专利名称：一种利用木质纤维素材料发酵生产槐糖脂的方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵生产槐糖脂的方法，尤其涉及一种利用木质纤维素材料以拟威克酵母变种(Wickerhamiella domercqiae var. sophorolipid)发酵生产槐糖脂的方法。
背景技术：
槐糖脂是一种重要的生物表面活性剂，主要是通过微生物发酵获得。通常，当疏水性碳源和亲水性碳源同时存在时，槐糖脂产生菌可以大量分泌槐糖脂。与化学合成的表面活性剂相比，槐糖脂除具有表面性能优良、乳化能力稳定，起泡效果明显外，还具有良好的生物可降解性、生物兼容性等优点，并且具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等生物活性。这些优点使得槐糖脂在商业上具有很大的应用前景。槐糖脂作为生物表面活性剂，可以应用在各种工业领域，但是槐糖脂的生产成本较高是制约其应用的一个重要因素。目前研究主要采取两种手段来降低槐糖脂的生产成本，一是优化发酵条件及培养基组分提高槐糖脂产量；二是选择一些廉价的可再生原料及工农业副产物作为发酵产槐糖脂的底物。曾有学者利用乳清中的乳糖为底物使隐球酵母生长，生产单细胞油，破碎细胞后，将细胞提取物中的甘油三酯用来生产槐糖脂。还有报道利用甘蔗糖浆、去蛋白乳清或废糖蜜作为亲水性底物用以生产槐糖脂。此外，动物脂肪、煎炸废油、工业脂肪酸废料、餐饮业废油等也有报道被作为疏水性底物用于槐糖脂的生产。然而，经检索利用木质纤维素材料，特别是同时利用生物质资源纤维素酶水解液和水解液来源的单细胞油发酵生产槐糖脂的文献及专利还未见报道。因而利用地球上最丰富的纤维素作为原料来生产槐糖脂具有极其重要的实际意义。
发明内容
针对目前尚未有利用生物质资源发酵生产槐糖脂的报道，本发明要解决的问题是提供一种利用木质纤维素材料发酵生产槐糖脂的方法，即利用生物质资源水解液及水解液所产单细胞油以拟威克酵母变种发酵生产槐糖脂的方法。本发明所述利用木质纤维素材料以拟威克酵母变种发酵生产槐糖脂的方法的步骤是(1)糖化液制备取木质纤维素材料，以15 35个滤纸酶活单位(FPA)每克干木质纤维素的量添加纤维素酶液，在35 55°C下糖化60 80h ；收集糖化液于75 85°C 下水浴30 60min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于7000 IOOOOrpm下离心6 lOmin，得澄清的糖化液；其中上述木质纤维素材料是包括木素木糖渣，木糖渣，玉米芯粉，玉米秸秆，甘蔗渣，小麦秆，水稻秆，高粱秆或草粉等生物质能源。(2)糖化液的脱毒处理将上述糖化液水浴加热至80°C，再加入其质量百分比为 0. 6 1. 2%的活性炭，搅拌30 50min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；(3)利用糖化液制备单细胞油以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的产油微生物以体积百分比为4 10%的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30 士 2°C、200 士 50rpm，摇床震荡培养60 80h ；发酵液于7000 9000rpm下离心8 15min收集菌体，蒸馏水清洗菌体3 4次；以酸热-有机试剂法提取单细胞油，即以3g湿菌体IOml的比例加入4M HC1，涡旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g湿菌体5ml的比例加入无水乙醇，按3g湿菌体15ml的比例加入乙醚，震荡后再按3g湿菌体15ml的比例加入石油醚，振荡放气，收集有机试剂层，烘干挥发去除有机试剂后得单细胞油；
其中上述产油微生物是隐球酵母(Cryptococcus curvatus)，红东孢酵母(Rhodosporidium toruloides)，斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，粘红酵母(Rhodotorula giutinis)，亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，皮状丝孢酵母 (Trichosporon cutaneum)，深黄被抱霉(Mortierella isabellina)或少根根霉(Rhizopus arrhizus)；
(4)发酵生产槐糖脂以脱毒的糖化液、60ml/l单细胞油、1. 5g/l酵母粉、1. Og/ 1磷酸二氢钾、1. Og/Ι磷酸氢二钠、0. 5g/l硫酸镁的配方制备产槐糖脂糖化液发酵培养基，将活化好的拟威克酵母变种(Wickerhamiella domercqiae var. sophorolipid) CGMCC No. 1576以体积百分比为1 4%接种量接种于产槐糖脂糖化液发酵培养基中，于30士2°C、 150 300rpm，摇床振荡发酵培养7 9天，得到含槐糖脂的发酵液；
(5)槐糖脂粗提取含槐糖脂的发酵液，加入其2 6倍体积的乙酸乙酯萃取， 5000 SOOOrpm离心5 15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品； 或取含槐糖脂的发酵液，加入其3 6倍体积的乙醇，涡旋混合，6000 IOOOOrpm离心5 15min，收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品。
上述步骤(1)中所述纤维素酶液是指产纤维素酶真菌经发酵所得粗酶液以及商品化的纤维素酶；其中所述真菌是指青霉属、木霉属或曲霉属菌株。
具体的，上述步骤⑴中所述纤维素酶液的制备方法是将斜卧青霉 (Penicillium decumbens) JU-AlO 以常规量接种于产酶培养基中，30士2°C，150 300rpm 下震荡培养60 96h，5000 7000rpm下离心15 30min，收集上清液即为纤维素酶液；其中所述产酶培养基配方为20g/l木糖渣，30g/l麸皮，6g/l微晶纤维素，5g/l豆饼粉，2g/l 硫酸铵，lg/Ι尿素，2g/l硝酸钠，3g/l磷酸二氢钾，0. 5g/l硫酸镁，3ml/l吐温80。
上述步骤(1)所述的纤维素酶添加量优选为20 30个滤纸酶活单位每克干木质纤维素(FPA/g干木质纤维素)，糖化温度优选为40 50°C，糖化时间优选为70 80h。所述离心转速优选为8000 9000rpm，所述离心时间优选为8 lOmin。
上述步骤(1)所述木质纤维素材料优选脱木素木糖渣或玉米芯粉。
上述步骤(2)所述活性炭的质量百分比优选为0.8 1.0%，搅拌时间优选为 30 35min。
上述步骤(3)中，产油微生物接种量优选为6 8%，培养时间优选为65 75h， 获得菌体的离心时间优选为10 12min。
上述步骤(4)所述接种体积优选为2 3%，所述发酵培养转速优选为200 250rpmo
上述步骤( 所述乙酸乙酯的添加量是含槐糖脂发酵液体积的2 4倍，离心转速优选为6000 7000rpm，离心时间优选为7 12min。所述乙醇的添加量是含槐糖脂发酵液体积的3 4倍，离心转速优选为7000 9000rpm，离心时间优选为7 12min。
本发明提供一种利用木质纤维素材料发酵生产槐糖脂的方法，即利用生物质资源 (如脱木素木糖渣，木糖渣，玉米秸秆，玉米芯粉，草粉等)水解液及水解液所产单细胞油以拟威克酵母变种发酵生产槐糖脂的方法。方法中使用木质纤维素糖化液替代单细胞油和槐糖脂生产所需的糖，使用单细胞油替代槐糖脂生产所需的疏水性底物，所得槐糖脂易于分离，产量高。本发明方法具有原料丰富、价格低廉、工艺简便、显著降低槐糖脂生产成本的特点，生物质资源的大量利用，处理了废弃农业废料，对改善我国能源紧缺状况，保障我国能源可持续供给，缓解能源危机具有重要的实际意义和重要的经济价值。
图1利用脱木素木糖渣发酵生产槐糖脂思路图。
图2普通培养基和糖化液培养基所得槐糖脂的形态比较，(A)来源于普通培养基 (B)来源于糖化液培养基。
图3HPLC分析普通培养基和糖化液培养基所得槐糖脂的组成。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明。
实施例1
(1)纤维素酶液的制备将斜卧青霉(Penicillium decumbens) JU-AlO以常规量接种于产酶培养基中，300C，250rpm下震荡培养产酶，6000rpm下离心30min，收集上清液即为纤维素酶粗酶液；
上述产酶培养基配方为20g/l木糖渣，30g/l麸皮，6g/l微晶纤维素，5g/l豆饼粉，2g/l硫酸铵，lg/Ι尿素，2g/l硝酸钠，3g/l磷酸二氢钾，0. 5g/l硫酸镁，3ml/l吐温80 ；
(2)糖化液制备取脱木素木糖渣，以25个FPA每克干底物添加纤维素酶液，在 45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于 8000rpm下离心lOmin，得澄清的糖化液；
(3)糖化液的脱毒处理将糖化液水浴加热至80°C，加入其质量百分比为1. 0%的活性炭，搅拌30min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；
(4)利用糖化液制备单细胞油以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的隐球酵母(Cryptococcus curvatus)以6%的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30°C、200rpm，摇床震荡培养72h ；发酵液于SOOOrpm下离心 IOmin收集菌体，蒸馏水清洗菌体3次；酸热-有机试剂法提取单细胞油，即以3g湿菌体IOml的比例加入4M HC1，涡旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g湿菌体5ml的比例加入无水乙醇，按3g湿菌体15ml的比例加入乙醚，震荡后再按3g湿菌体15ml的比例加入石油醚，振荡放气，收集有机试剂层，烘干挥发去除有机试剂后得单细胞油；
(5)发酵生产槐糖脂以脱毒的糖化液、60ml/l单细胞油、1. 5g/l酵母粉、1. Og/ 1磷酸二氢钾、1. Og/Ι磷酸氢二钠、0. 5g/l硫酸镁的配方制备产槐糖脂糖化液发酵培m^iti^^W^^iW·^·7^^ (ffickerhamiella domercqiae var. sophorolipid) CGMCC No. 1576以体积百分比为2%接种量接种于产槐糖脂糖化液发酵培养基中，于30°C、 200rpm，摇床振荡发酵培养7天，得含槐糖脂的发酵液；(6)槐糖脂粗提取含槐糖脂的发酵液加入其2倍体积的乙酸乙酯萃取，6000rpm 离心15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的发酵液加入其3倍体积的乙醇，涡旋混合，6000rpm离心15min，收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品。实验结果斜卧青霉粗酶液酶解得到的糖化液的葡萄糖的浓度达到了 49g/l，在未经脱毒处理的产油糖化液培养基中的隐球酵母的菌体干重达到了 15. 00g/l，单细胞油达到了 6. 14g/l，油脂含量为40. 92%。在脱毒后产油糖化液培养基中，隐球酵母菌体干重和单细胞油分别达到了 15. 16g/l和6. 18g/l，油脂含量为40. 73%。使用上述所得糖化液和单细胞油进行槐糖脂的发酵时，拟威克酵母变种生长良好，经过7天的发酵培养，葡萄糖基本被耗尽，内酯型槐糖脂的产量达到了 30. 37g/l，总槐糖脂的产量达到了 53. 16g/l。实施例2(1)纤维素酶液的制备将斜卧青霉以常规量接种于产酶培养基中，30°C，250rpm 下震荡培养84h产酶，6000rpm下离心30min，收集上清液即为纤维素酶粗酶液；上述产酶培养基配方为20g/l木糖渣，30g/l麸皮，6g/l微晶纤维素，5g/l豆饼粉，2g/l硫酸铵，lg/Ι尿素，2g/l硝酸钠，3g/l磷酸二氢钾，0. 5g/l硫酸镁，3ml/l吐温80 ；(2)糖化液制备取脱木素木糖渣，以30个FPA每克干底物添加纤维素酶液，在 45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于 9000rpm下离心8min，得澄清的糖化液；(3)糖化液的脱毒处理将糖化液水浴加热至80°C，加入其质量百分比为1. 0%的活性炭，搅拌30min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；(4)利用糖化液制备单细胞油以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的红东孢酵母(Miodosporidium toruloides)以8%的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30°C、200rpm，摇床震荡培养75h ；发酵液于SOOOrpm下离心IOmin收集菌体，蒸馏水清洗菌体3次；酸热-有机试剂法提取单细胞油，即以3g湿菌体IOml的比例加入4M HCl，漩涡混合lmin，每0. 5h 一次，共混合5次；沸水浴60min， 中间混合一次，冰水浴30min ；将混合液转入分液漏斗，按每3g湿菌体5ml的比例加入无水乙醇，按每3g湿菌体15ml的比例用乙醚分洗试管，合并入分液漏斗，振荡约lmin，再按每 3g湿菌体15ml的比例加入石油醚，振荡放气，待上层液体清晰，小心的地将上层有机试剂转移至干净的离心管，置于50°C烘箱中烘干挥发去除有机试剂；(5)发酵生产槐糖脂以脱毒的糖化液、60ml/l单细胞油、1. 5g/l酵母粉、1. Og/ 1磷酸二氢钾、1. Og/Ι磷酸氢二钠、0. 5g/l硫酸镁的配方制备产槐糖脂糖化液发酵培
^^if W 1 3 SIfiJr^ft (ffickerhamiella domercqiae var. sophorolipid) CGMCC No. 1576以体积百分比为2%接种量接种于产槐糖脂糖化液发酵培养基中，于32°C、 200rpm，摇床振荡发酵培养7天，得含槐糖脂的发酵液；(6)槐糖脂粗提取含槐糖脂的发酵液加入其3倍体积的乙酸乙酯萃取，6000rpm 离心15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的发酵液加入其3倍体积的乙醇，涡旋混合，6000rpm离心15min，收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品。实验结果斜卧青霉粗酶液酶解脱木素木糖渣所得的糖化水解液的葡萄糖的浓度达到了 52g/l.经过80h的培养，红东孢酵母在产油糖化液培养基中的菌体干重达到了 16.30g/l，单细胞油达到了 7.0(^/1，油脂含量为42.92%。当使用上述所得糖化液和单细胞油进行槐糖脂的发酵时，拟威克酵母变种生长良好，经过7天的发酵培养，菌体干重达到了 8. Og/Ι，葡萄糖基本被耗尽，内酯型槐糖脂的产量达到了 32. 51g/l，总槐糖脂的产量达到了 53. 79g/l。实施例3(1)糖化液制备取脱木素木糖渣，以25个FPA每克干底物添加商品化纤维素酶液(来源于青岛康地恩生物技术有限公司)，缓冲体系为PH4. 8的0. 05M HAC-NaAc缓冲液在45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于8000rpm下离心lOmin，得澄清的糖化液；(2)糖化液的脱毒处理将糖化液水浴加热至80°C，加入其质量百分比为1. 0%的活性炭，搅拌30min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；(3)利用糖化液制备单细胞油以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的隐球酵母(Cryptococcus curvatus 03)以8%的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30°C、200rpm，摇床震荡培养72h ；发酵液于SOOOrpm下离心IOmin收集菌体，蒸馏水清洗菌体3次。酸热-有机试剂法提取单细胞油，即以3g湿菌体IOml的比例加入4M HC1，涡旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g湿菌体5ml的比例加入无水乙醇，按3g湿菌体15ml的比例加入乙醚，震荡后再按3g湿菌体15ml的比例加入石油醚，振荡放气，收集有机试剂层，烘干挥发去除有机试剂后得单细胞油；(4)发酵生产槐糖脂以脱毒的糖化液、60ml/l单细胞油、1. 5g/l酵母粉、1. Og/ 1磷酸二氢钾、1. Og/Ι磷酸氢二钠、0. 5g/l硫酸镁的配方制备产槐糖脂糖化液发酵培
^^if W 1 3 SIfiJr^ft (ffickerhamiella domercqiae var. sophorolipid) CGMCC No. 1576以体积百分比为2%接种量接种于产槐糖脂糖化液发酵培养基中，于30°C、 200rpm，摇床振荡发酵培养7天，得含槐糖脂的发酵液；(5)槐糖脂粗提取含槐糖脂的发酵液加入其2倍体积的乙酸乙酯萃取，6000rpm 离心15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的发酵液加入其3倍体积的乙醇，涡旋混合，6000rpm离心15min，收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品。实验结果在pH4. 8的0. 05M HAC-NaAc缓冲液中，康地恩酶液酶解得到的糖化液的葡萄糖浓度达到了 Mg/Ι。用于隐球酵母的培养时，隐球酵母的菌体干重达到了 23. 43g/ 1，油脂含量达到了 46. 74%，单细胞油产量达到了 10.95g/l。当使用该糖化液和单细胞油进行槐糖脂的发酵时，经过7天的发酵培养，内酯型槐糖脂的产量为13. 04g/l，总槐糖脂的产量达到了 30. 25g/l。实施例4(1)糖化液制备取脱木素木糖渣，以20个FPA每克干底物添加商品化纤维素酶液(来源于青岛康地恩生物技术有限公司)，缓冲体系为PH4. 8的0. 2M HAC-NaAc缓冲液在45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于9000rpm下离心8min，得澄清的糖化液；
(2)糖化液的脱毒处理将糖化液水浴加热至80°C，加入其质量百分比为1. 0%的活性炭，搅拌30min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；
(3)利用糖化液制备单细胞油以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)以6%的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30°C、200rpm，摇床震荡培养65h ；发酵液于SOOOrpm下离心IOmin收集菌体，蒸馏水清洗菌体3次。酸热-有机试剂法提取单细胞油，即以3g湿菌体IOml的比例加入4M HCl，涡旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g湿菌体5ml的比例加入无水乙醇，按3g湿菌体15ml的比例加入乙醚，震荡后再按3g湿菌体15ml的比例加入石油醚，振荡放气，收集有机试剂层，烘干挥发去除有机试剂后得单细胞油；
(4)发酵生产槐糖脂以脱毒的糖化液、60ml/l单细胞油、1. 5g/l酵母粉、1. Og/ 1磷酸二氢钾、1. Og/Ι磷酸氢二钠、0. 5g/l硫酸镁的配方制备产槐糖脂糖化液发酵培^^if W 1 3 SIfiJr^ft (ffickerhamiella domercqiae var. sophorolipid) CGMCC No. 1576以体积百分比为2%接种量接种于产槐糖脂糖化液发酵培养基中，于32°C、 200rpm，摇床振荡发酵培养7天，得含槐糖脂的发酵液；
(5)槐糖脂粗提取含槐糖脂的发酵液加入其4倍体积的乙酸乙酯萃取，6000rpm 离心15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的发酵液加入其4倍体积的乙醇，涡旋混合，6000rpm离心15min，收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品。
实验结果在pH4. 8的0. 2M HAC-NaAc缓冲液中，康地恩纤维素酶酶解脱木素木糖渣所得糖化液的葡萄糖的浓度达到了 56g/l。用于亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica) 的培养时，亚罗解脂酵母的菌体干重达到了 17. 36g/l，油脂含量达到了 44. 35%，单细胞油产量达到了 7. 70g/l。当使用该糖化液和单细胞油进行槐糖脂的发酵时，经过7天的发酵培养，内酯型槐糖脂的产量为19. 36g/l，总槐糖脂的产量达到了 42. 06g/l.
实施例5
(1)糖化液制备取脱木素木糖渣，以25个FPA每克干底物添加商品化纤维素酶液(来源于杰能科生物技术有限公司)，缓冲体系为PH4. 8的0. 05M HAC-NaAc缓冲液在 45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于 8000rpm下离心lOmin，得澄清的糖化液；
(2)糖化液的脱毒处理将糖化液水浴加热至80°C，加入其质量百分比为1. 0%的活性炭，搅拌30min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；
(3)利用糖化液制备单细胞油以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的深黄被孢霉(Mortierella isabellina)以6%的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30°C、200rpm，摇床震荡培养72h ；发酵液于SOOOrpm下离心IOmin收集菌体，蒸馏水清洗菌体3次。酸热-有机试剂法提取单细胞油，即以3g湿菌体IOml的比例加入4M HCl，漩涡混合lmin，每0. 5h 一次，共混合5次；沸水浴60min，中间混合一次，冰水浴30min ；将混合液转入分液漏斗，按每3g湿菌体5ml的比例加入无水乙醇，按每3g湿菌体15ml的比例用乙醚分洗试管，合并入分液漏斗，振荡约lmin，再按每3g 湿菌体15ml的比例加入石油醚，振荡放气，待上层液体清晰，小心的地将上层有机试剂转移至干净的离心管，置于50°C烘箱中烘干挥发去除有机试剂；(4)发酵生产槐糖脂以脱毒的糖化液、60ml/l单细胞油、1. 5g/l酵母粉、1. Og/ 1磷酸二氢钾、1. Og/Ι磷酸氢二钠、0. 5g/l硫酸镁的配方制备产槐糖脂糖化液发酵培
^^if W 1 3 SIfiJr^ft (ffickerhamiella domercqiae var. sophorolipid) CGMCC No. 1576以体积百分比为2%接种量接种于产槐糖脂糖化液发酵培养基中，于30°C、 200rpm，摇床振荡发酵培养7天，得含槐糖脂的发酵液；(5)槐糖脂粗提取含槐糖脂的发酵液加入其2倍体积的乙酸乙酯萃取，6000rpm 离心15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的发酵液加入其3倍体积的乙醇，涡旋混合，6000rpm离心15min，收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品。实验结果在pH4. 8的0. 05M HAC-NaAc缓冲液中，杰能科酶液酶解得到的糖化液的葡萄糖浓度达到了 52g/l。用于深黄被孢霉(Mortierella isabellina)的培养时， 深黄被孢霉的菌体干重达到了 15. 31g/l，油脂含量达到了 40. 21 %，单细胞油产量达到了 6. 16g/l。当使用该糖化液和单细胞油进行槐糖脂的发酵时，经过7天的发酵培养，内酯型槐糖脂的产量为21. 12g/l，总槐糖脂的产量达到了 53. 79g/l。实施例6(1)糖化液制备取甘蔗渣，以20个FPA每克干底物添加商品化纤维素酶液(来源于杰能科生物技术有限公司)，缓冲体系为PH4. 8的0. 2M HAC-NaAc缓冲液在50°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于9000rpm下离心8min，得澄清的糖化液；(2)糖化液的脱毒处理将糖化液水浴加热至80°C，加入其质量百分比为1. 0%的活性炭，搅拌30min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；(3)利用糖化液制备单细胞油以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的粘红酵母(Miodotorula giutinis)以7%的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30°C、200rpm，摇床震荡培养65h ；发酵液于SOOOrpm下离心 IOmin收集菌体，蒸馏水清洗菌体3次。酸热-有机试剂法提取单细胞油，即以3g湿菌体IOml的比例加入4M HC1，涡旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g湿菌体5ml的比例加入无水乙醇，按3g湿菌体15ml的比例加入乙醚，震荡后再按3g湿菌体15ml的比例加入石油醚，振荡放气，收集有机试剂层，烘干挥发去除有机试剂后得单细胞油；(4)发酵生产槐糖脂以脱毒的糖化液、60ml/l单细胞油、1. 5g/l酵母粉、1. Og/ 1磷酸二氢钾、1. Og/Ι磷酸氢二钠、0. 5g/l硫酸镁的配方制备产槐糖脂糖化液发酵培
^^if W 1 3 SIfiJr^ft (ffickerhamiella domercqiae var. sophorolipid) CGMCC No. 1576以体积百分比为2%接种量接种于产槐糖脂糖化液发酵培养基中，于30°C、 200rpm，摇床振荡发酵培养7天，得含槐糖脂的发酵液；(5)槐糖脂粗提取含槐糖脂的发酵液加入其3倍体积的乙酸乙酯萃取，6000rpm离心15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的发酵液加入其4倍体积的乙醇，涡旋混合，6000rpm离心15min，收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品。
实验结果在pH4. 8的H2O缓冲液中，杰能科酶液酶解甘蔗渣所得糖化液的葡萄糖的浓度达到了 51g/l。用于粘红酵母(Iihodotorula giutinis)的培养时，粘红酵母的菌体干重达到了 17.86g/l，油脂含量达到了 37. 35%，单细胞油产量达到了 6.67g/l。当使用该糖化液和单细胞油进行槐糖脂的发酵时，经过7天的发酵培养，内酯型槐糖脂的产量为 16. 33g/l，总槐糖脂的产量达到了 33. 78g/l。
实施例7
(1)糖化液制备取玉米芯粉，以30个FPA每克干底物添加商品化纤维素酶液(来源于杰能科生物技术有限公司)，缓冲体系为PH4. 8的0. 2M HAC-NaAc缓冲液在50°C下糖化75h ；收集糖化液于80°C下水浴40min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于9000rpm下离心8min，得澄清的糖化液；
以下步骤同实施例6中(2) (5)。
实验结果在pH4. 8的H2O缓冲液中，杰能科酶液酶解玉米芯粉所得糖化液的葡萄糖的浓度达到了 53g/l。用于粘红酵母(Iihodotorula giutinis)的培养时，粘红酵母的菌体干重达到了 18.96g/l，油脂含量达到了 47. 35%，单细胞油产量达到了 7.67g/l。当使用该糖化液和单细胞油进行槐糖脂的发酵时，经过7天的发酵培养，内酯型槐糖脂的产量为 19. 33g/l，总槐糖脂的产量达到了 43. 78g/l。
权利要求
1.一种利用木质纤维素材料以拟威克酵母变种发酵生产槐糖脂的方法，步骤是(1)糖化液制备取木质纤维素材料，以15 35个滤纸酶活单位每克干木质纤维素的量添加纤维素酶液，在35 55°C下糖化60 80h ；收集糖化液于75 85°C下水浴30 60min使残余纤维素酶失活，然后将糖化液于7000 IOOOOrpm下离心6 lOmin，得澄清的糖化液；其中上述木质纤维素材料是脱木素木糖渣，木糖渣，玉米芯粉，玉米秸秆或草粉；(2)糖化液的脱毒处理将上述糖化液水浴加热至80°C，再加入其质量百分比为0.6 1. 2%的活性炭，搅拌30 50min，然后真空抽滤去除活性炭，得脱毒的糖化液；(3)利用糖化液制备单细胞油以脱毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制备产油糖化液发酵培养基，将活化好的产油微生物以体积百分比为4 10%的接种量接种于产油糖化液发酵培养基中，于30 士 2 °C、200 士 50rpm，摇床震荡培养60 80h ；发酵液于7000 9000rpm 下离心8 15min收集菌体，蒸馏水清洗菌体3 4次；以酸热-有机试剂法提取单细胞油， 即以3g湿菌体IOml的比例加入4M HCl，涡旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ； 然后按3g湿菌体5ml的比例加入无水乙醇，按3g湿菌体15ml的比例加入乙醚，震荡后再按3g湿菌体15ml的比例加入石油醚，振荡放气，收集有机试剂层，烘干挥发去除有机试剂后得单细胞油；上述产油微生物是隐球酵母(Cryptococcus curvatus)，红东孢酵母(Rhodosporidium toruloides)，斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，粘红酵母(Rhodotorula giutinis)，亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum), "MMW^^M= (Mortierella isabellina) 13 ^(Rhizopus arrhizus)；(4)发酵生产槐糖脂以脱毒的糖化液、60ml/l单细胞油、1.5g/l酵母粉、1. Og/Ι磷酸二氢钾、1. Og/Ι磷酸氢二钠、0. 5g/l硫酸镁的配方制备产槐糖脂糖化液发酵培养基，将活化好的拟威克酵母变种(Wickerhamiella domercqiae var. sophorolipid)CGMCC No. 1576 以体积百分比为1 4%接种量接种于产槐糖脂糖化液发酵培养基中，于30士2°C、150 300rpm，摇床振荡发酵培养7 9天，得到含槐糖脂的发酵液；(5)槐糖脂粗提取含槐糖脂的发酵液，加入其2 6倍体积的乙酸乙酯萃取，5000 SOOOrpm离心5 15min，收集乙酸乙酯层，减压浓缩后烘干，得内酯型槐糖脂粗品；或取含槐糖脂的发酵液，加入其3 6倍体积的乙醇，涡旋混合，6000 IOOOOrpm离心5 15min， 收集上清，减压浓缩后烘干，得总槐糖脂粗品。
2.如权利要求1所述利用木质纤维素材料以拟威克酵母变种发酵生产槐糖脂的方法， 其特征在于步骤(1)所述木质纤维素材料选脱木素木糖渣或玉米芯粉。
3.如权利要求1所述利用木质纤维素材料以拟威克酵母变种发酵生产槐糖脂的方法， 其特征在于步骤(1)所述纤维素酶添加量为20 30个滤纸酶活单位每克干木质纤维素， 糖化温度为40 50°C，糖化时间为70 80h。
4.如权利要求1所述利用木质纤维素材料以拟威克酵母变种发酵生产槐糖脂的方法， 其特征在于步骤(2)所述活性炭的质量百分比为0. 8 1. 0%，搅拌时间为30 35min。
5.如权利要求1所述利用木质纤维素材料以拟威克酵母变种发酵生产槐糖脂的方法， 其特征在于步骤C3)所述产油微生物的培养条件是30°C、200rpm摇床震荡培养65 75 小时。
6.如权利要求1所述利用木质纤维素材料以拟威克酵母变种发酵生产槐糖脂方法，其特征在于步骤(4)所述拟威克酵母变种的发酵条件是30°C、200 250rpm摇床振荡发酵培养7 8天。
7.如权利要求1所述利用木质纤维素材料以拟威克酵母变种发酵生产槐糖脂的方法， 其特征在于步骤( 所述乙酸乙酯的添加量是含槐糖脂发酵液体积的2 4倍，离心转速为6000 7000rpm，离心时间为7 12min。
8.如权利要求1所述利用木质纤维素材料以拟威克酵母变种发酵生产槐糖脂的方法， 其特征在于步骤( 所述乙醇的添加量是含槐糖脂发酵液体积的3 4倍，离心转速为 7000 9000rpm，离心时间为7 12min。
全文摘要
本发明公开了一种利用木质纤维素材料发酵生产槐糖脂的方法，是利用脱木素木糖渣，木糖渣，玉米秸秆，玉米芯粉，草粉等生物质资源水解液及水解液所产单细胞油，以拟威克酵母变种在30±2℃、150～300rpm摇床振荡发酵条件下得到含槐糖脂的发酵液，再经对发酵液粗提获得槐糖脂。本发明方法使用木质纤维素糖化液替代单细胞油和槐糖脂生产所需的糖，使用单细胞油替代槐糖脂生产所需的疏水性底物，所得槐糖脂易于分离，产量高；具有原料丰富、价格低、工艺简便、成本低的特点，生物质资源的大量利用，处理了废弃农业废料，对改善我国能源紧缺状况，保障我国能源可持续供给，缓解能源危机具有重要的实际意义和重要的经济价值。
文档编号C12P19/12GK102492753SQ20111040382
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者宋欣, 马晓静 申请人:山东大学