专利名称：OsCBL1蛋白在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用的制作方法
OsCBLI蛋白在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及OsCBLl蛋白在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用。
背景技术：
钾是植物生长发育所必需的营养元素，是植物体内含量最丰富的一价阳离子，约占植物干重的2%-10%。钾在植物体内具有分布广、含量高、移动性强等特点，主要集中在生命活动最旺盛的部位，通常优先分布于芽、幼叶、上部茎和根尖等生长活动旺盛的器官与组织中，当K+供应充足时，则更多的在下部茎、叶和根等组织中积累。
钾参与生命活动的方式与氮、磷不同。钾不参与任何有机物质的形成，但钾的许多生理作用却是其它元素所不可替代的。钾在植物体中的作用可以分成以下几类调节酶的活性，促进氮的吸收和蛋白质合成，调节韧皮部溶质运输，影响光合作用，调节细胞膨压和渗透势,维持细胞电荷平衡等。
土壤中的钾是植物钾素最主要的来源。自然条件下植物吸收的钾元素除少部分来自灌溉水外，其余全靠土壤供给，即使在栽培作物施用钾肥的情况下，作物吸收的钾也有 40-80%来自土壤。因此，土壤中钾的状况对植物的钾营养和钾肥施用效果有着极其重要的意义。土壤全钾含量一般占土壤总重的O. 1%-3%，由于植物只能从土壤中吸收以离子形式存在的钾元素，因此其中只有大约2%的钾对植物直接有效，其余的钾都以不能被植物直接吸收利用的形式被固定在土壤矿物中。
对一般农作物而言，土壤溶液K+含量在40ppm (约lmmol/L)以上时能够基本满足作物生长的需要，实际土壤溶液中的K+含量在l-200ppm (约0.025-5mmol/L)之间的范围内，但植物根际的钾浓度因为土壤耗竭带和不可交换钾等原因的存在，通常低于O. 3mmol/ L。当植株每千克干重中的钾元素含量低于IOg时，植株就会出现缺钾性状。如果在生长发育过程中钾供应不足，植株茎杆 会变得柔弱、易倒伏，抗旱、抗寒性降低，叶片失水，蛋白质、 叶绿素等物质被分解破坏，叶色变黄而且叶组织会逐渐衰老，最终明显影响产量。
目前我国农作物生产发展所面临的严峻状况是土壤缺钾且钾肥资源极其匮乏，因此从经济上和长远的战略上考虑，深入了解和认识植物对低钾胁迫的反应机制，提高农作物的耐低钾能力，对于提高农作物的产量和质量具有重要意义。发明内容
本发明的目的是提供OsCBLl蛋白在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用。
本发明提供了一种培育耐低钾逆境胁迫的植物的方法，包括如下步骤将OsCBLl 蛋白的编码基因导入目的植物，得到对低钾逆境胁迫耐受能力增强的转基因植株；
所述OsCBLl蛋白获自水稻(Oryza sativa),是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低钾逆境胁迫相关的由序列I衍生的蛋白质。
所述OsCBLl蛋白的编码基因为如下I)或2)或3)或4)的DNA分子
I)序列表中序列2自5’末端第I至639位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码植株耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子；
4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用 2XSSC、0. 1%SDS 和 I XSSC,O. 1%SDS 各洗膜一次。
所述OsCBLl蛋白的编码基因可通过表达载体导入所述目的植物。
可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述表达载体具体可为在1301-Ubiq质粒的多克隆位点(如BamH I和Kpn I酶切位点之间)插入所述OsCBLl蛋白的编码基因得到的重组质粒甲。
携带有所述OsCBLl蛋白的编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪法、花粉管通道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述基因可通过所述重组质粒甲导入所述目的植物中。
所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
所述单子叶植物可为水稻，如水稻品种“日本晴”。
所述双子叶植物可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥或其突变株。所述突变株具体可为cbl I cb 19双突变体。
所述“对低钾逆境胁迫耐受能力增强”体现为植株对K+的吸收能力增强和/或植株(植株的地下部分和/或地上部分)中的K+含量增加。
本发明还保护所述OsCBLl蛋白或所述OsCBLl蛋白的编码基因在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为水稻，如水稻品种“日本晴”。 所述双子叶植物可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥或其突变株。所述突变株具体可为cbllcbl9双突变体。以上任一所述“低钾”可为钾离子浓度为ImM以下，如lOOiiM以下、10iiM以下、 5uM以下或Oil M0本发明还保护所述OsCBLl蛋白、所述OsCBLl蛋白的编码基因或以上任一所述方 法在植物育种中的应用。所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为水稻， 如水稻品种“日本晴”。所述双子叶植物可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥或其突变株。 所述突变株具体可为cbllcbl9双突变体。本发明公开了水稻OsCBLl蛋白及其编码基因的工程应用，特别公开了该基因在 提高植物对土壤中有效钾利用效率方面的应用。OsCBLl蛋白在水稻中负责调控从土壤中吸 收K+。OsCBLl基因的敲除突变体导致水稻对K+的吸收显著减少，并出现明显的缺钾褐斑。 OsCBLl基因过表达植物对K+的吸收能力大大增加。本发明可用于提高植物耐低钾能力，为 培育适用于钾贫瘠土壤的水稻新品种提供了保障。
图1为oscbll突变体植株中T-DNA的插入位置。图2为实施例3中的PCR扩增产物的0. 8%琼脂糖凝胶电泳图。图3为实施例3中各个株系中OsCBLl基因的相对表达量。图4为实施例3中水稻品种“Dongjin”、oscbll突变体植株的全植株照片。图5为实施例3中水稻品种“日本晴”和OsCBLl基因过表达植株的全植株照片。图6为实施例3中钾离子含量的测定结果。图7为实施例4中的PCR扩增产物的0. 8%琼脂糖凝胶电泳图。图8为实施例4中各个株系的拟南芥培养7天后的照片。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。oscbll突变体，在水稻品种“Dongjin”的OsCBLl基因中插入T-DNA得到的，获 自 Rice GE (http://signal, salk. edu/cgi-bin/RiceGE JOB=TEXT&TYPE=GENE&QUERY = 0sl0g41510，编号为PFG_4A-00665. R ；oscbll突变体植株的T-DNA的插入位置见图1，其 中实心盒为外显子，线条为内含子，ATG为转录起始点。同样从RiceGE可以获得水稻品种 “Dongjin”(野生型植株)。哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)TAIR 网站(http://www. arabidopsis. org/)。水稻品种“日本晴”提及水稻品种“日本晴”的参考文献:Wenqiang Yang, Zhaosheng Kong，Edith Omo-Ikerodah,Wenying Xu，Qun Li,Yongbiao Xue. (2008)Calcineurin B-like interacting protein kinase 0sCIPK23functions in pollination and drought stress responses in rice (Oryza sativa L.). J. Genet. Genomics35，531-543.。
cbllcbl9双突变体提及“cbllcbl9双突变体”的参考文献Xu J，Li HD, Chen LQ, Wang Y,Liu LL, Wu WH. (2006)A protein kinase, interacting with two calcineurin B-1ike proteins, regulates K+transporter AKTlinArabidopsis. Cell, 125:1347-1360 ； 该双突变体植株是由cbl I突变体植株(出发植株为哥伦比亚生态型拟南芥)和cbl9突变体植株(出发植株为哥伦比亚生态型拟南芥)杂交得到的纯和株系。
1301-Ubiq 质粒提及 “ 1301-Ubiq 质粒”的参考文献Baisheng Yu, Zhongwei Linl,Haixia Li, Xiaoj iao Li, Jiayang Li,Yonghong Wang, Xia Zhang, Zuofeng Zhu,Wenxue Zhai,Xiangkun Wang, Daoxin Xie and Chuanqing Sun. (2007)TAC1, a maj or quantitative trait locus controlling tiller angle in rice. The Plant Journal52, 891-898 ; 1301-Ubiq 质粒是将 ubiquitin 启动子插入 PCAMBIA1301 的 Pst I 酶切位点得到的质粒。
农杆菌菌株EHA105 :提及“农杆菌菌株EHA105”的参考文献Jeroen S. C. van Roekel, Brigitte Damm, Leo S. Melchers, and Andr6Hoekema. (1993)Factors influencing transformation frequency of tomato(Lycopersicon esculentum). Plant Cell Reports, 12:644-647。
农杆菌菌株GV3101 :提及“农杆菌菌株GV3101”的参考文献R. Berres，L. Otten, B. Tinland, E. Malgarin1-Clog, B. Walter. (1992)Transformation of vitis tissue by different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6b gene. Plant Cell Reportsll, 192-195.。
实施例1、OsCBLl蛋白及其编码基因的获得在TIGR 网站(http://rice. plantbiology. msu. edu)上输入 L0C_10g41510,得到一段编码水稻钙感受基因的DNA序列。根据植物分子生物学国际植物基因命名法委员会， Commission for Plant Gene Nomenclature of the International Society for Plant Molecular Biology)的要求，将该DNA序列命名为OsCBLl基因，编码OsCBLl蛋白。OsCBLl 蛋白如序列表的序列I所不(由213个氣基酸残基组成)。基因组DNA中，OsCBLl基因具有 8个外显子和7个内含子。OsCBLl基因的开放阅读框如序列表的序列2所示(642bp)。
实施例2、过表达植株的获得
一、重组表达载体的构建
1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
2、以步骤2合成的双链DNA分子为模板，用OsCBLl-F和OsCBLl-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
OsCBLl-F :5，-A AGGATCCATGGGGTGCTTCCAGTCG-3，
OsCBLl-R :5’ -AAGGTACCTGTGACGAGATCATCAA-3，
3、用限制性内切酶BamH I和Kpn I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶BamH I和Kpn I双酶切1301-Ubiq质粒，回收载体骨架(约 11800bp)。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒甲。根据测序结果,对重组质粒甲进行结构描述如下在1301-Ubiq质粒的BamH I和Kpn I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第I至639位核苷酸所示的DNA分子。
二、OsCBLl基因过表达植株的构建
1、将重组质粒甲转化农杆菌菌株EHA105，得到重组农杆菌甲。
2、将步骤1得到的重组农杆菌甲重悬于共培养液体培养基(将2. 83g KNO3> O. 463g(NH4)2SO4' 0.185g MgSO4 · 7Η20、0· 166g CaCl2 · 2Η20、0· 4g ΚΗ2Ρ04、0· Ig 肌醇、 lmgNico-acid、Img Pyrido(B6)>IOmg Thiamin(BI)>7. 5g K1、30g H3B03、100g MnS04、20g ZnSO4 · 7H20、0. 25g CuSO4 · 5H20、0. 25g CoCl2,2. 5g Na2MoO4 · 2H20、27. 8mg FeSO4 · 7H20、 37. 3mg Na2-EDTA、2mg2，4-D、2g肌醇、0. 5g水解酪蛋白、100mM乙酰丁香酮和30g蔗糖溶于水并用水定容至1L)，得到0D600=0. 3-0. 5的重组农杆菌菌悬液。
3、将水稻品种“日本晴”的成熟胚愈伤组织与步骤2得到的重组农杆菌菌悬液共培养20min，然后倒掉菌液，用无菌滤纸洗去愈伤组织表面的菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的共培养固体培养基(在每升共培养液体培养基中加入2g植物凝胶)上，26°C暗培养 2-3 天。
4、抗性愈伤组织的筛选
将共培养后的愈伤组织经无菌转移至抗性筛选培养基平板(共培养固体培养基 +50mg/mL潮霉素)，26°C暗培养半个月，然后转移至新的抗性筛选培养基平板上继代培养一次。
5、将步骤4得到的抗性愈伤组织无菌转移至到预分化培养基(基本分化培养基+lmg/LNAA+5mg/LABA)，26°C暗培养2个月；然后转移至分化培养基(基本分化培养基 +0. 5mg/L KT+0. 25mg/L NAA+500mg/mL羧苄青霉素+50mg/mL潮霉素)，在光周期为15小时光照/9小时黑暗的条件中培养(半月左右有绿点出现，一个月后进一步分化出小苗)。
基本分化培养基将2. 83g KN03、0. 463g (NH4) 2S04、0. 185g MgSO4 · 7H20、 0. 166gCaCl2 · 2H20、0. 4g KH2P04、0.1g 肌醇、Img Nico-acid、Img Pyrido (B6) > IOmgThiamin(Bl)、7. 5g K1、30g H3BO3UOOg MnS04、20g ZnSO4 · 7H20、0. 25gCuS04 · 5H20、 0. 25g CoCl2、2. 5g Na2MoO4 · 2H20、27. 8mg FeSO4 · 7H20、37. 3mgNa2_EDTA、0. 5g Glutamine、 0.1g肌醇、0. 3g水解酪蛋白、0. 5g Proline和30g鹿糖溶于水并用水定容至1L。
6、当步骤5的小苗长至约2cm时，转移至生根培养基(将O. 825g NH4NO3^ O. 95gKN03、0. 085g ΚΗ2Ρ04、0· 185g MgSO4 · 7Η20、0· 166g CaCl2,0.1g 肌醇、Img Nico-acid, Img Pyrido (B6) UOmg Thiamin (BI)、7· 5g K1、30g H3BO3UOOg MnS04、20gZnS04 ·7Η20、0.25g CuSO4 · 5H20、0. 25g CoCl2,2. 5g Na2MoO4 · 2H20、27. 8mgFeS04 · 7H20、37. 3mg Na2-EDTA 和 30g 蔗糖溶于水并用水定容至1L)，培养两周左右生根。
7、将步骤6中根系发达的小苗移入土中，先在温室条件缓苗一周左右，然后移至户外正常培养，即为Ttl代植株。
8、将Ttl代植株自交并收获种子(T1代种子)，将T1代种子培育为T1代植株。
9、将T1代植株进行潮霉素抗性筛选(潮霉素浓度为50mg/mL)，对于某一 Ttl代植株， 如果其T1代植株在潮霉素抗性筛选中显示3:1的分离比，该Ttl代植株为单拷贝OsCBLl基因过表达植株。
10、将单拷贝OsCBLl基因过表达植株的T1代植株自交并收获种子(T2代种子)，将 T2代种子培育为T2代植株。
11、将T2代植株进行潮霉素抗性筛选(潮霉素浓度为50mg/mL)，对于某一 T1代植株，如果其T2代植株均为潮霉素抗性植株，该T1代植株为纯合的OsCBLl基因过表达植株， 该植株及其自交后代为一个OsCBLl基因过表达株系。
12、将OsCBLl基因过表达株系的T2代植株自交并收获种子(T3代种子)，将T3代种子培育为T3代植株。
13、将OsCBLl基因过表达株系的T3代植株自交并收获种子(T4代种子)，将T4代种子培育为T4代植株。
三、转空载体植株甲的构建
用1301-Ubiq质粒代替重组质粒甲进行步骤二，得到转空载体植株甲。
实施例3、OsCBLl蛋白的功能验证
分别将水稻品种“Dongin”(用DJ表示)、oscbll突变体、水稻品种“日本晴”(用 Np表示)、实施例2得到的OsCBLl过表达植株的T4代植株和实施例2得到的转空载体植株甲的T4代植株进行如下鉴定
一、分子鉴定
1、PCR 鉴定
提取植株幼苗的总RNA并反转录得到cDNA,以cDNA为模板,用Primerl和Primer2 组成的引物对进行PCR扩增(靶序列约为650bp)，以鉴定OsCBLl基因的表达量。采用 OsACTIN基因为看家基因，用Primer3和Primer4组成的引物对进行PCR鉴定(靶序列约为 600bp)。
Primerl :5’ -AATCTAGAATGGGGTGCTTCCAGTCGA-3’ ；
Primer2 5，-AAGGTACCTCATGTGACGAGATCATCAA-3，。
Primerf :5’ -TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3’ ；
Primer4 5，-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3，。
PCR扩增产物的O. 8%琼脂糖凝胶电泳图见图2。
2、Real-time PCR 鉴定
提取植株幼苗的总RNA并反转录得到cDNA，以cDNA为模板，采用Primer5和 Primer6组成的引物对进行Real-time PCR,以鉴定OsCBLl基因的表达量。采用OsACTIN基因为看家基因，用Primer7和Primer8组成的引物对进行Real-time PCR鉴定。Real-time PCR 中使用 SYBR Green Master mix 和 ABI7500sequence detection system (Applied Biosystems)。数据的处理采用Comparative CT方法。以OsACTIN基因作为内对照对数据进行归一化。
Primer5 :5， -CGATGGGCTCATCAATAAGG-3，；
Primer6 :5’ -CCCCCTTTTCTTCACATCAA-3’。
Primer7 :5’ -TGGTCGTACCACAGGTATTGTGTT-3’ ；
Primer8 :5， -AAGGTCGAGACGAAGGATAGCAT-3，。
以水稻品种“Dongjin”中OsCBLl基因的表达量作为1，其它各个株系中OsCBLl基因的相对表达量见图3。
步骤一的鉴定结果表明0sCBLl基因在水稻品种“Dongjin”中正常表达，而在 oscbll突变体植株中表达量显著降低，与水稻品种“Dongjin”相比，oscbll突变体植株中OsCBLl基因的表达量降低了 75. 50% ；0sCBLl基因在水稻品种“日本晴”中正常表达，而在 OsCBLl基因过表达植株中表达量显著升高，与水稻品种“日本晴”相比，OsCBLl基因过表达植株中OsCBLl基因的表达量升高了 6827. 10%。
二、OsCBLl蛋白的功能验证
1、分组处理
正常水培液的配制方法114.25mg NH4NO3^50. 38mg NaH2PO4 · 2Η20、89· 25mgK2S04、 110. 75mg CaCl2、405mg MgSO4 ·7Η20、1· 88mg MnCl2 ·4Η20、92· 5 μ g(NH4)6Mo7024 ·4Η20、1· 17mg Η3Β03、437μ g ZnSO4 · 7Η20、388μ g CuSO4 · 5Η20、34· 75mgFeS04 · 7Η20、46· 53mg Na2EDTA,用去离子水定容至1L，用NaOH调节pH为5. 70-5. 80。
正常水培液中的K+浓度约为ImM。
缺钾水培液的配制方法不加入K2SO4，其它均同正常水培液。
缺钾水培液中的K+浓度为OmM。
对照组将消毒后浸种并催芽的水稻种子放置于用去离子水浸湿的滤纸上，在光照培养箱中培养7天，然后将幼苗移至正常水培液中培养7天后拍照并检测钾离子含量。
实验组将消毒后浸种并催芽的水稻种子放置于用去离子水浸湿的滤纸上，在光照培养箱中培养7天，然后将幼苗移至缺钾水培液中培养7天后拍照并检测钾离子含量。
2、表型观察
水稻品种“Dongjin”、oscbll突变体植株的全植株照片见图4A,等位叶照片见图 4B。在正常水培液中培养7天后，水稻品种“Dongjin”和oscbll突变体植株的全植株表型和叶片表型均一致，生长状态良好。在缺钾水培液中培养7天后，oscbll突变体植株表现出叶片失绿并出现褐色的的缺钾斑，而水稻品种“Dongjin”的叶片仍保能保持绿色。
水稻品种“日本晴”和OsCBLl基因过表达植株的全植株照片见图5A，等位叶照片见图5B。在正常水培液中培养7天后，水稻品种“日本晴”和OsCBLl基因过表达植株的全植株表型和叶片表型均一致，生长状态良好。在缺钾水培液中培养7天后，水稻品种“日本晴”的叶片出现少量褐斑，而OsCBLl基因过表达植株的叶片未出现褐斑。在正常水培液中和在缺钾水培液中，转空载体植株甲的表型均与水稻品种“日本晴” 一致。
以上结果表明，OsCBLl基因参与了低钾通路，是低钾耐受基因。
3、钾离子含量的测定
(I)将植株用双蒸水清洗干净，将地下部分(根部)和地上部分(冠部)分开，放置于 80°C烘箱中烘干四天，至其重量恒定。
(2)将烘干的地下部分和地上部分分别在分析天平上称量并记录干重，然后分别放入坩埚内。
(3)将坩埚放 入马弗炉中，300°C烘烤I小时，然后将温度调至575°C再烘烤7小时， 关闭马弗炉，待其冷却至200°C以下后取出坩埚。
(4)每个坩埚中加IOmLO.1M HCl水溶液，以溶解剩余物。
(5)将步骤(4)得到的溶液用0.1M HCl水溶液稀释后作为待测溶液。
(6)用Z5000型原子吸收分光光度计面积法测定稀释溶液的钾浓度。采用KCl制作标准曲线。
(7)换算每g干重的植物材料中含有多少mg钾离子。
进行三次重复实验，每次重复实验中每个株系取3株植株，结果取平均值。
结果见图6。在不同浓度钾离子浓度的水培液培养下，oscbll突变体植株根部和冠部的钾离子含量都稍低于水稻品种“Dongjin”。在不同浓度钾离子浓度的水培液培养
下，OsCBLl基因过表达植株的根部和冠部的钾离子含量都稍高于水稻品种“日本晴”。在缺钾水培液中培养7天后，与水稻品种“Dongjin”相比，oscbll突变体植株根部的钾离子含量降低了 30.62%。在缺钾水培液中培养7天后，与水稻品种“日本晴”相比，
OsCBLl基因过表达植株根部的钾离子含量增加了 7. 32%。在不同浓度钾离子浓度的水培液培养下，转空载体植株甲的根部和冠部的钾离子含量都与水稻品种“日本晴” 一致。以上结果表明，oscbll突变体对低钾敏感，OsCBLl基因过表达植株对低钾耐受，即 OsCBLl基因是低钾耐受基因。
实施例4、转基因拟南介的犾得和鉴定
一、转基因拟南芥的获得
1、将实施例2的步骤一得到的重组质粒甲转化农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌乙。
2、将步骤I得到的重组农杆菌乙通过花浸泡法转化cbl lcbl9双突变体，收获T1代种子。
3、将T1代植株自交并收获种子(T2代种子)，将T2代种子培育为T2代植株。
4、将T2代植株在含50mg/L潮霉素的MS培养基上进行潮霉素抗性筛选，对于某一 T1代植株，如果其T2代植株在潮霉素抗性筛选中显示3:1的分离比，该T1代植株为单拷贝 OsCBLl基因过表达植株。
5、将单拷贝OsCBLl基因过表达植株的T2代植株自交并收获种子(T3代种子)，将 T3代种子培育为T3代植株。
6、将T3代 植株在含50mg/L潮霉素的MS培养基上进行潮霉素抗性筛选，对于某一 T2代植株，如果其T3代植株均为潮霉素抗性植株，该T2代植株为纯合的OsCBLl基因过表达植株，该植株及其自交后代为一个OsCBLl基因过表达株系。
二、转空载体拟南芥的获得
用1301-Ubiq质粒代替重组质粒甲进行步骤一，得到转空载体植株乙。
三、分子鉴定
分别对如下植株进行鉴定随机选取的4个转OsCBLl基因拟南芥单拷贝纯合株系 (株系1、株系2、株系3和株系4)的T3代种子、转空载体植株乙的T3代种子、cbllcbl9双突变体(简称双突变株)的种子和哥伦比亚生态型拟南芥的种子。
1、PCR 鉴定
提取植株幼苗的总RNA并反转录得到cDNA，以cDNA为模板，用Primerl和Primer2 组成的引物对进行PCR扩增(靶序列约为650bp)，以鉴定OsCBLl基因的表达量。采用AtEF 基因为看家基因，用Primer9和PrimerlO组成的引物对进行PCR鉴定。
Primer9 :5’ -ATGCCCCAGGACATCGTGATTTCAT-3’ ；
Pr imerIO : 5，-TTGGCGGCACCCTTACGTGGATCA-3，。
PCR扩增产物的0. 8%琼脂糖凝胶电泳图见图7。
四、耐逆性鉴定
分别对如下植株进行鉴定随机选取的4个转OsCBLl基因拟南芥单拷贝纯合株系 (株系1、株系2、株系3和株系4)的T3代种子、转空载体植株乙的T3代种子、cbllcbl9双突变体(简称双突变株)的种子和哥伦比亚生态型拟南芥的种子。
将拟南芥种子放置于MS培养基上，22 °C光照培养箱中连续光照(光强 60μmol ·m2 · s—1) 4天，然后分成两组，分别移苗至MS培养基和低钾培养基(用LK表示) 上，继续在光照培养箱中培养7天后拍照。
MS 培养基配方将1. 65g NH4NO3U. 9g ΚΝ03、0· 17g ΚΗ2Ρ04、0· 37g MgSO4 · 7H20、 0. 332g CaCl2,22. 3mg MnSO4 · 4H20、8. 6mg ZnSO4 · 7H20、0. 025mg CoCl2 · 6H20、 0. 025mgCuS04 · 5H20、0. 025mg Na2MoO4 · 2H20、0. 83mg K1、6. 2mg H3BO3, 27. 8mg FeSO4 · 7H20 和37. 3mg Na2EDTA溶于水并用水定容至1L。
低钾培养基与MS培养基的差异在于去除1. 9g KN03、1. 65g NH4N03、0. 332gCaCl2 和 0. 17g KH2PO4，加入 706mg Ca(NO3)2 和 144mg NH4H2PO4。
照片见图8。在MS培养基中，各个株系的表型均没有显著差异。在LK培养基中， 各个转OsCBLl基因植株的生长状态显著优于双突变株，与哥伦比亚生态型拟南芥无显著差异，转空载 体植株和双突变株的表型没有显著差异。
权利要求
1.一种培育耐低钾逆境胁迫的植物的方法，包括如下步骤^fOsCBLl蛋白的编码基因导入目的植物，得到对低钾逆境胁迫耐受能力增强的转基因植株； 所述OsCBLl蛋白是如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低钾逆境胁迫相关的由序列I衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述编码基因为如下I)或2)或3)或4)的DNA分子 1)序列表中序列2自5’末端第I至639位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码植株耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子； 4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述编码基因通过表达载体导入所述目的植物。
4.如权利要求1或3中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述单子叶植物为水稻。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述双子叶植物为拟南芥。
7.OsCBLl蛋白或其编码基因在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用； 所述OsCBLl蛋白是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低钾逆境胁迫相关的由序列I衍生的蛋白质。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述编码基因为如下I)或2)或3)或4)的DNA分子 1)序列表中序列2自5’末端第I至639位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码植株耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子； 4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物耐低钾逆境胁迫相关蛋白的DNA分子。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
10.权利要求1至6中任一所述方法在植物育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了OsCBL1蛋白在培育耐低钾逆境胁迫植物中的应用。本发明提供了一种培育耐低钾逆境胁迫的植物的方法，包括如下步骤将OsCBL1蛋白的编码基因导入目的植物，得到对低钾逆境胁迫耐受能力增强的转基因植株；所述OsCBL1蛋白获自水稻(Oryza sativa)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低钾逆境胁迫相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明可用于提高植物耐低钾能力，为培育适用于钾贫瘠土壤的水稻新品种提供了保障。
文档编号C12N15/84GK103031331SQ20121052022
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者王毅, 武维华, 李娟 , 龙雨 申请人:中国农业大学