专利名称:尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条，包括底板、样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述试纸条由样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次搭接粘贴在底板上构成。所述荧光标记物结合垫含有链霉亲和素标记荧光蛋白和生物素标记的尿微量白蛋白单克隆抗体；所述硝酸纤维膜上有检测线和质控线。本实用新型与目前常见的检测尿微量白蛋白的方法相比(如：化学发光法/免疫增强比浊法/胶体金法)，不仅大大缩短了检测时间，同时还提高了检测灵敏度。
【专利说明】尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条
【技术领域】
[0001]本实用新型属于免疫检测领域，具体涉及一种高灵敏度尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条。
【背景技术】
[0002]白蛋白(albumin，简称ALB)是一种血液中的正常蛋白质，人体代谢正常情况下，尿中的ALB极少，具体到每升尿ALB不超过20mg( < 20mg/L)，所以叫微量ALB。尿微量△1^(1!^(^0&113111^11，简称嫩1^)是糖尿病肾病、高血压肾病等的早期肾脏受损的表征。微量白蛋白尿也是整个血管系统改变的征象，并可认为是动脉病变的“窗口”，因为它是肾脏和心血管系统改变的早期指征。
[0003]临床中，通常应用MALB指标来监测肾病的发生，MALB的检测是早期发现肾病最敏感、最可靠的诊断指标。正常情况下，尿液中ALB含量低于20mg/L ;尿液中ALB浓度达到20mg/L-200mg/L时，可诊断为微量白蛋白尿，在此阶段的肾早期损害通过规范治疗尚可逆转，及早发现，能防止不可逆转的肾功能衰竭的发生；高于200mg/L时，则应该警惕了，此时证明体内又大量白蛋白漏出，可能出现低蛋白血症，肾病发展离不可逆期只有一步之遥，如果不及时进行医治，就会进入尿毒症期。通过MALB的数值，结合发病情况、症状以及病史陈述就可以较为准确的诊断病情，判断病情进入了纤维化那个阶段。
[0004]尿微量白蛋白测定的应用被称为80年代对糖尿病学的两大贡献之一。微量白蛋白测定不仅对糖尿病肾病的早期诊断和改善预后具有划时代的意义，而且对高血压肾病，子痫及各种毒性物质所致的肾损伤都具有重要的诊断价值。
[0005]目前检测MALB的常用方法一般有定性和定量两种。酶联吸附法、放射免疫法、乳胶凝集试验和免疫层析法等为常用检测方法，以酶联吸附法、放射免疫法、化学发光免疫法较为敏感，但乳胶凝集试验和免疫层析法在检测快捷性上更具有优势，近年来快速定量检测成为新的研宄开发热点。
[0006]生物素-亲和素系统(b1tinavidin system，BAS)，是一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。将该系统应用于免疫组化，酶联免疫，荧光免疫，放射免疫等检测技术中，可显著地提高以上技术方法的敏感性、特异性和稳定性，使方法更简便，有助于临床快速诊断，并利于进行大规模流行病学调查，成为研宄免疫反应的有力工具。由于BAS检测系统经济快速，又无放射物质污染，不需复杂仪器，充分显示了此系统的巨大潜力和应用的可能性。
[0007]生物素-亲和素系统检测原理:BAS是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素与亲和素间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。链霉亲和素是与亲和素有相似生物学特性的一种蛋白质，链霉亲和素与亲和素一样分子中每条肽链都能结合一个生物素，因几乎所有用于标记的物质均可以同亲和素或链霉亲合素结合。利用生物素-亲和素系统研制尿微量白蛋白检测试快速诊断试剂尚无报道。
实用新型内容
[0008]本实用新型的目的，在于提供一种尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条，其基于双抗体夹心法、荧光免疫侧向层析和生物素-链霉亲和素放大系统，提供高灵敏度尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条。使用本实用新型时，提高了检测灵敏度和检测稳定性，降低了非特异性结合，检测时间不大于10分钟，大大提高了诊断效率。
[0009]本实用新型解决其技术问题的解决方案是:尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条，其包括底板，所述底板上依次设有样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述吸水垫和荧光标记物结合垫分别交叠压在硝酸纤维素膜的两端后在硝酸纤维素膜的表面形成检测区，所述样品垫交叠压在荧光标记物结合垫上，所述荧光标记物结合垫上固定有生物素标记的尿微量白蛋白单克隆抗体和链霉亲和素标记的荧光蛋白；所述检测区内的硝酸纤维素膜上固定有识别尿微量白蛋白另外一个表位的单克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线。
[0010]作为上述技术方案的进一步改进，所述荧光标记物结合垫包括层叠的第一荧光标记物结合垫和第二荧光标记物结合垫，所述第一荧光标记物结合垫的一端垫在样品垫的下方，所述第二荧光标记物结合垫交叠压在硝酸纤维素膜的一端。
[0011]作为上述技术方案的进一步改进，所述第一荧光标记物结合垫中插入样品垫下方的一端设有定位条，所述样品垫的下端面设有能容纳定位条的定位槽。
[0012]作为上述技术方案的进一步改进，还包括卡壳，所述底板、样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫均置于卡壳内，所述卡壳壳面上对应于硝酸纤维膜的位置设有观察窗，卡壳壳面上对应于样品垫的位置设有加样孔。
[0013]作为上述技术方案的进一步改进，所述观察窗为长方形孔。
[0014]作为上述技术方案的进一步改进，所述荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白、藻胆蛋白中的一种。
[0015]作为上述技术方案的进一步改进，所述样品垫为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件。
[0016]作为上述技术方案的进一步改进，所述底板为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件。
[0017]作为上述技术方案的进一步改进，所述卡壳包括塑料上壳和塑料下壳，所述塑料上壳扣合塑料下壳上后形成卡壳。
[0018]本实用新型与现有技术相比，具有如下优点:
[0019](I)本实用新型将荧光蛋白作为标记物，此标记物稳定性良好，有利于提高检测稳定性。
[0020](2)本实用新型通过利用“链霉亲和素-生物素放大系统”，提高检测灵敏度，降低非特异性结合，有利于提高试剂盒性能。
[0021](3)利用本实用新型进行降钙素原的检测时间不大于10分钟，检测线性范围为
0.10ng/ml?100.00ng/ml，极大地提高了检测效率。
[0022](4)本实用新型可通过荧光免疫分析仪对结果进行判读，可实现自动化，减少主观因素的影响，提供便利、快速、可靠的诊断结果。
[0023](5)本使用新型卡壳设有样品进入的加样孔和供观测结果的观察窗，根据分析仪器判定结果，准确可靠。
[0024](6)本实用新型制作方便，体积小、便于携带。
[0025](7)本实用新型检测成本较低。
[0026](8)本实用新型可批量生产，适用于临床快速诊断和现场快速诊断；易于保存，有利于基层单位推广。
【附图说明】
[0027]为了更清楚地说明本实用新型实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单说明。显然，所描述的附图只是本实用新型的一部分实施例，而不是全部实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他设计方案和附图。
[0028]图1是本实用新型实施例一的结构示意图；
[0029]图2是本实用新型实施例二的结构示意图；
[0030]图3是本实用新型实施例三的结构示意图；
[0031]图4是本实用新型实施例四的结构示意图。
【具体实施方式】
[0032]以下将结合实施例和附图对本实用新型的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本实用新型的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本实用新型的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本实用新型的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本实用新型保护的范围。另外，文中所提到的所有联接/连接关系，并非单指构件直接相接，而是指可根据具体实施情况，通过添加或减少联接辅件，来组成更优的联接结构。
[0033]参照图1，尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条，其包括底板5，所述底板5上依次设有样品垫1、荧光标记物结合垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4，所述吸水垫4和荧光标记物结合垫2分别交叠压在硝酸纤维素膜3的两端后在硝酸纤维素膜3的表面形成检测区，荧光标记物结合垫2为玻璃纤维膜，所述样品垫I交叠压在荧光标记物结合垫2上，所述荧光标记物结合垫2上固定有生物素标记的尿微量白蛋白单克隆抗体(浓度0.3?
1.5mg/mL)和链霉亲和素标记(或亲和素)的荧光蛋白(使用激发光波长530nm，发射光波长570nm，浓度0.1?1.0mg/mL);所述检测区内的硝酸纤维素膜3上固定有识别尿微量白蛋白另外一个表位的单克隆抗体构成的检测线T(浓度0.5?3mg/mL)和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线C(浓度0.2?2.0mg/mL)，质控线C用于检测试纸条的有效性。
[0034]将生物素标记的尿微量白蛋白单克隆抗体和链霉亲和素(或亲和素)标记的荧光蛋白固定在荧光标记物结合垫2上，将有识别MALB另外一个表位的单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体固定于硝酸纤维素膜上分别作为检测线T和质控线C。当待测样品加到样品垫I上后，通过层析作用向前移动，样品中尿微量白蛋白与荧光标记物结合垫2上结合荧光标记物(荧光蛋白)的尿微量白蛋白抗体(Mab-MALB*Fluoro)反应形成复合物MALB-Mab-MALB*Fluoro，在层析作用下反应复合物继续向前移动经过硝酸纤维膜上包被的MALB抗体(检测线)时，反应复合物被包被的MALB抗体捕获形成复合物(Mab-MALB-MALB-Mab-MALB^Fluoro)(检测线)，通过荧光免疫分析仪读取检测线的反应信号，在激发光源的作用下，荧光物质发射特定波长的荧光信号，荧光免疫分析仪俘获荧光信号，通过信号转化及设定的标准曲线自动转化为定量数值，计算出样本中尿微量白蛋白的浓度，得到尿微量白蛋白检测结果。
[0035]作为上述技术方案的进一步改进，参照图3，所述荧光标记物结合垫2包括层叠的第一荧光标记物结合垫20和第二荧光标记物结合垫21，所述第一荧光标记物结合垫20的一端垫在样品垫I的下方，所述第二荧光标记物结合垫21交叠压在硝酸纤维素膜3的一端。荧光标记物结合垫2的分层设置，便于将荧光标记物结合垫2安装在样品垫I和硝酸纤维素膜3之间。
[0036]作为上述技术方案的进一步改进，参照图3所述第一荧光标记物结合垫20中插入样品垫下方的一端设有定位条22，所述样品垫I的下端面设有能容纳定位条22的定位槽。通过定位条22便于荧光标记物结合垫2和样品垫I之间的安装固定。
[0037]作为上述技术方案的进一步改进，参照图2和图4，还包括卡壳，所述底板5、样品垫1、荧光标记物结合垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4均置于卡壳6内，所述卡壳6壳面上对应于硝酸纤维膜3的位置设有观察窗8，卡壳6壳面上对应于样品垫I的位置设有加样孔?。
[0038]作为上述技术方案的进一步改进，所述观察窗8为长方形孔。
[0039]作为上述技术方案的进一步改进，所述荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白、藻胆蛋白中的一种。
[0040]作为上述技术方案的进一步改进，所述样品垫I为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件。样品垫由玻璃纤维构成，经表面活性剂缓冲液浸泡处理，干燥后使用。所述样品垫I的裁剪宽度为0.3?0.5cm。
[0041]作为上述技术方案的进一步改进，所述底板5为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件。
[0042]作为上述技术方案的进一步改进，所述卡壳6包括塑料上壳60和塑料下壳61，所述塑料上壳61扣合塑料下壳61上后形成卡壳6。
[0043]以上是对本实用新型的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本实用新型精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【权利要求】
1.尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条，其特征在于:其包括底板，所述底板上依次设有样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述吸水垫和荧光标记物结合垫分别交叠压在硝酸纤维素膜的两端后在硝酸纤维素膜的表面形成检测区，所述样品垫交叠压在荧光标记物结合垫上，所述荧光标记物结合垫上固定有生物素标记的尿微量白蛋白单克隆抗体和链霉亲和素标记的荧光蛋白；所述检测区内的硝酸纤维素膜上固定有识别尿微量白蛋白另外一个表位的单克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线。2.根据权利要求1所述的尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条，其特征在于:所述荧光标记物结合垫包括层叠的第一荧光标记物结合垫和第二荧光标记物结合垫，所述第一荧光标记物结合垫的一端垫在样品垫的下方，所述第二荧光标记物结合垫交叠压在硝酸纤维素膜的一端。3.根据权利要求2所述的尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条，其特征在于:所述第一荧光标记物结合垫中插入样品垫下方的一端设有定位条，所述样品垫的下端面设有能容纳定位条的定位槽。4.根据权利要求1至3任一项所述的尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条，其特征在于:还包括卡壳，所述底板、样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫均置于卡壳内，所述卡壳壳面上对应于硝酸纤维膜的位置设有观察窗，卡壳壳面上对应于样品垫的位置设有加样孔。5.根据权利要求4所述的尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条，其特征在于:所述观察窗为长方形孔。6.根据权利要求4所述的尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条，其特征在于:所述荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白、藻胆蛋白中的一种。7.根据权利要求4所述的尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条，其特征在于:所述样品垫为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件。8.根据权利要求4所述的尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条，其特征在于:所述底板为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件。9.根据权利要求4所述的尿微量白蛋白免疫层析定量检测试纸条，其特征在于:所述卡壳包括塑料上壳和塑料下壳，所述塑料上壳扣合塑料下壳上后形成卡壳。
【文档编号】G01N33-558GK204287200SQ201420648355
【发明者】叶静姝, 陈泳钗, 王小明, 夏坤, 佟顺刚 [申请人]广州天宝颂原生物科技开发有限公司