专利名称：一种抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体片段的制备方法，特别涉及一种抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段的制备方法。
背景技术：
人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)是人类受孕后胎盘合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，分子量约为38000D，hCG的合成与分泌与妊娠是密切相关的。hCG的检查可作为早孕检测的一项重要指标，采用抗hCG单克隆抗体进行早孕检测，可以进一步提高早期妊娠诊断的敏感性和特异性。而且hCG的含量与许多肿瘤性疾病有着密切的联系，可将hCG看作是肿瘤标志物之一，因此hCG的检查也可对滋养层细胞肿瘤和非滋养层细胞肿瘤的诊断与治疗监测提供依据。近年来发现，恶性肿瘤如胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等血中hCG也可升高，在患膀胱癌、胰腺癌、结肠癌的个体的血清中常可检测得到hCGi3亚基蛋白有明显地提高，而且在肿瘤组织中通过过氧化物酶染色法也可以检测到。另外相对于单克隆抗体，单克隆抗体片段(包括Fab和F(ab' )2片段)具有更多优势(1)不受位于巨噬细胞、B细胞、T细胞、中性粒细胞和巨细胞等细胞上的Fc受体的影响；(2)不沉淀抗原；(3)在正常组织中分解放射性标记片段比整个IgG偶联物更快；(4) 降低免疫原性(Fe区缺失)，使人抗鼠免疫球蛋白(HAMA)反应最小化；(5)更不易遭到吞噬细胞攻击；(6)分子量小，到达肿瘤部位迅速。因此，若能研制出高纯度、效果好、免疫原性弱的人绒毛膜促性腺激素(hCG)单克隆抗体片段，并应用与诊断试剂的开发，必将带来可观的社会与经济效益。根据目前国内外文献及专利报道，抗体片段的制备，都采用游离的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解抗体再经过多步分离纯化制得，该类方法存在游离酶无法重复利用，去除游离酶同时会降低产物回收率等问题。
发明内容
本发明目的是提供一种抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段的制备方法，该方法操作简便、纯化步骤少、所得抗体片段纯度高。本发明采用的技术方案是一种抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段的制备方法，所述方法为将含0. 1 lmmol/L DTT 和 0. 1 2. 5mmol/L EDTA 的 ρΗ5· 0 9. 0 的 0. lmol/L 醋酸缓冲溶液在 30 50°C下水浴5 lOmin，加入固定化木瓜蛋白酶，30 50°C水浴20 30min，抽滤，弃去滤液A即除去DTT，获得滤饼A即为活化的固定化木瓜蛋白酶，将活化的固定化木瓜蛋白酶于pH5. 00. lmol/L醋酸缓冲液中，加入抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体，30 60°C水浴反应4 Mh，反应液抽滤，滤饼B为固定化木瓜蛋白酶回收利用，滤液B即为含单克隆抗体片段的水解液，采用弱阴离子交换层析对含单克隆抗体片段的水解液进行分离纯化，获得所述抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段；所述固定化木瓜蛋白酶以氨化纸纤维为载体， 以戊二醛为交联剂，以木瓜蛋白酶为底物，于含lmmol/L DTT和2mmol/L EDTA的pH5. 0的 0. lmol/L醋酸缓冲液中，室温下搅拌8 Mh，抽滤，得滤饼C即为固定化木瓜蛋白酶；所述氨化纸纤维是纸纤维先经0. 1 0. 2mol/L的NaOH溶液处理2 3h，再用环氧氯丙烷于 60 70°C活化0. 5 lh，最后用对苯二胺于40 50°C氨化0. 5h，用蒸馏水充分洗涤，真空干燥至恒重，获得氨化纸纤维；所述固定化木瓜蛋白酶质量用量以抗体体积计为0. 1 0. 2g/ml抗体，所述固定化木瓜蛋白酶载酶量为0. 002g/g固定化酶，所述抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体利用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化获得。所述固定化木瓜蛋白酶按如下方法制备将氨化纸纤维分散于含lmmol/L DTT和 2mmol/L EDTA的pH2. 0 6. 5的0. lmol/L醋酸缓冲溶液A中，加入木瓜蛋白酶和质量浓度25 %的戊二醛水溶液，室温下搅拌8 Mh，抽滤，滤饼C用与所述的醋酸缓冲溶液A相同的醋酸缓冲液B充分洗涤，过滤，滤饼即获得固定化木瓜蛋白酶；所述氨化纸纤维与木瓜蛋白酶的质量比为1 0.006，所述25%戊二醛水溶液以氨化纸纤维质量计为0.317ml/g， 所述醋酸缓冲溶液A的体积用量对本发明没有影响，能够使纸纤维充分分散即可，体积用量通常以氨化纸纤维的质量计为33 40ml/g，所述醋酸缓冲液B的体积用量通常能够充分洗涤即可。所述氨化纸纤维按如下方法制备将滤纸剪碎、水煮至烂，纱布过滤，滤饼a即纸纤维，将纸纤维加入0. 1 0. 2mol/L的NaOH溶液A中搅拌池，水洗至pH7. 0，抽滤，取滤饼 b按质量体积比1 9加入0.5 lmol/L的NaOH溶液B，按与滤饼b质量体积比1 1加入环氧氯丙烷，60 70°C水浴搅拌反应30min，抽滤，滤饼c用去离子水充分洗涤后抽干，获得滤饼d，再以质量体积比0.2 1加入对苯二胺，于45°C下反应30min，用蒸馏水充分洗涤，真空干燥至恒重，获得氨化纸纤维。所述弱阴离子交换层析为DEAE-S^horose-FF层析，以pH8. 0含lmol/LNaCl的 20mmol/L的Tris-HCl作为洗脱液，线性梯度洗脱，收集第一洗脱峰，获得所述抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段。本发明所述固定化木瓜蛋白酶的载酶量为0.002g/g固定化酶，酶活1940U/g，酶活定义为在上述条件下，每分钟释放Iug的酪氨酸的酶量为一个酶活力单位U。本发明所述固定化木瓜蛋白酶酶活测定方法为在试管中加入2ml的0. Imol/ L的醋酸缓冲液(ρΗ5· 0，内含0. 005mol/L DTT和0. OOlmol/LEDTA)，8ml 2%酪蛋白溶液 (ρΗ7· 0)，37°C水浴预热5min,然后加入0. 5g(湿重，Ig湿重相当于0. 4g干重)固定化酶， 于37°C反应30min后加入5ml 10%三氯乙酸溶液，震荡后于37°C放置lOmin，过滤，测滤液在^Onm处的吸光度。效价(单位/g) = A/As*Cs*12/2* 稀释倍数 /V式中A为供试品溶液的吸光度减去空白溶液的吸光度；As为酪氨酸对照品溶液的吸光度；Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度ug/ml ；W为供试品质量，g。本发明所述小鼠腹水来源通常是将hCG抗原注入小鼠体内，小鼠体内发生免疫反应，得到hCG抗原，抽取小鼠腹水，即得到所述粗抗，本发明采用艾康生物技术有限公司生产的抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体的小鼠腹水作为粗抗，经过辛酸-硫酸铵法纯化获得抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体。本发明所述纸纤维取自普通滤纸。DTT即DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇。分子式为C4HltlO2S2，分子量为 154. 25，纯度> 99%。本发明所述滤饼A、滤饼B、滤饼C，滤饼a、滤饼b、滤饼c，均为不同步骤过滤所得滤饼，滤液A即为滤液，为便于区分而命名。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明中的以氨化纸纤维为载体，以戊二醛为交联剂，以木瓜蛋白酶为底物得到的固定化木瓜蛋白酶可以反复利用，回收简单，随着生产规模的扩大，可以大大降低生产成本，并且不用考虑游离酶在抗体片段中的残留问题，可以节省分离纯化的步骤从而提高抗体片段的得率；另外本发明方法操作简便、纯化步骤少、所得抗体片段纯度高本发明中制备的抗体片段只需经过一步纯化就可达到90%以上的纯度。
图1固定化木瓜蛋白酶悬浮液照片图2DEAE-S印horose-FF柱纯化抗体片段色谱图A为穿透峰，B洗脱峰图3抗体片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定图1为抗体片段电泳图，2为标准蛋白电泳图
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例11)木瓜蛋白酶的固定化将滤纸剪碎，加入自来水，煮沸，煮烂后用8层纱布过滤，取滤饼加入IOOOml 0. lmol/L的NaOH溶液，搅拌2h,水洗至pH将近7. 0，抽滤，取1. 2g 滤饼(干重)按1 9 (g/ml)的比例加入lmol/L的NaOH溶液，再按与滤饼质量体积比 1 l(g/ml)的比例补加环氧氯丙烷，60°C水浴搅拌反应30min，抽滤，滤饼用去离子水充分洗涤，抽干，滤饼再按与1.2g滤饼质量比0.2 1加入对苯二胺(0.24g对苯二胺/1.2g 滤饼载体)，于45°C下反应30min，过滤，滤饼用蒸馏水充分洗涤，真空干燥至恒重，获得氨化纸纤维1. 2g。以氨化纸纤维为载体，以戊二醛为交联剂制备固定化木瓜蛋白酶将上述 1. 2g氨化纸纤维分散于pH5. 0的0. lmol/L的醋酸缓冲液(内含lmmol/L DTT和2mmol/L EDTA)40ml，加入7. 2mg木瓜蛋白酶(生工生物工程上海有限公司)和质量浓度25%戊二醛水溶液0. 387ml，室温(25°C )下搅拌12h，抽滤，滤饼用pH5. 0,0. lmol/L的醋酸缓冲液充分洗涤，过滤，滤饼为固定化木瓜蛋白酶，悬浮于pH5.0、0. lmol/L的醋酸缓冲液中备用，如图 1所示。2)单克隆抗体的制备利用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化用4倍体积的醋酸缓冲液(60mmol/L，pH4. 0)稀释含抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体的小鼠腹水(艾康生物技术有限公司)，用0. lmmol/L NaOH调pH至4. 5，获得150ml混合液，逐滴加入1. 875ml辛酸(25ul/ml混合液)，边滴加边搅拌，滴完后继续搅拌30min，8000r/min离心30min，取上清液按体积比10 1与PBS混合，用0. lmol/L的NaOH调pH至7. 4，加入；35. 0658g硫酸铵(0. 227g/ml混合液)搅拌30min后，6000r/min离心15min，弃上清液，将沉淀悬浮于 PBS (起始腹水体积的1/ 中，悬浮液用100倍体积的PBS透析过夜，获得抗人绒毛膜促进性腺激素单克隆抗体(HCG) 5ml，于-20°C保存。为了防止提纯过程中抗体被破坏，以上所有搅拌和操作过程均在4°C条件下进行。3)单克隆抗体的酶解在试管中加入3. 5ml 0. lmol/L, pH5. 0的醋酸缓冲液(内含0.5ml DTT及lmlEDTA)，30°C水浴预热5min，然后加入Ig固定化木瓜蛋白酶(湿重，载酶量0. 002g,酶活1940U/g)，30°C反应30min，抽滤，弃去滤液即除去DTT，获得滤饼即活化的固定化木瓜蛋白酶，将活化后的固定化木瓜蛋白酶Ig置于0. lmol/L、pH5. 0的15ml醋酸缓冲溶液中加入5ml上述HCG抗体，37°C水浴反应他，抽滤，取滤液，即为含HCG片段的水解液，滤饼即固定化木瓜蛋白酶，回收重复利用。4)单克隆抗体片段的纯化取上述含HCG片段的水解液，用非还原性的SDS-PAGE 电泳检测抗体消化的程度(非还原性的电泳即样品中不加DTT，从而保证抗体内部的二硫键不被破坏，电泳可以直观显示片段的分子量及纯度，如果未消化完全，则除了有片段的条带外，还有完整的抗体条带)，采用弱阴离子交换层析(DEAE-S印horose-FF，2cmX 18cm, Pharmacia公司)对所得抗体片段进行分离纯化，利用Tris-HCl (pH8. 0,20mmol/L)作为上样缓冲液(A液)，以lmol/LNaCl的Tris-HCl (ρΗ8· 0，20mmol/L)作为洗脱液(B液)，采用线性梯度洗脱，流速2ml/min，收集第一洗脱峰即为抗体片段(参见图2)。实施例21)木瓜蛋白酶的固定化将滤纸剪碎，加入自来水，煮沸，煮烂后用8层纱布过滤， 在纸纤维中加入1000ml 0. 2mol/L的NaOH溶液，搅拌3h，水洗至pH将近7. 0，抽滤，取1. 2g 滤饼(干重)按1 9 (g/ml)的比例加入lmol/L的NaOH溶液，再按与滤饼质量体积比 1 1 (g/ml)的比例补加环氧氯丙烷，60°C水浴搅拌反应30min，抽滤，滤饼用去离子水充分洗涤后抽干，获得滤饼，再按与1.2g滤饼质量体积比0.2 1加入对苯二胺(0.24g对苯二胺/1. 2g滤饼载体)，于45°C下反应30min，用蒸馏水充分洗涤，真空干燥至恒重，获得氨化纸纤维。以氨化纸纤维为载体，以戊二醛为交联剂，以木瓜蛋白酶为底物制备固定化木瓜蛋白酶将1. 2g氨化纸纤维载体分散于pH5. 0的0. lmol/L的醋酸缓冲液(内含lmmol/L DTT和2mmol/L EDTA) 40ml，加入7. 2mg木瓜蛋白酶和0. 387ml质量浓度25 %戊二醛水溶液，室温下搅拌12h，抽滤，滤饼用0. lmol/L的醋酸缓冲液充分洗涤，过滤，滤饼即为固定化木瓜蛋白酶，悬浮于pH5.0、0. lmol/L的醋酸缓冲液中备用。2)单克隆抗体的制备利用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化，小鼠腹水的获得同实施例1。用4倍体积的醋酸缓冲液(60mmol/L，pH4. 0)稀释腹水，用0. Immom/LNaOH 调pH至4. 5，获得150ml混合液，将1. 875ml辛酸(25ul/ml混合液)逐滴加入样品中，边滴加边搅拌，滴完后继续搅拌30min，8000r/min离心30min，取上清液按体积比10 1与 PBS混合，用0. lmol/L的NaOH调pH至7. 4，加入硫酸铵35. 0658g(0. 227g/ml混合液)搅拌30min后，6000r/min离心15min，弃上清液，将沉淀悬浮于PBS(起始腹水体积的1/5)中。 悬浮液用100倍体积的PBS透析过夜，获得抗人绒毛膜促进性腺激素单克隆抗体(HCG)5ml，于-20°C保存。微量防止提纯过程中抗体被破坏，以上所有搅拌和操作过程均在4°C条件下进行。3)单克隆抗体的酶解在试管中加入3. 5ml 0. lmol/L, pH8. 0的磷酸缓冲液(内含0.5ml DTT及lmlEDTA)，50°C水浴预热5min，然后加入0. 5g固定化木瓜蛋白酶(湿重， 载酶量0. 002g,酶活1940U/g)，50°C反应30min。抽滤，弃去滤液即除去DTT，滤饼即再活化的固定化木瓜蛋白酶。活化后的固定化木瓜蛋白酶0. 5g置于0. lmol/L、pH5. 0的15ml醋酸缓冲溶液中加入5ml HCG抗体，50°C水浴反应12h，抽滤，取滤液即为含HCG片段的水解液，滤饼即固定化酶回收重复利用。4)单克隆抗体片段的纯化取上述含HCG片段的水解液，用非还原性的SDS-PAGE 电泳检测抗体消化的程度，采用弱阴离子交换层析对所得抗体片段进行分离纯化，利用 Tris-HCl (ρΗ9· 0，20mmol/L)作为上样缓冲液(A 液，lmol/LNaCl 的 Tris-HCl (ρΗ9· 0， 20mmol/L)作为洗脱液(B液)，采用线性梯度洗脱，流速aiil/min，收集第一洗脱峰即为抗体片段。所得抗体片段经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度达到95% (参见图3)。
权利要求
1.一种抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段的制备方法，其特征在于所述方法为将含 0. 1 lmmol/L DTT 和 0. 1 2. 5mmol/L EDTA 的 pH5. 0 9. 0 的 0. lmol/L 醋酸缓冲溶液在30 50°C下水浴5 lOmin，加入固定化木瓜蛋白酶，30 50°C水浴20 30min， 抽滤，弃去滤液A，获得滤饼A即为活化的固定化木瓜蛋白酶；将活化的固定化木瓜蛋白酶于pH5.0、0. lmol/L醋酸缓冲液中，加入抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体，30 60°C水浴反应4 Mh，反应液抽滤，滤饼B为固定化木瓜蛋白酶回收利用，滤液B即为含单克隆抗体片段的水解液；采用弱阴离子交换层析对所述含单克隆抗体片段的水解液进行分离纯化， 获得所述抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段；所述固定化木瓜蛋白酶以氨化纸纤维为载体，以戊二醛为交联剂，以木瓜蛋白酶为底物，于含lmmol/LDTT和2mmol/L EDTA的pH5. 0 的0. lmol/L醋酸缓冲液中，室温下搅拌8 Mh，抽滤，得滤饼C即为固定化木瓜蛋白酶；所述氨化纸纤维是纸纤维先经0. 1 0. 2mol/L的NaOH溶液处理2 汕，再用环氧氯丙烷于 60 70°C活化0. 5 lh，最后用对苯二胺于40 50°C氨化0. 5h，用蒸馏水充分洗涤，真空干燥至恒重，获得氨化纸纤维；所述固定化木瓜蛋白酶质量用量以抗体体积计为0. 1 0. 2g/ml抗体，载酶量为0. 002g/g固定化酶，所述抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体利用辛酸-硫酸铵法对小鼠腹水进行纯化获得。
2.如权利要求1所述的抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段的制备方法，其特征在于所述固定化木瓜蛋白酶按如下方法制备将氨化纸纤维分散于含lmmol/L DTT和2mmol/L EDTA的pH2 6. 5的0. lmol/L醋酸缓冲溶液A中，加入木瓜蛋白酶和质量浓度25%戊二醛水溶液，室温下搅拌8 Mh，抽滤，滤饼C用与所述的醋酸缓冲溶液A相同的醋酸缓冲液B充分洗涤，过滤，滤饼即获得固定化木瓜蛋白酶；所述氨化纸纤维与木瓜蛋白酶的质量比为1 0.006，所述25%戊二醛水溶液的体积用量以氨化纸纤维质量计为0.317ml/g。
3.如权利要求1或2所述的抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段的制备方法，其特征在于所述氨化纸纤维按如下方法制备将滤纸剪碎、水煮至烂，纱布过滤，滤饼a即纸纤维， 将纸纤维加入0. 1 0. 2mol/L的NaOH溶液A中搅拌2h，水洗至pH7. 0，抽滤，取滤饼b按质量体积比1 9加入0.5 lmol/L的NaOH溶液B，按与滤饼b质量体积比1 1加入环氧氯丙烷，60 70°C水浴搅拌反应30min，抽滤，滤饼c用去离子水充分洗涤后抽干，获得滤饼d，再按与滤饼b质量比0.2 1加入对苯二胺，于45°C下反应30min，用蒸馏水充分洗涤，真空干燥至恒重，获得氨化纸纤维。
4.如权利要求1所述的抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段的制备方法，其特征在于所述弱阴离子交换层析为DEAE-S印horose-FF层析，以pH8. 0含lmol/LNaCl的20mmol/L的 Tris-HCl作为洗脱液，线性梯度洗脱，收集第一洗脱峰，获得所述抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段。
全文摘要
本发明公开了一种抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段的制备方法将活化的固定化木瓜蛋白酶于pH5.00.1mol/L醋酸缓冲液中，加入抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体，30～60℃水浴反应4～24h，反应液抽滤，滤饼B为固定化木瓜蛋白酶回收利用，滤液B即为含单克隆抗体片段的水解液，采用弱阴离子交换层析对含单克隆抗体片段的水解液进行分离纯化，获得所述抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体片段；本发明方法操作简便、纯化步骤少、所得抗体片段纯度高；本发明中制备的抗体片段只需经过一步纯化就可达到90％以上的纯度。
文档编号C12P21/06GK102417920SQ20111040300
公开日2012年4月18日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者应国清, 易喻, 李慧娟, 梅建凤, 王鸿, 陈建澍 申请人:浙江工业大学