专利名称：一种促进大花杓兰种子共生萌发的真菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种促进大花杓兰种子共生萌发的真菌及其应用。
背景技术：
自然条件下，兰科植物种子的萌发都必需与适宜的真菌共生才能实现，常规播种不能萌发，分株繁殖的效率又太低。随着实验室条件下种子非共生无菌萌发方法诞生和不断发展完善，几十年来极大地促进了兰花人工繁殖和兰花产业的快速发展。目前几乎所有的附生兰和部分地生兰的种子繁殖都是采用成熟或未成熟的种子通过无菌培养萌发而来。 尽管无菌条件下的非共生萌发有其自身的优点，同时也有它的局限性，以杓兰属植物为代表的许多温带地生兰类群的种子在无菌培养基中萌发困难。大花杓兰只有在种子发育途中一个极短的发育阶段才可能在非共生培养基中萌发，而且萌发率不高，未成熟种子不耐储藏，采集后必须即时播种，否则种子将失去活性。诸多限制因子导致大花杓兰的批量繁殖难以实现，至今没有人工繁殖的植株来满足巨大的国内国际市场的需求，野生植株的过度采集导致资源枯竭。在生物多样性保护和濒危物种种质资源保存研究中，种子的长期保存是研究的主流和热点之一。兰科植物种子极其微小，长度不足1mm，相比其他植物更具有种子保存的优势，可以在同样的空间和资金条件下保存更多的种类。利用特定真菌共生萌发的方式可以突破大花杓兰成熟种子非共生方式不能萌发的瓶颈。另一方面，大花杓兰单个果荚内种子数量多，通过种子播种繁殖是提高繁殖效率的最佳途径，人工繁育的植株可以进入国际园艺市场，帮助减轻野外采集压力，创造良好的社会和经济效益。因此了解大花杓兰与真菌间的共生关系，筛选出有益共生菌株，对其保育研究和生产繁殖都具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进大花杓兰种子共生萌发的真菌及其应用。本发明提供的菌株Cm-J-R-2，经形态学和分子生物学鉴定为担子菌亚门胶膜菌科的瘤菌根菌属(Epulorhiza sp.)，已于2011年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. M07。本发明还保护所述菌株Cm-J-R-2在促进大花杓兰种子萌发中的应用。所述应用的具体方法如下将所述菌株Cm-J-R-2与大花杓兰种子共培养。所述共培养具体可在燕麦培养基上进行。燕麦培养基的具体制备方法如下将2. 5g燕麦片加入IOOOml蒸馏水中，煮沸30 分钟，纱布过滤冷却后用蒸馏水定容至IOOOml，加入8g琼脂，调节pH值至6. 0，加热搅拌至
琼脂溶解。菌株Cm-J-R-2可以促使大花杓兰种子萌发，平均萌发率为29.34%。本发明对于大花杓兰的繁育具有重大价值。
图1为菌株Cm-J-R-2的形态。图2为念珠状细胞的微观特征。图3为种子共生萌发出的原球茎；A 培养皿中共生萌发出的原球茎；B =A图的局部放大图。图4为种子共生萌发出的原球茎(体式显微镜)；A 空白对照组中的种子(未萌发)；B 种子与真菌共生萌发出的原球茎；C和D =B图的局部放大图。图5为大花杓兰种子与真菌共生的萌发率。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。大花杓兰(Cypripedium macranthos)公众可以从北京市植物园获得；参考文献张毓，赵世伟，张启翔，等.北京地区大花杓兰资源调查与生物学特性研究.2005中国观赏园艺研究进展[C].北京中国林业出版社.2005 :92-95.。实施例1、菌株Cm-J-R-2的获得一、试验材料采集从吉林长白山的自然种群中采集大花杓兰新鲜根系(尽量选择植株的新鲜幼根)，用无菌的刀片和镊子截取根段，带回实验室进行分离。 二、大花杓兰根内真菌的分离采用切片法分离大花杓兰根内真菌，具体步骤如下1、将根段样品洗净，用流水冲洗30分钟，切成5mm的小段，放入75%酒精中15s， 然后无菌水冲洗1次；2、将菌根转入1. 5%氯化汞中^iin，再用无菌水冲洗4次；3、将根段蘸0. lg/L氯霉素后，插入PDA平板培养基中，25°C恒温箱中避光培养。4、分离到的真菌分别转移到新的PDA培养基上进行纯化，不断重复，直至没有任何杂菌污染，即移入PDA斜面培养基中保存，具体步骤如下(1)定期观察PDA平板，待真菌生长至肉眼可见的菌落后，分别记录PDA平板培养基上的菌落数及种类；(2)分别从各菌落顶端截取菌丝转移到新的PDA平板培养基上，继续放入恒温箱中进行避光培养；(3)不断重复上述两个步骤，直至无任何杂菌污染；(4)将纯化后的菌转移到PDA斜面培养基上，放入4°C冰箱内保存，备用。将分离到的一株菌命名为菌株Cm-J-R-2。三、菌株Cm-J-R-2的鉴定1、分子鉴定
(1)采用 Tianen，China 公司的 the TIANamp DNAsecure Plant Kit 试剂盒，提取菌株的基因组DNA。(2)以基因组DNA为模板，采用ITS1/ITS4和ITS4/ITS5引物在热循环仪上PCR扩增核糖体ITS特定DNA片段。(3)采用鼎国公司(Dingguo，Beijing, China)的DNA片段快速纯化试剂盒 (Purification/Recover Kit)进行纯化后，用BigDye循环测序试剂盒，结合ABI 3730自动 iiJi^ft (Applied Biosystems, Foster City, CA) iij·。测序结果如序列表的序列1所示。将测序结果在GenBank中进行BLAST (http // www, ncbi. nlm. nih. gov/blast)，与 GENBANK ACCESSION NO. GQ241745. 1 的相似性最高，为 99%。2、形态鉴定菌株形态见图1。菌落乳白色，菌丝不发达，有蜡质感，生长缓慢，培养过程中菌丝会形成球形或近球形的念珠状细胞。念珠状细胞的微观特征见图2。根据分子序列特征和菌落宏微观特征，本发明鉴定菌株Cm-J-R-2为担子菌亚门胶膜菌科无性型真菌瘤菌根菌属(Epulorhiza)的成员。菌株Cm-J-R-2已于2011年10月观日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 5407。实施例2、应用菌株Cm-J-R-2促进大花杓兰种子萌发滤纸选用Whatman公司生产的滤纸(直径为60mm ；Cat No. 1004090)，将圆形滤纸对切成两个半圆，高压灭菌备用。燕麦培养基称取2. 5g燕麦片，加1000ml蒸馏水，加热煮沸30分钟，纱布过滤冷却后用蒸馏水定容至1000ml，加入8g琼脂，调节pH值至6. 0，加热搅拌至琼脂溶解，分装灭
菌备用。一、接种大花杓兰种子1、大花杓兰种子的灭菌将自然成熟脱落的大花杓兰种子进行如下灭菌用质量百分含量为0.8% (0. 5-1. 0%均可)的次氯酸钠水溶液灭菌7分钟(5-8分钟均可)。2、在装有固体燕麦培养基的培养皿中平铺两张等大的半圆型无菌滤纸(两张滤纸中间具有间隔区域)。3、在无菌条件下，将灭菌后的大花杓兰种子接种于步骤2的滤纸上(每个半圆形滤纸约100粒，25°C暗培养2周(培养过程中需要确保没有杂菌污染)。二、回接菌株 Cm-J-R-21、将菌株Cm-J-R-2划线接种于PDA固体培养基，25°C暗培养M小时。2、将1块5mm*5mm大小的Cm-J-R-2菌块(从步骤1的培养基中取得菌块)接种于步骤一的培养皿的正中处，继续25°C暗培养。设置不加入上述菌块的平行处理，作为空白对照(CK)。三、种子萌发情况的观察接种菌块后每周观察一次萌发情况，约2个月后，观察到种子开始萌发，白色的原球茎突破种皮逐渐长大。自接种菌块开始计天数，第70天的照片见图3。在体式显微镜下观察，可见白色胚体已经完全脱离种皮形成原球茎，并且原球茎膨大，逐渐延长，即将开始根的分化。自接种菌块开始计天数，第70天的照片见图4。图4A 为空白对照组的照片，种子未萌发。图4B为实验组的照片，图4C和图4D为图;3B的局部放大图，新萌出的原球茎表面密布细长的真菌菌丝，有的表面菌丝较少(图4C)，有的表面菌丝密度更大(图4D)。形成原球茎的大花杓兰种子即为萌发的种子，自接种菌块开始计天数，第70天统计实验组和空白对照组的萌发率。进行四次重复试验，结果见表1和图5。表1大花杓兰种子与真菌共生的萌发率
权利要求
1.菌株(Epulorhizasp.) Cm-J-R-2，它的保藏编号为 CGMCC No. 5407。
2.保藏编号为CGMCCNo. 5407的菌株Cm-J-R-2在促进大花杓兰种子萌发中的应用,
全文摘要
本发明公开了一种促进大花杓兰种子萌发的真菌及其应用。本发明提供的菌株为菌株Cm-J-R-2，它的保藏编号为CGMCC No.5407。菌株Cm-J-R-2能很好的促进大花杓兰种子萌发。本发明对于大花杓兰的繁育具有重大价值。
文档编号C12N1/14GK102492628SQ20111040237
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者张毓, 赵世伟 申请人:北京市植物园