位置插入透明带的照片图1d为切开透明带的照片图1e为吸引法去核照片图1f为点击去核法去核照片
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例培养基中的百分数，均为质量百分含量。
实施例1、去除牛卵母细胞细胞核的方法1、核供体细胞的准备从屠宰场取来的牛胎儿皮肤上皮细胞，用DMSO液在-35℃的低温冰箱中保存3个月。解冻后，用含有10％FCS的DMEM细胞培养液以3000rpm/分的速度离心5分钟，清洗2次；去上清，沉淀物用含有10％FCS的DMEM的细胞培养液吹打分散，稀释之后接种到φ35mm的小平皿中进行增殖培养。当细胞长满皿底后进行细胞传代，筛选皮肤上皮细胞，用2.5mg/ml胰蛋白酶+0.1％Na2EDTA的Hank’s液进行5分钟静置消化处理，用细胞培养液2次离心洗涤，去上清液，加培养液，吹打分散细胞块，稀释后接种。经5-6代传代筛选培养，在使用前，一组进行5-6天的血清饥饿培养，做细胞周期同期化处理，一组常规培养，使用时的处理方法与细胞传代培养处理方法相同。
2、卵母细胞成熟培养将采集的卵巢，从灭菌的35℃生理盐水中取出，放在持有灭菌纸巾的左手上，选择直径为2-6mm的卵泡，用接有18G针头的5ml注射器吸取卵泡液，将抽取的含有卵母细胞的卵泡液注入15ml的离心管中，置于35℃保温水浴槽内，待沉淀后弃掉上清液，洗涤2次，将沉淀物移入到中央划有方格的平皿中，在实体显微镜下，选择有卵丘细胞附着，细胞质亮度均一，形态良好的卵母细胞，用成熟培养液洗涤2次后，移入4孔培养皿，置于39℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中，分别进行18、22、24h的成熟培养。卵母细胞成熟培养液采用CR2aa+10％SCS(Superovulated Cow Serum)+0.01mg/ml FSH(Follicle Stimulating Hormone)+100IU/ml青霉素+100μg/ml链霉素。其中，CR2aa的培养基成分如表1。
表1、CR2aaEmbryo Culture medium
其中，22h体外成熟培养的卵母细胞如图1a所示，卵丘细胞膨胀。分别将成熟培养18、22、24h的一部分卵母细胞用0.1％透明质酸酶-HSOF(-Ca2+、-Mg2+)(2mg/ml透明质酸酶+HSOF(-Ca2+、-Mg2+))除去卵丘细胞后，用2μg/ml Hoechlst 33342(Calbiochem制)对裸卵进行染色，观察卵母细胞核的成熟情况。其中，22h体外成熟培养的卵母细胞裸卵的2.5μg/ml Hoechlst 33342染色结果如图1b所示，箭头所指方向为细胞核所在位置。其中，HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液的组成如表2。
表2 HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液的配方
3、受核卵母细胞的去核将经过18、22、24h成熟培养的卵母细胞，在含有0.1％透明质酸酶(Sigma制)，不含Ca2+、Mg2+的HSOF液中，吹打除掉卵丘细胞，裸卵以放出第一极体的位置，作为显微操作去核的标志。
(1)“点击去核法”将经过18、22、24h成熟培养的卵母细胞裸卵洗净，每20个为一组移入7.5μg/ml的细胞松驰素B(CB)100μl微滴中，以显微操作仪的左手油压侧控制显微固定细管和右手侧控制显微切割针，在第一极体附近，将卵母细胞透明带切开1/3(周长的1/3)，调准切口(图1c和图1d)，使其与切割针成垂直方向，固定卵母细胞，用显微针点击透明带的3点钟位置上的一点(图1f，箭头所指方向为第一极体)，除去第一极体连同下面的一小部分细胞质(核物质)。
将除掉的这一小部分细胞质，放入载有2.5μg/ml Hoechlst 33342液滴的载玻片上，10分钟后压片，在荧光显微镜下观察，发蓝色荧光的为去掉的DNA核。
不同培养时间对卵母细胞去核成功率的影响结果如表3所示，采用不同的培养时间对卵母细胞进行体外成熟培养，并且采用点击去核法对成熟培养18h的卵母细胞进行去核，其去核率达90％，显著高于22h组的75.8％(P＜0.05)，极显著高于24h成熟培养的55.6％(P＜0.01)，22h组显著高于24h组(P＜0.05)。
表3.体外培养成熟时间对牛卵母细胞去核率的影响
注a，cP＜0.01；a，b、b，cP＜0.05(2)挤压法将经过18h成熟培养的卵母细胞裸卵洗净，每20个为一组移入7.5μg/ml的细胞松驰素B(CB)100μl微滴中，以显微操作仪的左手油压侧控制显微固定细管和右手侧控制显微切割针，在第一极体附近，将卵母细胞透明带切开1/3(周长的1/3)，调准切口，使其与切割针成垂直方向，固定卵母细胞，调节右手显微切割针，将切割针横压在卵母细胞的直径部位，垂直向下微微轻压，除去第一极体连同下面的一小部分细胞质，此时要掌握好显微操作针下压的尺度，要求操作者树立微观意识，避免损伤卵母细胞质。DNA检查方法同步骤(1)。
(3)吸引法将经过18h成熟培养的卵母细胞裸卵洗净，每20个为一组移入7.5μg/ml的细胞松驰素B(CB)100μl微滴中，以显微操作仪的左手油压侧控制显微固定细管和右手侧控制显微切割针，在第一极体附近，固定卵母细胞，调节右手所控制的显微吸引管，此管的前端磨成斜口，并将斜口的尖端拉成1μm长的尖，调准卵母细胞的第一极体到3点钟的位置，在第一极体偏上的位置将显微针管插入透明带，顺卵周间隙向前移动显微管，使显微操作管的斜口贴近卵母细胞质的质膜，但不能损伤质膜，微微向下压显微管，使其在具有一定压力又不损伤卵母细胞质膜的情况下，使显微管接近第一极体，顺势将第一极体连同其下一小部分细胞质吸入显微管内(图1e，箭头所指方向的小圆亮点为第一极)，此时调节右手按钮，将显微管移出透明带，去核完成，此法要求操作者动作精细、要十分准确，针尖很容易损伤质膜。DNA检查方法同步骤(1)。
4、移核配制含有5％蔗糖的HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液体(HSOF(-Ca2+、-Mg2+)+5％蔗糖)，作成100μl的微滴，将除核后的受体胞质，20个一组移入该液中，静置5分钟后，再将其移到同种液体的显微操作液微滴(100μl)中，同时将洗涤好的核供体细胞，也移到此液滴中。此时，核供体细胞和受核卵母细胞质均处于脱水状态，体积变小。显微操作将核供体细胞，用微细吸管经切口处，注入受核卵母细胞卵周隙，抽出显微移核细管，轻压透明带，使其切口闭合。
5、电融合及复合活性化处理将移核重构胚，移入含有0.25％蔗糖和10％FCS的HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液(HSOF(-Ca2+、-Mg2+)+10％FCS+2.5％蔗糖)中，静置5分钟使其复水，然后用含有0.25％蔗糖和10％FCS的HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液洗涤2次，使其核质完全复原之后，用ECM2001(BTX)融合仪、1mm间隔的融合室、含有0.05％BSA的融合液(0.3M甘露醇+0.5mM HEPES+0.05mM Ca(C2H3O2)+0.1mM Mg(C2H3O2)2+0.05％BSA)，分别采用0.50、0.75、1.025、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25和2.50kv/cm的电场强度进行直流电脉冲处理，脉冲宽度为50μs，连续2次的融合条件进行电融合，将电融合处理后的移核重构胚洗涤2次，移入含有0.25％蔗糖和10％FCS的HSOF(-Ca2+、-Mg2+)液中，放入38.5℃、5％CO2、100％湿度的常压CO2培养箱中，2小时后，观察融合状态，选择融合的重构胚，以5μl/10ml Ca-离子载体HSOF(+Ca2+、+Mg2+)液(5μl钙离子载体液+10ml HSOF(+Ca2+、+Mg2+)，其中钙离子载体液的配方为1mg钙离子载体+0.191ml DMSO)，在避光下处理4分钟，然后移入6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)SOF(+Ca2+、+Mg2+)液(2mM 6-DMAP+SOF(+Ca2+、+Mg2+)+10％FCS)中，放入38.5℃、5％CO2、100％湿度的常压CO2培养箱中，培养4小时，进行复合活性化处理。其中，SOF(+Ca2+、+Mg2+)液的配方如表4。
表4 SOF(+Ca2+、+Mg2+)液的配方
6、移核重构胚的体外发育培养将复合活性化处理的移核重构胚洗涤2次，采用CR2aa+10％FCS+10ul/ml胰岛素+100IU/ml青霉素+100μg/ml链霉素培养液进行发育培养，168h后观察移核重构胚的囊胚发育情况。
采用吸引法、挤压法和点击法对卵母细胞去核率和囊胚发育率进行比较，结果如表5所示，表明点击法的去核成功率最高，并获得了较高的囊胚发育率。
表5 不同去核方法对牛卵母细胞的去核率及囊胚发育率的影响
注a，bP＜0.01 a，cP＜0.05*试验次数
权利要求
1.一种去除哺乳动物卵母细胞细胞核的方法，是将刚放出第一极体的卵母细胞的裸卵的透明带，在第一极体处切开周长的1/3，再点击所述透明带，除去第一极体连同下面的核物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述点击透明带的位置是3点钟的位置。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述哺乳动物卵母细胞来自于牛、羊、猪、猫或狗。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述哺乳动物卵母细胞来自于牛。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述刚放出第一极体的牛卵母细胞按照以下方法获得将牛的卵母细胞在CR2aa+10％SCS+0.01mg/mlFSH+100IU/ml青霉素+100μg/ml链霉素的培养基中成熟培养18-22小时，得到刚放出第一极体的卵母细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述成熟培养的时间为18小时。
全文摘要
本发明公开了一种去除哺乳动物卵母细胞细胞核的方法。本发明所提供的去除哺乳动物卵母细胞细胞核的方法，是将刚放出第一极体的卵母细胞的裸卵的透明带，在第一极体处切开周长的1/3，再点击透明带，除去第一极体连同下面的核物质。本发明的点击去核法避开显微切割针与细胞质的接触，减少显微切割针对细胞质的损伤；操作简单，去核效率高；点击去核法的去核率为90％，显著高于挤压法的88％和吸引法的68.7％；点击去核法的囊胚发育率34.1％极显著的高于吸引法的20.9％，显著高于挤压法的18％。本发明的去核方法是高动物克隆效率的有效途径。
文档编号C12N15/01GK1769442SQ20051010934
公开日2006年5月10日 申请日期2005年10月13日 优先权日2005年10月13日
发明者董雅娟, 柏学进 申请人:莱阳农学院