一种提取梨花粉管液泡的方法
【专利摘要】本发明公开了一种分离纯化梨花粉管液泡的方法，主要包括花粉采集、花粉培养、原生质体释放、原生质体纯化、液泡分离、液泡纯化等步骤。该方法用中性红2次染色方法可在光学显微镜下清楚地区分花粉粒、液泡、原生质体和水泡。本发明的优点在于：提取方法快速、简单，液泡膜表面光滑，污染程度小，所需材料和药品极少，不仅可以应用于膜片钳研究，还可以进一步应用于液泡蛋白质组学研究。
【专利说明】 一种提取梨花粉管液泡的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物细胞生物学【技术领域】，具体地说属于一种从梨花粉管中提取纯化液泡的方法。
【背景技术】
[0002]植物液泡是植物细胞中特有的大型细胞器，在保持和调节细胞渗透压，储存和转运各种离子、营养物质和代谢中间物中有重要作用，同时还具有与溶酶体类似的功能，清除有害物质和对抗逆性进行调节。花粉液泡在花粉的形成、萌发和花粉管生长中起着重要的作用，但由于花粉液泡提取的困难，目前关于液泡在花粉萌发和花粉管生长中的作用的研究较少。
[0003]植物液泡上有许多离子通道，参与许多生理过程，花粉管液泡离子通道在花粉的成熟和生长及维持胞内环境的稳定中发挥着巨大的作用。目前主要通过膜片钳技术研究液泡离子通道的功能，应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性、同时可发现新的离子通道及亚型，并能在记录单细胞电流和全细胞电流的基础上进一步计算出细胞膜上的通道数和开放概率，还可以用以研究某些胞内或胞外物质对离子通道开闭及通道电流的影响等。同时结合分子克隆和定点突变技术，膜片钳技术可用于离子通道分子结构与生物学功能关系的研究，了解细胞信号的跨膜转导和细胞分泌机制。因此分离纯化出花粉管完整的液泡是膜片钳技术研究的前提，更是研究花粉管液泡离子通道的作用的基础。
[0004]植物成熟液泡分离主要是指中央液泡的分离。液泡在植物细胞中虽然位置显著、发现早，但其分离技术远不如叶绿体、线粒体、细胞核等细胞器的技术成熟。目前植物液泡分离制备主要有原生质体裂解、多元碱化合物诱导、机械破碎等基本方法。 申请人:在试验过程中发现，由于不同植物细胞的细胞结构差异及液泡膜结构的稳定性不同等问题，已有方法在梨花粉管液泡提取中均存在不足，不能达到预期效果。
[0005]1、原生质体渗透裂解:此种方法对植物材料有较高要求,对原生质体的数量和质量都要求较高，目前主要在叶片、花瓣和茎的幼嫩组织中进行。由于不同植物细胞的结构和渗透压的差异，提取的方法差异较大，目前已经报道的关于叶片等材料液泡提取的方法在花粉管液泡的提取中未见成功报道。虽然对于景天科植物叶片细胞液泡的提取已有相关报道(一种提取景天科植物细胞液泡的方法，CN 103589678 A)，但由于花粉材料的特殊性，该方法在叶片原生质体的提取过程中采用的方法完全不适合梨花粉管，采用其方法几乎不能获得花粉管原生质体。在梨花粉管液泡的纯化过程中，采用其方法在10% Ficoll表面发现较少的液泡和较多的花粉粒，可能由于材料的差异和离心速度不够导致分离纯化不完全。
[0006]2、多元碱化合物诱导:此种方法易对液泡膜造成伤害。
[0007]3、机械破碎:虽然不通过原生质体，直接由剪切后的薄片组织在质壁分离介质中释放液泡，但是此种方法需要大量的材料，对于取材难度较大的梨花粉不宜应用。
[0008]因此，建立一套快速有效的梨花粉管液泡提取纯化技术对于研究梨花粉管生长代谢及应用膜片钳技术研究花粉管液泡的离子通道具有重要的意义。
【发明内容】
[0009]本发明的发明目的是针对现有技术的上述不足，提供一种梨花粉管液泡分离纯化方法。
[0010]本发明的目的可通过以下技术方案实现:
[0011]一种提取梨花粉管液泡的方法，该方法包括以下步骤:
[0012]I)花粉培养:分离干燥花药中的花粉，将其加入到花粉培养基中，加入0.005%的中性红染料，避光条件下，23?27°C，140?200rpm，培养3?4小时；
[0013]2)原生质体的释放:将培养好的花粉与胞外液按照1:2?5的体积比混合，加入0.5?1.5%的纤维素酶、0.5?1.5%的离析酶，23?27°C，黑暗条件下，60?80rpm，反应10?15分钟；
[0014]3)原生质体的纯化:将上一步所得含原生质体的液体通过200-250目的细胞筛以去除未酶解的花粉管，滤液加入到离心管中，静置2-5分钟后吸取上清，上清液离心，去除上清液，再用胞外液清洗以去除酶的残留和花粉管酶解碎片，所得沉淀为花粉管原生质体；
[0015]4)液泡的分离:将液泡溶解缓冲液加入到上一步获得的原生质体中，用移液枪吸打3-5次，静置5-10分钟，观察液泡出现情况；
[0016]5)液泡的纯化:将出现液泡的缓冲液转移到Ficol 1-400密度梯度工作液顶部离心，在25000?28000rpm、8?I (TC下离心15-30分钟；离心后，Ficoll-400密度梯度工作液12-15%%浓度顶部淡红色的一层为液泡，将其吸出，显微镜下观察，淡红色、透明的为所述的梨花粉管液泡。
[0017]本发明所述的提取梨花粉管液泡的方法，优选包括以下步骤:
[0018]I)花粉采集:采集大蕾期花药，干燥；干燥硅胶阴干，零下80度保存可存放2-3年；
[0019]2)花粉培养:分离干燥花药中的花粉，将其加入到花粉培养基中，加入0.005%的中性红染料，避光条件下，23?27°C，140?200rpm，培养3?4小时；
[0020]3)原生质体的释放:将培养好的花粉与胞外液按照1:3的体积比例混合，加入I %的纤维素酶、I %的离析酶，23?27°C，黑暗条件下，60?80rpm，反应10?15分钟；
[0021]4)原生质体的纯化:将步骤3)所述液体通过200-250目的细胞筛以去除未酶解的花粉管，重复3次,滤液加入到离心管中，静置2-3分钟后吸取上清,上清液在lOOXg、10°C下离心10分钟，去除上清液，再用胞外液清洗3次以去除酶的残留和花粉管酶解碎片，所得沉淀为花粉管原生质体；
[0022]5)液泡的分离:将液泡溶解缓冲液加入到步骤4)获得的原生质体中，用移液枪吸打3-5次，静置5-10分钟，显微镜下观察液泡出现情况；
[0023]6)液泡的纯化:将出现液泡的缓冲液转移到Ficoll-400密度梯度工作液顶部离心，在26000rpm(100000Xg) 10°C下离心15-30分钟；离心后，Ficoll-400密度梯度工作液12-15%浓度顶部淡红色的一层为液泡，用剪过的移液枪头吸出，显微镜下观察，淡红色、透明的为液泡。
[0024]其中，所述的花粉培养基配方为:100g/L蔗糖，0.3g/L Ca (N03) 2.4H20, 30mM|^5((1-磺基甲脂磺酸钠)，0.lg/L硼酸溶于蒸馏水中并定容，用Tris碱(三羟甲基氨基甲烷)调整pH值至5.9?6.4。
[0025]所述的胞外液配方为:100mM葡萄糖，1mM CaCl2, 5mM MES( α -磺基甲脂磺酸钠)，0.8-1Μ山梨醇，用Tris (三羟甲基氨基甲烷)将pH调至5.5?6.0。
[0026]液泡溶解液配方为:0.3-0.35M山梨醇，2_4mM EDTA (乙二胺四乙酸)，2_5mM DTT和0.005%的中性红，用Tris (三羟甲基氨基甲烷)将pH调至7.5?8.0。
[0027]Ficoll-400密度梯度工作液的配方为:Ficoll-400密度梯度(质量体积比浓度)工作液的配方为:12ml Ficoll-400密度梯度工作液包含2?4% (g/100ml)、6?8%(g/100ml)及12?15% (g/100ml)三个梯度浓度各4ml，分别将Ficoll 400溶于pH 7.5?8.0的含0.5M的山梨醇，5mM CaCl2和25mM Tris-HCl缓冲液中配成要求的浓度。
[0028]Ficoll-400密度梯度工作液的配方为=Ficol 1-400密度梯度(质量体积比浓度)工作液的配方优选:12ml Ficoll-400密度梯度工作液包含3% (g/100ml),8% (g/100ml)及13% (g/100ml)三个梯度浓度各4ml，分别将Ficoll 400溶于含0.5M的山梨醇，，5mMCaCl2和25mM Tris-HCl缓冲液中(pH 7.5?8.0,10°C )配成需要的浓度。
[0029]提取花粉管液泡的关键是将其从细胞中释放出来并能识别，然后进行提纯。本发明采用了酶解法获得原生质体并调节渗透压破坏质膜获得液泡，用中性红染色方法在光学显微镜下清楚地区分花粉粒、液泡、原生质体和水泡。并通过梯度及Ficoll-400密度离心得到质量较高的梨花粉管液泡。
[0030]由于花粉与叶片的结构差异，使得花粉管原生质体中易混合酶解后的花粉粒，因此减少花粉的污染获得纯度较高的原生质体对技术方案的效果影响较大。用细胞筛多次过滤的目的是为了去除未被酶解的花粉管，此方法比用纱布过滤损失的原生质体少很多，之后静置及用胞外液清洗不但可以去除酶污染还可以减少酶解产生的碎片和花粉粒。本发明在花粉管萌发前就加入中性红染色，此方法对花粉的萌发和生长都无影响，而且比酶解后加入同样浓度的中性红有利于花粉管中液泡的染色，而且有利于Ficoll-400密度梯度分层时区分液泡层和花粉粒层，花粉粒颜色较深。
[0031]本发明的有益效果
[0032](I)该发明采用酶解法获得原生质体并调节渗透压破坏质膜获得液泡，在酶解前加入中性红有利于花粉管酶解过程中液泡的染色(图2)，两次使用中性红有利于液泡的染色并使花粉粒颜色较深。在光学显微镜下可以清楚地区分花粉粒、液泡、原生质体和水泡，为后续实验操作区分液泡提供帮助。这种液泡提取方法具有方便、快速、简单的特点。
[0033](2)该方法采用中性红染色方法配合Ficoll-400密度梯度离心技术纯化梨花粉管液泡。此方法对细胞无毒害，容易区分液泡层。而且由于花粉材料的特殊性，花粉管酶解后获得的原生质体中混合较多的花粉粒和花粉管酶解后的碎片，采用多个密度梯度易于去除碎片和花粉粒的污染，得到较高纯度的梨花粉管液泡。
[0034](3)该方法提纯后的液泡膜表面光滑，本法的优点是在相同的产量时污染程度较小，不仅可以应用于膜片钳研究，还可以进一步提纯应用于液泡蛋白质组学研究。
[0035](4)该方法不仅适用于梨花粉管液泡的提取纯化，同时还可以为其他特殊植物组织及花粉管液泡提取提供重要参考，解决了目前叶片液泡提取方法不适合花粉管液泡提取的问题。
[0036](5)本方法所需要的材料和药品极少，仅用3_5mg干花粉即可以提取到足够膜片钳实验需要的液泡，远远少于目前叶片液泡提取方法的3-5g叶片，而且花粉低温下易于保存，可以随时进行实验，以叶片为材料一般需要提前I个月时间准备。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1梨花粉管液泡提取技术流程
[0038]图2花粉管酶解过程中液泡的染色
[0039]图3液泡分离过程
[0040]其中，A-花粉管原生质体阶段；B-原生质体部分液泡化阶段；C_原生质体膨胀破裂，液泡部分脱离原生质体阶段；D_液泡逐渐脱离原生质，直至完全脱离，出现透明完整的液泡。Bar = 25 μ m。
[0041 ] 图4提取纯化后梨花粉管液泡
[0042]其中，箭头所指为液泡。
[0043]图5，采用“一种提取景天科植物细胞液泡的方法”(CN 103589678 A)，提取的花粉管原生质体,基本看不到花粉原生质体。
[0044]图6，采用“一种提取景天科植物细胞液泡的方法”(CN 103589678 A)，纯化的液泡，污染较多，液泡极少。
【具体实施方式】
[0045]实施例1
[0046]I)花粉采集:采集大蕾期花药，用硅胶干燥。
[0047]2)花粉培养:分离干燥花药中的花粉，取3mg花粉，将其加入到2ml花粉培养基中，加入0.005%的中性红染料。避光条件下，23?27°C，140?180rpm，培养3?4h。花粉培养基的配方:100g/L蔗糖，0.3g/L Ca(NO3)2.4H20, 30mM MES ( α -磺基甲脂磺酸钠)，0.lg/L硼酸溶于蒸馏水中并定容，用Tris (三羟甲基氨基甲烷)调整pH值至5.9?6.4。
[0048]3)原生质体的释放:将培养好的花粉与胞外液按照1:3的体积比例混合，加入I %的纤维素酶、I %的离析酶，23?27°C，黑暗条件下，60?80rpm，反应10-15分钟。胞外液配方为=10mM葡萄糖，1mM CaCl2, 5mM MES ( α -磺基甲脂磺酸钠)，0.8-1M山梨醇，用Tris (三羟甲基氨基甲烷)将pH调至5.5?6.0。
[0049]4)原生质体的纯化:将步骤3)所述液体通过200-250目的细胞筛以去除未酶解的花粉管，重复3次,滤液加入到离心管中，静置2-3分钟后吸取上清,上清液在lOOXg、10°C下离心10分钟，去除上清液，再用胞外液清洗3次以去除酶的残留和花粉管酶解后的残渣，所得沉淀为花粉管原生质体。液泡溶解液配方为:0.3-0.35M山梨醇，2-4mM EDTA (乙二胺四乙酸)，2-5mM DTT和0.005%的中性红，用Tris(三羟甲基氨基甲烷)将pH调至7.5 ?8.0。
[0050]5)液泡的分离:将液泡溶解缓冲液加入到步骤4)获得的原生质体中，用移液枪吸打3-5次，静置5?10分钟，观察液泡出现情况(图3)。
[0051]6)液泡的纯化:将出现液泡的缓冲液转移到Ficol 1-400密度梯度工作液顶部离心，这个梯度在26000rpm(100000Xg) 10°C下离心15?30分钟；离心后，Ficoll-400密度梯度工作液12-15%浓度顶部淡红色的一层为液泡，用剪过的移液枪头吸出，显微镜下观察(图4)。Ficoll-400密度梯度工作液的配制:Ficoll-400密度梯度(质量体积比浓度)工作液的配方为:12ml Ficoll-400密度梯度工作液包含及13%三个梯度浓度各4ml，分别将 Ficoll 400 溶于含 0.5M 的山梨醇，，5mM CaCldP25mM Tris-HCl 缓冲液中(pH7.5?8.0，10°C )配成需要的浓度。
【权利要求】
1.一种提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于该方法包括以下步骤: 1)花粉培养:分离干燥花药中的花粉，将其加入到花粉培养基中，加入0.005%的中性红染料，避光条件下，23?27°C，140?200rpm，培养3?4小时； 2)原生质体的释放:将培养好的花粉与胞外液按照1:2?5的体积比混合，加入0.5?1.5%的纤维素酶、0.5?L 5%的离析酶，23?27°C，黑暗条件下，60?80rpm，反应10?15分钟； 3)原生质体的纯化:将上一步所得含原生质体的液体通过200-250目的细胞筛去除未酶解的花粉管，滤液加入到离心管中，静置2-5分钟后吸取上清，上清液离心，去除上清液，再用胞外液清洗沉淀去除酶的残留和花粉管酶解碎片，所得沉淀为花粉管原生质体； 4)液泡的分离:将液泡溶解缓冲液加入到上一步获得的花粉管原生质体中，用移液枪吸打3-5次，静置5-10分钟，观察液泡出现情况； 5)液泡的纯化:将出现液泡的缓冲液转移到Ficoll-400密度梯度工作液顶部离心，在25000?28000rpm、8?10°C下离心15-30分钟；离心后，Ficoll-400密度梯度工作液12?15%浓度顶部淡红色的一层为液泡，将其吸出，显微镜下观察，淡红色、透明的为所述的梨花粉管液泡；所述的Ficoll-400密度梯度工作液浓度分别为:2?4%、6?8%及12?15%。
2.根据权利要求1所述的提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于该方法包括以下步骤: 1)花粉采集:采集大蕾期花药，干燥，干燥硅胶阴干； 2)花粉培养:分离干燥花药中的花粉，将其加入到花粉培养基中，加入0.005%的中性红染料，避光条件下，23?27°C，140?200rpm，培养3?4小时； 3)原生质体的释放:将培养好的花粉与胞外液按照1:3的体积比混合，加入1%的纤维素酶、I %的离析酶，23?27°C，黑暗条件下，60?80rpm，反应10?15分钟； 4)原生质体的纯化:将步骤3)所述液体通过200-250目的细胞筛以去除未酶解的花粉管，重复3次，滤液加入到离心管中，，静置2-3分钟后吸取上清，上清液在100X g、10°C下离心10分钟，去除上清液，再用胞外液清洗3次以去除酶的残留和花粉管酶解碎片，所得沉淀为花粉管原生质体； 5)液泡的分离:将液泡溶解缓冲液加入到步骤4)获得的原生质体中，用移液枪吸打3-5次，静置5-10分钟，显微镜下观察液泡出现情况； 6)液泡的纯化:将出现液泡的缓冲液转移到Ficoll-400密度梯度工作液顶部离心，在26000rpm、10°C下离心15-30分钟；离心后，Ficoll-400密度梯度工作液12?15%浓度顶部淡红色的一层为液泡，用剪过的移液枪头吸出，显微镜下观察，淡红色、透明的为液泡。
3.根据权利要求1或2所述的提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于所述的花粉培养基配方为:100g/L蔗糖，0.3g/L Ca(N03)2.4H20, 30mM MES，0.lg/L硼酸溶于蒸馏水中并定容，用Tris碱调整pH值至5.9?6.4。
4.根据权利要求1或2所述的提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于所述的胞外液配方为:10mM 葡萄糖，1mM CaCl2, 5mM MES, 0.8-1M 山梨醇，用 Tris 将 pH 调至 5.5 ?6.0。
5.根据权利要求1或2所述的提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于液泡溶解液配方为:0.3-0.35M山梨醇，2-4mM EDTA, 2-5mM DTT和0.005%的中性红，用Tris将pH调至7.5 ?8.0。
6.根据权利要求1所述的提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于Ficoll-400密度梯度工作液的配方为:12ml Ficoll-400密度梯度工作液包含2?4%、6?8%及12?15%三个梯度浓度各4ml，分别将Ficoll 400溶于pH 7.5?8.0的含0.5M的山梨醇，5mM CaCl2和25mM Tris-HCl缓冲液中配成要求的浓度。
7.根据权利要求6所述的提取梨花粉管液泡的方法，其特征在于Ficoll-400密度梯度工作液的配方为:12ml Ficoll-400密度梯度工作液包含及13%三个梯度浓度各4ml，分别将Ficoll 400溶于pH 7.5?8.0的含0.5M的山梨醇，5mM CaCl2和25mMTris-HCl缓冲液中配成要求的浓度。
【文档编号】C12N5/04GK104388380SQ201410757802
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】张绍铃, 周宏胜, 吴巨友, 高永彬, 陶书田, 齐开杰, 陈建清 申请人:南京农业大学