一种用于检测微量蛋白的实时“点亮”型荧光试剂的制作方法

本发明涉及一种检测蛋白的荧光试剂，特别涉及一种用于检测微量卵清白蛋白和h5n1血凝素蛋白的实时“点亮”型荧光试剂，属于荧光生物传感器领域。

背景技术：

卵清蛋白就是动物卵中的贮藏蛋白，是给发育中的胚胎提供氨基酸的。植物种子中也有许多贮藏蛋白，是种子萌发的养料来源，也是食物中重要的蛋白质来源。卵清蛋白是一种糖蛋白，含有微量的磷，是卵清中蛋白质的主要成分，约占65％。鸡的卵清蛋白分子量约4万5千，氨基末端是甘氨酸，但其氨基被乙酞化。在生物制品行业，通常被用来与小分子半抗原偶联，合成完全抗原，用于免疫动物或者包被酶标板。sugawara等报道了用电活性化合物标记的肽对卵清白蛋白的伏安法测定，检测限为2.3×10^-11mol/l，但是操作比较复杂。目前，中国药品生物制品检定所采用德国seramun试剂盒，但进口试剂盒价格昂贵，使常规应用受到限制。

禽流感(ai)是由a型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病。自1878年意大利首先发现至今，该病在全球范围暴发与流行。目前，高致病性禽流感(highlypathogenicavianinfluenza,hp：ai)己被国际兽疫局规定为a类传染病。近年来，hpai的暴发给养禽业造成巨大的经济损失，同时也严重威胁着人类的健康。病毒衣壳的识别蛋白血凝素(ha)与宿主细胞的糖缀合物之间的相互作用的特异性(选择性)也有助于病毒在人之间的气溶胶的有效扩散。因此，检测识别血凝素蛋白具有重要意义。cheng-yuli等人利用单个近红外纳秒脉冲激光器进行双光子激发基于双光子激发的光镊对于h5n1病毒基因序列的荧光检测，该方法对于血凝素蛋白(ha)的检测限为18pm。但是目前对于ha的检测方法操作都比较复杂，且成本高，因此对病毒的检测受到限制。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于检测微量蛋白的实时“点亮”型荧光试剂，所述荧光试剂可以定量检测卵清白蛋白以及h5n1血凝素蛋白的浓度，而且检测灵敏度高且非常快捷，检测成本低。

本发明的目的由以下技术方案实现：

一种用于检测微量蛋白的实时“点亮”型荧光试剂，所述荧光试剂由物质a、二甲基亚砜(dmso)和溶液b组成；

所述物质a为hpb-pf6、hpb-clo4或hpb-bf4，其结构式如下：

其中，x为f6^-、clo4^-或bf4^-；

所述溶液b为去离子水、磷酸盐缓冲液或生理盐水；

所述蛋白为卵清白蛋白或h5n1血凝素蛋白。

所述荧光试剂中，物质a的浓度为10^-6mol/l～10^-4mol/l；二甲基亚砜的体积与溶液b的体积比为1:99～1:9999。

所述荧光试剂适用于对浓度为0.5μg/ml～10μg/ml的卵清白蛋白以及浓度不大于1.67μg/ml的h5n1血凝素蛋白进行检测。

一种本发明所述的用于检测微量蛋白的实时“点亮”型荧光试剂的制备方法，所述方法步骤如下：

(1)将4,4'-((1e，1'e)-(((1e，3e)-1,2,3,4-四苯基丁-1,3-二烯(1,4-亚苯基))双(乙烯-1,2-二基)))双(n-甲基吡啶鎓)碘化物(hpb-pym)溶于乙腈中，再加入钾盐，0℃～30℃下反应1h～2h，进行后处理即得到物质a；

(2)将步骤1制备得到的物质a溶解于dmso中，再加入溶液b，混合均匀，得到所述荧光试剂。

所述钾盐为kpf6、kclo4或kbf4。

hpb-pym的摩尔数与钾盐的摩尔数比值大于2。

步骤(1)中，钾盐为kpf6或kclo4时，所述后处理即向反应溶液中加入过量水沉淀，固液分离后得到的固体物质即为hpb-pf6或hpb-clo4；钾盐为kbf4时，所述后处理即将反应溶液进行萃取并旋蒸，得到的固体物质即为hpb-bf4。

有益效果：

(1)本发明所述的荧光试剂能够对卵清白蛋白以及h5n1血凝素蛋白进行原位定量检测，具有实时“点亮”效果，且检测快速、灵敏度高；另外，所述荧光试剂能够实现对浓度在0.5μg/ml～10μg/ml范围内的卵清白蛋白以及浓度不大于1.67μg/ml的h5n1血凝素蛋白检测，而且在此范围内检测时，荧光强度增加倍数与被加入的卵清白蛋白以及h5n1血凝素蛋白的含量呈现非常好的线性关系，可作为标准工作曲线用于待测的卵清白蛋白以及h5n1血凝素蛋白。

(2)本发明所述的荧光试剂的制备工艺简单，易操作，成本低。

附图说明

图1为向实施例1制备的荧光试剂ⅰ中加入不同蛋白质后的荧光谱图的对比图。

图2为向实施例1中制备的荧光试剂ⅰ中加入不同氨基酸以及卵清白蛋白后的荧光谱图的对比图。

图3为向实施例1中制备的荧光试剂ⅰ中加入不同浓度卵清白蛋白后的荧光强度随时间变化曲线图。

图4为实施例1中制备的荧光试剂ⅰ在不同卵清白蛋白浓度下的荧光谱图。

图5为实施例1中荧光试剂ⅰ的荧光强度变化率随加入卵清白蛋白浓度的变化曲线及其拟合直线图。

图6为实施例1中荧光试剂ii的荧光强度变化率随加入卵清白蛋白浓度的变化曲线图。

图7为实施例1中荧光试剂ⅲ的荧光强度变化率随加入卵清白蛋白浓度的变化曲线图。

图8为向实施例2制备的荧光试剂ⅰ中加入不同蛋白质后的荧光谱图的对比图。

图9为向实施例2中制备的荧光试剂ⅰ中加入不同氨基酸以及卵清白蛋白后的荧光谱图的对比图。

图10为向实施例2中制备的荧光试剂ⅰ中加入不同浓度卵清白蛋白后的荧光强度随时间变化曲线图。

图11为实施例2中荧光试剂ⅰ的荧光强度变化率随加入卵清白蛋白浓度的变化曲线及其拟合直线图。

图12为实施例2中荧光试剂ii的荧光强度变化率随加入卵清白蛋白浓度的变化曲线图。

图13为实施例2中荧光试剂ⅲ的荧光强度变化率随加入卵清白蛋白浓度的变化曲线图。

图14为向实施例3制备的荧光试剂ⅰ中加入不同蛋白质后的荧光谱图的对比图。

图15为向实施例3中制备的荧光试剂ⅰ中加入不同氨基酸以及卵清白蛋白后的荧光谱图的对比图。

图16为向实施例3中制备的荧光试剂ⅰ中加入不同浓度卵清白蛋白后的荧光强度随时间变化曲线图。

图17为实施例3中荧光试剂ⅰ的荧光强度变化率随加入卵清白蛋白浓度的变化曲线及其拟合直线图。

图18为实施例3中荧光试剂ii的荧光强度变化率随加入卵清白蛋白浓度的变化曲线图。

图19为实施例3中荧光试剂ⅲ的荧光强度变化率随加入卵清白蛋白浓度的变化曲线图。

图20为实施例4中荧光试剂ⅰ的荧光强度变化率随加入h5n1血凝素蛋白浓度的变化曲线及其拟合直线图。

图21为向实施例4中制备的荧光试剂ⅰ中加入不同浓度h5n1血凝素蛋白后的荧光强度随时间变化曲线图。

图22为实施例中hpb-pym合成的路线图。

其中，i为加入生物分子后的荧光强度，i0为空白荧光试剂的荧光强度，i-i0/i0表示荧光强度增大倍数。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例来详述本发明，但不限于此。

以下实施例中：

所用试剂以及仪器的具体信息如表1和表2所示。

表1试剂信息

表2

实施例中所用hpb-pym的具体制备步骤如下：

(1)hpb-br的制备

将80ml异丙醇和水的混合物(v异丙醇:v水＝9:1)加入干燥的250ml圆底烧瓶中，然后在氮气氛下依次加入24mmol(4.82g)二苯基乙炔、20mmol(3.56g)4-溴苯基硼酸、24mmol(6.60g)碳酸银和0.50mmol(0.112g)醋酸钯，继续通氮气除氧，并在80℃下磁力搅拌3h，将圆底烧瓶中的反应混合物冷却至室温，通过过滤分离沉淀物后，通过旋转蒸发浓缩滤液，将旋蒸后所得粗产物通过硅胶柱色谱(二氯甲烷/石油醚，1:10)纯化，得到黄绿色固体状的hpb-br；

(2)hpb-py的制备

依次将3.00mmol(2.00g)hpb-br、9.02mmol(1ml)4-乙烯基吡啶、0.312mmol(0.067g)醋酸钯、1ml三乙胺、0.164mmol(0.05g)三(邻甲基苯基)磷和20ml色谱级n,n-二甲基甲酰胺加入圆底烧瓶中，然后将反应混合物冷冻-抽气-解冻脱气三次后，再在110℃下用磁力搅拌加热21h，将圆底烧瓶中的反应混合物冷却后再倒入水中，并用二氯甲烷萃取，萃取分离得到的有机相用硫酸镁干燥，过滤，并通过旋转蒸发浓缩，将旋蒸所得的粗产物通过柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚，1:4)纯化，得到纯的hpb-py黄棕色团固体；

(3)hpb-pym的制备

将2.79mmol(2.00g)hpb-py和9.96mmol(0.62ml)碘甲烷溶于二氯甲烷中并在室温下搅拌24h，然后向反应混合物中加入大量正己烷以沉淀产物，然后通过过滤收集所得沉淀，并用乙酸乙酯洗涤，将收集的产物在真空下干燥24h，得到纯的hpb-pym红色固体。

以下实施例中所述荧光强度的检测均检测3～5次，然后取平均值。

实施例1

(1)hpb-pf6的制备

先将100mg的hpb-pym溶解于5ml乙腈中，再加入1mlkpf6饱和水溶液，25℃下搅拌反应1h后，再向反应体系中加入150ml去离子水，并依次进行超声、抽滤，得到红色固体即为hpb-pf6。

采用核磁共振波谱仪和质谱仪对本实施例所制备的hpb-pf6进行表征，得到的核磁氢谱和质谱数据如下：

¹h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ(ppm)：8.813-8.830(d，4h)，8.137-8.154(d，4h)，7.843-7.884(d，2h)，7.469-7.489(d，4h)，7.376-7.416(d，2h)，7.144-7.236(d，10h)，6.844-7.013(m，14h)，4.235(s，6h)；

正离子模式：[c56h46n2]²⁺电喷雾电离质谱(m/z)，理论值：373.19，实测值：373.65；

负离子模式：[pf6]^-电喷雾电离质谱(m/z)，理论值：144.96，实测值：145.10；

根据氢谱和质谱的数据可知，本实施例所制备得到的红色固体是hpb-pf6。

(2)荧光试剂的制备

将本实施所制备的hpb-pf6溶解于dmso中，得到浓度为1×10^-2mol/l的溶液a；取30μl溶液a，加入2700μl的h2o，配成dmso的质量分数为1％、hpb-pf6的浓度为1×10^-4mol/l的溶液b；最后用h2o将溶液b稀释成dmso的质量分数为0.01％、hpb-pf6的浓度为1×10^-6mol/l的荧光试剂，记为荧光试剂ⅰ。

在上述荧光试剂ⅰ的制备过程中，将h2o分别替换为pbs(磷酸盐缓冲液)、ns(生理盐水)，其他条件不变，则在溶液pbs中制备的荧光试剂记为荧光试剂ii，在溶液ns中制备的荧光试剂记为荧光试剂ⅲ。

(3)特异性识别试验

取10份体积均为3ml的荧光试剂ⅰ，分别将卵清白蛋白、牛血清白蛋白、血红蛋白、胸苷、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白、伴刀豆凝集素a以及转铁蛋白加入荧光试剂ⅰ中，且每份荧光试剂ⅰ中加入一种体积为10μl、浓度为1mg/ml的蛋白质。用荧光分光光度计测量与不同蛋白质混合后的荧光试剂ⅰ的荧光信号(激发波长为422nm)，由图1可知，荧光试剂ⅰ对卵清白蛋白具有较好的点亮响应，而对其他蛋白质变化很弱。

(4)特异性识别试验

取21份体积均为3ml的荧光试剂ⅰ，分别将丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、组氨酸、色氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、酪氨酸以及半胱氨酸加入到20份不同的中荧光试剂ⅰ中，且每份荧光试剂ⅰ中加入的氨基酸的体积为50μl、浓度为10^-3mol/l；将6μl浓度为0.5mg/ml的卵清白蛋白加入另外一份荧光试剂ⅰ中。用荧光分光光度计测量加入卵清白蛋白以及不同氨基酸后荧光试剂ⅰ的荧光信号(激发波长为423nm)，由图2可知，荧光试剂ⅰ对卵清白蛋白具有特异性点亮响应，而对氨基酸均无明显变化，即卵清白蛋白及其他蛋白质水解后的游离氨基酸不会影响荧光试剂ⅰ对卵清白蛋白的检出效果。

(5)检出时间试验

将卵清白蛋白溶液稀释于水中，得到浓度为0.5mg/ml的卵清白蛋白溶液d；取3ml荧光试剂ⅰ，首先用荧光分光光度计测量空白荧光试剂ⅰ的荧光强度(激发波长为423nm)，然后向荧光试剂ⅰ中加入6μld溶液(此时混合溶液中卵清白蛋白的总浓度为1μg/ml)，并立刻测其荧光强度，5min后再用荧光分光光度计测量一次荧光强度；重复以上操作，每次向荧光试剂ⅰ中加入6μld溶液，直至加入到荧光试剂ⅰ中卵清白蛋白的总浓度为4μg/ml。由图3可知，荧光试剂ⅰ对于卵清白蛋白的检测非常快捷，在荧光试剂ⅰ与卵清白蛋白混合后立即测量的荧光强度与混合5min后测量的荧光强度几乎无差别，即荧光试剂ⅰ对卵清白蛋白的检出效果为即时响应。

(6)定量检测试验

取3ml荧光试剂ⅰ，每次向荧光试剂ⅰ中加入3μld溶液，直至加入到荧光试剂ⅰ中的卵清白蛋白的总浓度为5.0μg/ml，用荧光分光光度计测量空白荧光试剂ⅰ及每次加入卵清白蛋白后的荧光试剂ⅰ的荧光信号(激发波长为423nm)。由图4可知，随着卵清白蛋白浓度的增加，荧光试剂ⅰ的发光强度逐渐增加。

当荧光试剂ⅰ中加入的溶液d体积为3μl～30μl时，即荧光试剂ⅰ中卵清白蛋白的浓度为0.5μg/ml～5μg/ml时，由图5可知荧光试剂ⅰ的荧光强度变化率(ii-i0)/i0与溶液d的加入体积存在一定的线性关系，线性方程为：(ii-i0)/i0＝1.46028×x+0.24774，r²＝1；其中，i表示1-10的正整数，r表示线性相关度。

(7)使用不同溶液制得的荧光试剂对卵清白蛋白的检出效果试验

分别取3ml荧光试剂ⅰ、3ml荧光试剂ii和3ml荧光试剂ⅲ，分别向三种荧光试剂中分多次加入卵清白蛋白；其中，荧光试剂ⅰ中每次加入体积为3μl、浓度为0.5mg/ml的卵清白蛋白，荧光试剂ii中每次加入体积为9μl、浓度为0.5mg/ml的卵清白蛋白，荧光试剂ⅲ中每次加入体积为9μl、浓度为0.5mg/ml的卵清白蛋白。用荧光分光光度计测量三种空白荧光试剂以及每次加入卵清白蛋白后三种荧光试剂的荧光信号(激发波长为423nm)。由图5、6、7可知，随着卵清白蛋白浓度的增加，三种荧光试剂的发光强度都逐渐增加，即在dmso/h2o、dmso/pbs、dmso/ns不同溶解体系中，所制备的荧光试剂都能实现其对卵清白蛋白的检出功能。

实施例2

(1)hpb-clo4的制备

先将100mg的hpb-pym溶解于5ml乙腈中，再加入1mlkclo4饱和dmso溶液，5℃下反应2h后，再向反应体系中加入100ml去离子水，并依次进行超声、抽滤，得到红色固体即为hpb-clo4。

采用核磁共振波谱仪和质谱仪对本实施例所制备的hpb-clo4进行表征，得到的核磁氢谱和质谱数据如下：

¹h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ(ppm)：8.820-8.836(d，4h)，8.143-8.159(d，4h)，7.848-7.889(d，2h)，7.473-7.492(d，4h)，7.381-7.422(d,，2h)，7.150-7.239(d，10h)，6.846-7.018(m，14h)，4.240(s，6h)；

正离子模式：[c56h46n2]²⁺电喷雾电离质谱(m/z)，理论值：373.19，实测值：373.35；

负离子模式：[clo4]^-电喷雾电离质谱(m/z)，理论值：98.95，实测值：98.60；

根据氢谱和质谱的数据可知，本实施例所制备得到的红色固体是hpb-clo4。

(2)荧光试剂的制备

将本实施例所制备的hpb-clo4溶解于dmso中，得到浓度为1×10^-2mol/l的溶液a；取30μl溶液a，加入2700μl的h2o，配成dmso的质量分数为1％、hpb-clo4的浓度为1×10^-4mol/l的溶液b；最后用h2o将溶液b稀释成dmso的质量分数为0.01％、hpb-clo4的浓度为1×10^-6mol/l的荧光试剂，并记为荧光试剂ⅰ；

在上述荧光试剂ⅰ的制备过程中，将h2o分别替换为pbs、ns，其他条件不变，则在溶液pbs中制备的荧光试剂记为荧光试剂ii，在溶液ns中制备的荧光试剂记为荧光试剂ⅲ。

(3)特异性识别试验

取10份体积均为3ml的荧光试剂ⅰ，分别将卵清白蛋白、牛血清白蛋白、血红蛋白、胸苷、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白、伴刀豆凝集素a以及转铁蛋白加入荧光试剂ⅰ中，且每份荧光试剂ⅰ中加入一种体积为10μl、浓度为1mg/ml的蛋白质。用荧光分光光度计测量与不同蛋白质混合后的荧光试剂ⅰ的荧光信号(激发波长为422nm)，由图8可知，荧光试剂ⅰ对卵清白蛋白具有较好的点亮响应。

(4)特异性识别试验

取21份体积均为3ml的荧光试剂ⅰ，分别将丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、组氨酸、色氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、酪氨酸以及半胱氨酸加入到20份不同的中荧光试剂ⅰ中，且每份荧光试剂ⅰ中加入的氨基酸的体积为50μl、浓度为10^-3mol/l；将10μl浓度为1mg/ml的卵清白蛋白加入另外一份荧光试剂ⅰ中。用荧光分光光度计测量加入卵清白蛋白以及不同氨基酸后荧光试剂ⅰ的荧光信号(激发波长为423nm)，由图9可知，荧光试剂ⅰ对卵清白蛋白具有特异性点亮响应，而对氨基酸均无明显变化，即卵清白蛋白及其他蛋白质水解后的游离氨基酸不会影响荧光试剂ⅰ对卵清白蛋白的检出效果。

(5)检出时间试验

将卵清白蛋白溶液稀释于水中，得到浓度为1mg/ml的卵清白蛋白溶液d；取3ml荧光试剂ⅰ，首先用荧光分光光度计测量空白荧光试剂ⅰ的荧光强度(激发波长为423nm)，然后向荧光试剂ⅰ中加入3μld溶液(此时混合溶液中卵清白蛋白的总浓度为1μg/ml)，并立刻测其荧光强度，5min后再用荧光分光光度计测量一次荧光强度；重复以上操作，再依次向荧光试剂ⅰ中加入3μld溶液、4μld溶液。由图10可知，荧光试剂ⅰ对于卵清白蛋白的检测非常快捷，在荧光试剂ⅰ与卵清白蛋白混合后立即测量的荧光强度与混合5min后测量的荧光强度几乎无差别，即荧光试剂ⅰ对卵清白蛋白的检出效果为即时响应。

(6)定量检测试验

取3ml荧光试剂ⅰ，每次向荧光试剂ⅰ中加入3μld溶液，直至加入到荧光试剂ⅰ中的卵清白蛋白的总浓度为5.0μg/ml，用荧光分光光度计测量空白荧光试剂ⅰ及每次加入卵清白蛋白后的荧光试剂ⅰ的荧光信号(激发波长为423nm)。当荧光试剂ⅰ中加入的溶液d体积为3μl～30μl时，即荧光试剂ⅰ中卵清白蛋白的浓度为0.5μg/ml～5μg/ml时，由图11可知，荧光试剂ⅰ的荧光强度变化率(ii-i0)/i0与溶液d的加入体积存在一定的线性关系，线性方程为：(ii-i0)/i0＝2.55746×x+0.40137，r²＝0.9977；其中，i表示1-10的正整数，r表示线性相关度。

(7)使用不同溶液制得的荧光试剂对卵清白蛋白的检出效果试验

分别取3ml荧光试剂ⅰ、3ml荧光试剂ii和3ml荧光试剂ⅲ，分别向三种荧光试剂中分多次加入卵清白蛋白；其中，荧光试剂ⅰ中每次加入体积为3μl、浓度为0.5mg/ml的卵清白蛋白，荧光试剂ii中每次加入体积为5μl、浓度为0.5mg/ml的卵清白蛋白，荧光试剂ⅲ中每次加入体积为5μl、浓度为0.5mg/ml的卵清白蛋白。用荧光分光光度计测量三种空白荧光试剂以及每次加入卵清白蛋白后三种荧光试剂的荧光信号(激发波长为423nm)。由图11、12、13可知，随着血清白蛋白浓度的增加，三种荧光试剂的发光强度都逐渐增加，即在dmso/h2o、dmso/pbs、dmso/ns不同溶解体系中，所制备的荧光试剂都能实现其对卵清白蛋白的检出功能。

实施例3

(1)hpb-bf4的制备

先将100mg的hpb-pym溶解于5ml乙腈中，再加入1mlkbf4饱和水溶液，15℃下搅拌反应1.5h后，用二氯和水萃取反应溶液，并将萃取得到的有机相进行旋蒸，得到的红色固体即为hpb-bf4。

采用核磁共振波谱仪和质谱仪对本实施例所制备的hpb-bf4进行表征，得到的核磁氢谱和质谱数据如下：

¹h-nmr(400mhz，dmso-d6)δ(ppm)：8.824-8.840(d，4h)，8.145-8.161(d，4h)，7.850-7.891(d，2h)，7.472-7.492(d，4h)，7.382-7.423(d，2h)，7.149-7.238(d，10h)，6.843-7.017(m，14h)，4.241(s，6h)；

正离子模式：[c56h46n2]²⁺电喷雾电离质谱(m/z)，理论值：373.19；实测值：373.25；

负离子模式：[bf4]^-电喷雾电离质谱(m/z)，理论值：87.00；实测值：86.90；

根据氢谱和质谱的数据可知，本实施例所制备得到的红色固体是hpb-bf4。

(2)荧光试剂的制备

将本实施例所制备的hpb-bf4溶解于dmso中，得到浓度为1×10^-2mol/l的溶液a；取30μl溶液a，加入2700μl的h2o，配成dmso的质量分数为1％、hpb-bf4的浓度为1×10^-4mol/l的溶液b；最后用h2o将溶液b稀释成dmso的质量分数为0.01％、hpb-clo4的浓度为1×10^-6mol/l的荧光试剂，记为荧光试剂ⅰ。

在上述荧光试剂ⅰ的制备过程中，将h2o分别替换为pbs、ns，其他条件不变，则在溶液pbs中制备的荧光试剂记为荧光试剂ii，在溶液ns中制备的荧光试剂记为荧光试剂ⅲ。

(3)特异性识别试验

取10份体积均为3ml的荧光试剂ⅰ，分别将卵清白蛋白、牛血清白蛋白、血红蛋白、胸苷、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白、伴刀豆凝集素a以及转铁蛋白加入荧光试剂ⅰ中，且每份荧光试剂ⅰ中加入一种体积为10μl、浓度为1mg/ml的蛋白质。用荧光分光光度计测量与不同蛋白质混合后的荧光试剂ⅰ的荧光信号(激发波长为422nm)，由图14可知，荧光试剂ⅰ对卵清白蛋白具有较好的点亮响应。

(4)特异性识别试验

取21份体积均为3ml的荧光试剂ⅰ，分别将丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、组氨酸、色氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、酪氨酸以及半胱氨酸加入到20份不同的中荧光试剂ⅰ中，且每份荧光试剂ⅰ中加入的氨基酸的体积为50μl、浓度为10^-3mol/l；将10μl浓度为1mg/ml的卵清白蛋白加入另外一份荧光试剂ⅰ中。用荧光分光光度计测量加入卵清白蛋白以及不同氨基酸后荧光试剂ⅰ的荧光信号(激发波长为423nm)，由图15可知，荧光试剂ⅰ对卵清白蛋白具有特异性点亮响应，而对氨基酸均无明显变化，即卵清白蛋白及其他蛋白质水解后的游离氨基酸不会影响荧光试剂ⅰ对卵清白蛋白的检出效果。

(5)检出时间试验

将卵清白蛋白溶液稀释于水中，得到浓度为1mg/ml的卵清白蛋白溶液d；取3ml荧光试剂ⅰ，首先用荧光分光光度计测量空白荧光试剂ⅰ的荧光强度(激发波长为423nm)，然后向荧光试剂ⅰ中加入3μld溶液(此时混合溶液中卵清白蛋白的总浓度为1μg/ml)，并立刻测其荧光强度，5min后再用荧光分光光度计测量一次荧光强度；重复以上操作，再依次向荧光试剂ⅰ中加入3μld溶液、4μld溶液。由图16可知，荧光试剂ⅰ对于卵清白蛋白的检测非常快捷，在荧光试剂ⅰ与卵清白蛋白混合后立即测量的荧光强度与混合5min后测量的荧光强度几乎无差别，即荧光试剂ⅰ对卵清白蛋白的检出效果为即时响应。

(6)定量检测试验

将卵清白蛋白溶液稀释于水中，得到浓度为0.5mg/ml的卵清白蛋白溶液e；取3ml荧光试剂ⅰ，每次加入6μle溶液，直至加入到荧光试剂ⅰ中的卵清白蛋白的总浓度为10μg/ml，用荧光分光光度计测量空白荧光试剂ⅰ及每次加入卵清白蛋白后的荧光试剂ⅰ的荧光信号(激发波长为423nm)。当荧光试剂ⅰ中加入的溶液e体积为6μl～60μl时，即荧光试剂ⅰ中卵清白蛋白的浓度为1μg/ml～10μg/ml时，由图17可知，荧光试剂ⅰ的荧光强度变化率(ii-i0)/i0与溶液d的加入体积存在一定的线性关系，线性方程为：(ii-i0)/i0＝0.15575×x+0.06568，r²＝0.99843；其中，i表示1-10的正整数，r表示线性相关度。

(7)使用不同溶液制得的荧光试剂对卵清白蛋白的检出效果试验

分别取3ml荧光试剂ⅰ、3ml荧光试剂ii和3ml荧光试剂ⅲ，分别向三种荧光试剂中分多次加入卵清白蛋白；其中，荧光试剂ⅰ中每次加入体积为6μl、浓度为0.5mg/ml的卵清白蛋白，荧光试剂ii中每次加入体积为6μl、浓度为0.5mg/ml的卵清白蛋白，荧光试剂ⅲ中每次加入体积为9μl、浓度为1mg/ml的卵清白蛋白。用荧光分光光度计测量三种空白荧光试剂以及每次加入卵清白蛋白后三种荧光试剂的荧光信号(激发波长为423nm)。由图17、18、19可知，随着卵清白蛋白浓度的增加，三种荧光试剂的发光强度都逐渐增加，即在dmso/h2o、dmso/pbs、dmso/ns不同溶解体系中，所制备的荧光试剂都能实现其对卵清白蛋白的检出功能，但是其在pbs和ns中误差比较大，检测效果不如hpb-pf6荧光试剂和hpb-clo4荧光试剂。

实施例4

采用实施例1所制备的荧光试剂ⅰ对h5n1血凝素蛋白进行性能表征：

(1)检出时间试验

将h5n1血凝素蛋白稀释于水中，得到浓度为0.25mg/ml的卵清白蛋白溶液d；取3ml荧光试剂ⅰ，首先用荧光分光光度计测量空白荧光试剂ⅰ的荧光强度(激发波长为423nm)，然后向荧光试剂ⅰ中加入4μld溶液(此时混合溶液中h5n1血凝素蛋白的总浓度为1/3μg/ml)，并立刻测其荧光强度，1min后再用荧光分光光度计测量一次荧光强度；重复以上操作，每次向荧光试剂ⅰ中加入4μld溶液，直至加入到荧光试剂ⅰ中h5n1血凝素蛋白的总浓度为5/3μg/ml。由图21可知，荧光试剂ⅰ对h5n1血凝素蛋白的检测非常快捷，在荧光试剂ⅰ与h5n1血凝素蛋白混合后立即测量的荧光强度与混合1min后测量的荧光强度几乎无差别，即荧光试剂ⅰ对h5n1血凝素蛋白的检出效果为即时响应。

(2)定量检测试验

取3ml荧光试剂ⅰ，每次向荧光试剂ⅰ中加入4μld溶液，直至加入到荧光试剂ⅰ中的h5n1血凝素蛋白的总浓度为5/3μg/ml，用荧光分光光度计测量空白荧光试剂ⅰ及每次加入h5n1血凝素蛋白后的荧光试剂ⅰ的荧光信号(激发波长为423nm)。又检测结果可知，随着h5n1血凝素蛋白浓度的增加，荧光试剂ⅰ的发光强度逐渐增加。

当荧光试剂ⅰ中加入的溶液d体积为4μl～20μl时，即荧光试剂ⅰ中h5n1血凝素蛋白的浓度为1/3μg/ml～5/3μg/ml时，由图20可知荧光试剂ⅰ的荧光强度变化率(ii-i0)/i0与溶液d的加入体积存在一定的线性关系，线性方程为：(ii-i0)/i0＝2.12171×x+0.01947，r²＝0.9997；其中，i表示1-5的正整数，r表示线性相关度。

本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明精神的原则之下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。