专利名称：基因异位表达系统调控水稻株型的方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。涉及一种控制水稻株型的方法，即通过GAL4-UAS 异位表达系统调控水稻0Sa-miR156e基因或其同源基因的表达，达到调控水稻株型的目 的，以及该方法在转基因水稻和转基因水稻种子中的应用。本发明第一次采用分子设计育 种的方法调控水稻株型，有望在水稻株型育种中应用，塑造理想株型，达到增产的目的。
背景技术：
水稻作为重要的粮食作物，是世界三分之一以上的人以其为主食。为解决人口增 长与耕地面积减少的矛盾，提高水稻单位面积产量仍是人们面临的严峻挑战。近年来，随着 水稻功能基因组研究的深入，许多控制水稻产量的功能基因被分离克隆。水稻产量性状的 遗传改良取决于穗型、粒型、分蘖数、株型等一系列因素。株型育种被认为是提高水稻产量 的重要方法，50,60年代的矮化育种就是株型育种在提高产量方面的一个很好的例子。早在 1994年，国际水稻所(IRRI)提出了水稻理想株型育种，即基于减少分蘖总数、提高成穗率、 株型紧凑、塑造穗大粒多等等的一类新株型(NPT)的指导思想(Khush G S. Breaking the yield frontier of rice. Geojournal，1995，35 (3) :329_332)。我国的“水稻超高产育种 计划”实质也离不开株型问题。水稻的单株分蘖数是影响水稻株型的重要因子，而在产量构成的三要素即穗数、 每穗粒数和粒重中，穗数的多少在很大程度上受制于分蘖的发生量，因而分蘖是影响水稻 和小麦等主要农作物单株产量的重要农艺性状之一。水稻分蘖是一个复杂的农艺性状。 一般认为，分蘖数目是受多基因控制的数量性状，其遗传力较低，光照、灌溉、肥料、温度等 都环境因素对它也会有很大影响。Wu等应用动态基因定位法在重组自交系群体中定位 7 5 ^^fiti^j^^ (quantitative trait locus, QTL) (Wu ff R et al. ， Time-Related Mapping of Quantitative Trait Loci Underlying Tiller Number in Rice. Genetics, 1999,151 =297-303) 至今已发现了大量的影响分蘖数目的数量性状位点(QTLs)，但大部 分只是初步定位，只有少部分基因被分离克隆。John Doebley等在1997年利用转座子标 签法分离到一个玉米主茎腋生分枝数相关基因TBI (John Doebley et al. ,The evolution of apical dominance in maize. Nature, 1997,386 485-488 ；Martienssen R. ,The origin of maize branches out. Nature，1997，386 :443.)。SchumacherK 等 1999 年克隆到了控 制番爺侧枝发生基因 LS (Schumacher K et al. , The lateral suppressor (LS) gene of tomato encodes a new member of the VHIID protein family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999,96 =290-295) 2003年Greb T等克隆到拟南芥的侧枝抑制基因LAS (Greb T et al. , Molecular analysis of the LATERAL SUPPRESSOR gene in Arabidopsis reveals a conserved control mechanism for axillary meristem formation. Genes Dev. , 2003, 17 :1175-1178.)。而水稻分蘖控制基因M0C1的克隆是近年来在植物形态建成特别是侧枝 形成研究领域中最重要的进展之一 (Li et al. ,Control of tillering in rice. Nature, 2003,422 :618-621)。此外，株高、穗大小、成穗率、茎杆强度、分蘖角度和叶片夹角等也是衡
3量水稻等农作物株型的指标。研究表明，编码小分子RNA的基因miR156在拟南芥、玉米、水稻生长发育过程中 发挥着重要的作用。组成型超量表达miR156基因，植株顶端优势变弱，花器官发育异常， 花序(穗)变小，株高矮化，分枝增多，加速叶片生长速度和叶片数量形成一个丛生的表 型，延缓生长发育过程，推迟开花等(Xie et al.，Genomic organization, differential expression, and interaction of SQUAMOSA promoter—binding—like transcription factors and microRNA156 in rice. Plant Physiol, 2006，142 :280_293)。由此可见， miR156基因在调控植物的株型方面发挥了重要作用。虽然0Sa-miR156e基因超量表达可以提高水稻的分蘖数，但是分蘖数太多会影 响结实率等性状，难以达到分蘖数适中、育性正常、产量提高的理想株型。同时，组成型超 量表达0Sa-miR156e基因还会影响水稻的穗型，穗型变小，从而造成减产(Xie et al., Genomic organization, differential expression, and interaction of SQUAMOSA promoter-binding-like transcription factors and microRNA156 in rice.Plant Physiol, 2006,142 =280-293)。而GAL4-UAS双因子系统能够实现基因的异位表达 (Liang D et al. , Establishment of a patterned GAL4-VP16 transactivation system for discovering gene function in rice. Plant J, 2006,46 :1059-1072),为了优化 0Sa-miR156e基因的表达模式，本发明通过利用本实验室突变体库中报告基因特异表达的 模式系，创建含有0Sa-miR156e基因的目标系，通过与模式系杂交，实现0sa-miR156e基因 在不同的时空条件下表达，从而培育理想的水稻株型。1999年，Haseloff报道了一种基于GAL4-UAS元件的双因子反式激活系统，将果蝇 中已报道的GAL4-UAS系统引入了拟南芥基因功能研究中(图1)。GAL4-UAS双因子反式激 活系统是指由模式系(pattern lines)和目标系(target lines)组成的基因诱导表达系 统。模式系是由时空特异型或者诱导型的顺式调节因子控制的表达GAL4基因的株系；目 标系则是指带有能与GAL4的特异结合域结合的UAS (upstream activating sequence)序 列和受UAS序列控制的目标基因的株系。仅对双元系统而言，模式系只需要特异表达GAL4 即可，但是为了便于检测GAL4的表达，在GAL4元件后面加入了由UAS元件控制的报告基因 (图1中为绿色荧光蛋白EGFP)，由于UAS元件只与GAL4的特异结合域结合，在没有GAL4 表达的情况下，报告基因不会表达，只有在GAL4存在的情况下，报告基因才会表达，这样就 可以通过检测报告基因的表达情况得知GAL4的表达情况。在目标系中，由于没有GAL4元件，目标基因不会表达。当模式系与目标系杂交后， 杂交F1代中来自目标系的由UAS控制的下游基因将按照模式系中的GAL4表达模式进行表 达(图1)，这样就可以方便地实现目标基因的时空特异表达或者诱导型表达。只要有足够 多的特异表达模式系，理论上任何一个目标基因就可以实现在全生育期中的任何时期或器 官中表达。通过这个系统，只要有了相应的模式系，就可以将目标基因的表达限定于植物生 长的某一特定时期和特定器官甚至细胞中。在植物分子育种工作中，可以将优良性状基因 特异表达于预期的时期和组织、器官或细胞，专一性提高产量及品质；或者将抗虫、抗病基 因特异表达于非食用器官或者那些较易感虫、染病的时期、器官，这样既可以达到抗虫抗病 的目的，又可以减少目标基因不必要的表达，同时提高转基因安全性。
申请人华中农业大学所在的作物遗传改良国家重点实验室创建的水稻T-DNA插 入突变体库，含有GAL4-UAS元件的enhancer trap系统，同时又可以作为模式系使用(Wu 等.，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome. Plant J,2003, 35 418-427 ；Zhang et al. , Non-random distribution of T-DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealedby analyzing 13 804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-trap mutant library. Plant J, 2007,49 =947-959)。目前该突变体库已超过10万个单株的突变体，也筛选到了大量的特异 表达的模式系，为利用GAL4-UAS系统异位表达目标基因提供了重要的材料。为了深入开发miR156基因在调控水稻株型中的作用，培育理想株型的水稻品种， 本发明首次在水稻育种中应用GAL4-UAS异位表达系统调控水稻0Sa-miR156e基因或其同 源基因的表达改良水稻的重要农艺性状，如分蘖数，株高，穗大小，结实率，成穗率等农艺性 状，达到改良水稻株型的目标。本发明采用分子设计育种的方法改良水稻株型，有望在水稻 株型育种中应用，塑造理想株型，达到增产的目的。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种控制水稻株型的方法该方法是在水稻株型改良 中应用GAL4-UAS异位表达系统调控水稻0Sa-miR156e基因或其基因家族的其它同源基因 的表达模式达到调控水稻株型的目的。本发明的另一个目的在于提供一种调控水稻株型的方法在转基因水稻中的应用。本发明第一次采用分子设计育种的方法调控水稻株型，有望在水稻株型育种中应 用，塑造理想株型，达到增产的目的。实现本发明的技术方案如下1、模式系的选择构建模式系所用载体是pEGFP(见图1)，这个载体pEGFP(也是用来构建所述华 中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的大型T-DNA插入突变体库的载体之一(Wu等， Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome. Plant J，2003，35 :418-427)，它采用 enhancer trap 策略并含有 GAL4-UAS 系统。选用 T 3种不同的模式系PI (登录号:04Z11BG74), P2(登录号:04Z11AC22)和P3(登录号 04Z11BK42)，上述模式系材料已在http://rmd. ncpRr. cn/上公开)，它们各自报告基因的 表达模式为P1中绿色荧光蛋白EGFP除了不在花序中表达外，其他部位都表达；P2中绿色 荧光蛋白EGFP只在花序中而不在其他部位表达；P3在所有部位都表达(图2)。2、目标系的构建用来创建目标系的载体是pG0C17(图1)，水稻0sa-miR156基因家族有12个成员 0sa-miR156a-—0sa_miR1561，选0sa_miR156e基因构建到载体pG0C17上，将获得的重组载 体命名为pG0C17-156e。3、遗传转化采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome. Plant J,2003,35 :418_427)将 pG0C17-156e载体导入中花11水稻品种中。
遗传转化结果共得到转化植株(苗)50株，将转化获得的植株命名为T156e。3、目标系与模式系杂交，对水稻株型的改良。选取表型正常的阳性单株(目标系)与模式系杂交。T156e/Pl的F1代植株株型发生改变，特别是株高变矮，分蘖增多(图3a，图4)。T156e/P2的F1代植株表型没有变化，说明0Sa-miR156e在花序中表达不影响水稻 株型(图3b，图4)。T156e/P3的F1代植株株型发生改变，株高变矮，分蘖增多(图3c，图4)。GAL4-UAS异位表达系统能够准确的调控目标基因0Sa-miR156e表达，最终达到控 制水稻株型的目的。本发明的优点和效果1、本发明是首次在水稻育种中应用GAL4-UAS异位表达系统调控水稻 0Sa-miR156e基因的表达模式，来控制水稻株型。2、GAL4-UAS异位表达系统，同样可以用于改良水稻的其它重要农艺性状，在水稻 分子设计育种中应用。3、本发明第一次采用分子设计育种的方法改良水稻株型，有望在水稻株型育种中 应用，塑造理想株型，达到增产的目的。
图1 是本发明的pEGFP载体和构建的pG0C17_156e重组载体2 目标系(T156e)和3种模式系的杂交F1代中EGFP(图左)和⑶SPlus(图 右)的表达模式，检测了 6种部位从上到下为根，茎，叶，叶鞘，分蘖芽和花。(a)为T156e/ PI, (b)为 T156e/P2， (c)为 T156e/P3。图3 野生型(图左)和F1代(图右)植株的表型，T156e/Pl (a)，T156e/P2 (b) and T156e/P3(c)。图4株高(图4a)和单株分蘖数(图4b)统计，从左到右为野生型，T156e/Pl, T156e/P2and T156e/P3。
具体实施例方式实施例1水稻模式系的选择和目标系的构建本发明克隆的0Sa-miR156e基因超量表达可以提高水稻的分蘖数，但是分蘖数太 多影响结实率，也不能形成理想的株型，而且组成型表达0Sa-miR156e基因同时还会影响 水稻的穗型和育性，过量表达0Sa-miR156e基因会使穗型变小，育性降低甚至不育，从而造 成减产。所以通过寻找特异表达的模式系，将上述目标系和模式系进行杂交，通过GAL4-UAS 元件的双因子反式激活系统调控0Sa-miR156e的表达模式和表达量，改良水稻株型，并在 植物育种中应用。1、模式系的选择构建模式系所用载体是pEGFP (图1)，这个载体pEGFP也是用来构建华中农业大 学作物遗传该了重点实验室大型T-DNA插入突变体库的载体之一，它采用enhancer trap 策略(ffu ^ . ,Development of enhancer trap lines for functional analysis of therice genome. Plant J，2003，35 :418_427)并含有 GAL4-UAS 系统(Wu 等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome. Plant J,2003,35 418-427)。选用了 3种不同的模式系P1(登录号04Z11B674)，P2(登录号:04Z11AC22)和 P3(登录号:04Z11BK42),上沭樽式系材料已在httD://rmd. ncpgr. cn/上公开)，它们各自 的表达模式为P1除了不在花序中表达EGFP，其他部位都表达；P2正好相反，只在花序中而 不在其他部位表达；P3是在所有部位都表达(图2)。2、目标系的构建用来创建目标系的载体是pG0C17(图1)，水稻0sa-miR156基因家族有12个成员 0sa-miR156a-—0sa_miR1561，选其中的0sa_miR156e为目标基因(其核苷酸序列见SEQ ID NO 1所示)构建到pG0C17上，将获得的重组载体命名为pG0C17-156e。pG0C17-156e载体的具体构建过程引物设计TERR2-SacI 5' CTTGAGCTCgccaagcttgcatgcctgcag 3，，其中下划线为酶切位点。0sa-miR156e-R-KpnI 5' CTTGGTACCtaaatccactggccggtgg 3，，其中下划线为酶切 位点。PCR反应体系的总体积为 50ii l，pUmiR156e 质粒(Xie 等，Genomic organization, differential expression, and interaction of SQUAMOSA promoter-binding-like transcription factors and microRNA156 in rice. Plant Physiol,2006,142 280-293) liU (约lOOng)作为PCR扩增的模板、LA Taq酶0. 5 yl (购自宝生物工程(大连) 有限公司)、2XGC buffer I 25 u l,2mM dNTP 8 ii l、10uM 引物各 2 ii 1、力口 ddH20 至 50 ii 1。反应程序为94°C变性 3min，94°C 45s、52°C 70s、72°C 90s、35cycles，72 °C 延伸 7min,扩 2 管。扩增片段纯化回收收集PCR产物于1. 5ml离心管纯化，加等体积24 1氯仿异 戊醇，轻摇5分钟，12000rpm离心15分钟，吸上清，加2倍体积95%乙醇，1/10体积3M醋酸 钠(PH5. 2)，_201放置30分钟，12000印111离心20分钟，弃上清，加500111 75%乙醇放置 5min，12000rpm离心5分钟，弃上清，晾干，加75 u 1 ddH20溶解。酶切和纯化回收把纯化的PCR产物及pG0C17载体酶切，体系总体积100 yl， PCR产物或载体质粒75iU，限制性内切酶SacI 30U，限制性内切酶Kpnl 30U，10XL buffer lOiU，加ddH20到100iil，37°C酶切5小时。纯化酶切产物，方法同上，最后加lOiil ddH20溶解。连接反应10iil PCR酶切纯化产物全部用于连接反应，pG0C17载体0.5 iil，2U T4连接酶，5Xbuffer3 yl，总15 yl体积，连接24小时。取1 yl连接产物，电压1800V，电 转到大肠杆菌DH10B，加800 u 1 LB,复苏45分钟，取200 u 1涂于含卡那霉素(工作浓度为 50微克/毫升)。的LA平板，37°C，过夜。挑单克隆，扩大培养抽质粒，酶切验证结果正确，酶 切方法同上。PCR验证，体系程序同上。挑阳性克隆，把构建好的载体pG0C17-156e电转(电 压1800V)农杆菌EHA105，抽质粒，PCR验证，挑选正确克隆，取750iU含构建好载体的农杆 菌菌液加等体积的50%甘油混勻，-70°C保存。构建好的重组载体命名为pG0C17-156e。遗传转化采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Wu等，Development of enhancer trap
7lines for functional analysis of the rice genome. Plant J,2003,35 :418_427)将 pG0C17-156e重组载体导入中花11水稻品种中。农杆菌介导的遗传转化的具体步骤如下1)愈伤组织诱导(1)将成熟的水稻种子(中华11号)去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟， 0. 15%氯化汞处理15分钟；(2)用灭菌水洗种子4-5次；(3)将种子放在诱导培养基上；(4)置于黑暗处培养5周，温度25_27°C。2)愈伤组织继代挑选亮颜色黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，置于继代培养基上黑暗下培 养2周，温度25-27 °C。3)预培养挑选结构紧实且相对干燥的胚性愈伤组织，置于预培养基上黑暗下培养4天，温 度 25-27 °C。4)农杆菌培养(1)在带有卡那霉素(工作浓度为50微克/毫升)的LA培养基上预培养含构建 好载体pG0C17-156e的农杆菌EHA105两天，温度28°C ；(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28°C摇床上培养2-3小时。5)农杆菌侵染(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；(2)调节农杆菌的悬浮液至0D6QQ 0. 8-1. 0 ；(3)将愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；(4)转移愈伤组织至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度 19-20°C。6)愈伤洗涤和选择培养(1)用灭菌水洗涤愈伤组织至看不见农杆菌；(2)将愈伤组织浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30分钟；(3)转移愈伤组织至灭菌好的滤纸上吸干；(4)转移愈伤组织至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。筛选标记为潮霉 素。(抑制农杆菌用头孢霉素，第一次头孢霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)。7)分化(1)将抗性愈伤组织转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天；(2)转移预分化培养的愈伤组织至分化培养基上，于光照2000 lx下培养，温度 26°C，培养5-7周。8)生根(1)拔出分化好的转基因植株，剪掉分化时产生的根；(2)然后将转基因植株转移至生根培养基中光照2000 lx下培养2-3周，温度 26 °C。9)移栽
洗掉转基因植株根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最 初的几天保持水分湿润。共计获得转化苗50株，命名为T156e。实施例2GAL4-UAS异位表达系统调控0Sa-miR156e表达模式控制水稻株型。选取表型正常的阳性单株(目标系)与模式系杂交。从T156e与P1杂交的18个F1代单株中，检测到2株⑶SPlus和EGFP同时表 达的单株，而且它们的表达模式相同(图2a)，从图1我们知道目标基因0Sa-miR156e 和⑶SPlus，EGFP的表达模式是相同的，因为他们都是在UAS的调控下表达(Liang等， Establishment of a patterned GAL4-VP16 transactivation system for discovering gene function in rice. Plant J，2006，46 :1059-1072)，可以推断出 0sa_miR156e 除了不 在花序中表达，其它部位都表达。然后我们考察了这2个单株的表型，结果也证实了这点， 它们的株型发生改变，特别是株高变矮，即从株高113. 00cm降低到株高82. 40cm,分蘖增 多，即从16. 20个提高到33. 40个，明显的改变了水稻株型(图3a，图4)。从T156e与P2杂交的20个F1代单株中，检测到3株⑶SPlus和EGFP同时表达 的单株，而且它们的表达模式相同(图2b)，即只在花序中而不在其它部位表达。3个单株 的表型没有变化，说明本发明克隆的0Sa-miR156e基因在花序中表达不影响水稻株型(图 3b，图 4)。从T156e与P3杂交的15个F1代单株中，检测到2株⑶SPlus和EGFP同时表达 的单株，而且它们的表达模式相同(图2c)，即在所有部位都能检测到GUSPlus和EGFP的表 达。2个单株的株型发生突变，特别是株高变矮，从113. 00cm降低到97. 40cm，分蘖增多从 16. 20个提高到30. 00个，水稻株型获得了显著的改变(图3c，图4)。附录农杆菌介导的遗传转化试剂和配方(1)试剂和溶液缩写6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)； NAA(Napthalene acetic acid,萘乙酸)；IAA(Indole-3_acetic acid,吲哚乙酸)；2， 4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二) ；AS (Acetosringone, Z^MT 香酮)；CH (Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)； DMS0 (Dimethyl S ii lfoxide，二甲基亚砜)；N6max (N6 大量成分溶液)；N6min (N6 小量成分 溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmin (MS小量成分溶液)(2)组织培养的溶液配方1) N6max 母液[10 倍浓缩液(10X)]硝酸钾(KN03)28. 3g磷酸二氢钾(KH2P04)4. 0g硫酸铵((NH4)2S04)4. 63g硫酸镁(MgS04 7H20) 1. 85g氯化钙(CaCl2 2H20) 1. 66g逐一溶解，然后在20_25°C下定容至1000ml。2)N6min 母液[100 倍浓缩液(100X)]碘化钾(KI)0. 08g
硼酸(H3B03)0. 16g硫酸锰(MnS04 4H20) 0. 44g硫酸锌(ZnS04 7H20) 0. 15g在20-25 °C下溶解并定容至1000ml。3)Fe2EDTA 贮存液(100X)在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeS04 7H20) 2. 78g在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70°C，然后加入乙二铵四乙酸二 钠(Na2EDTA 2H20) 3. 73g在它们都溶解后混合在一起，70°C水浴中保持2小时，定容至1000ml，4°C保存备用。4)维生素贮存液(100X)烟酸(Nicotinicacid)0. lg维生素B1 (Thiamine HC1)0. lg维生素B6(Pyridoxine HC1) 0. lg甘氨酸(Glycine)0. 2g肌醇(Inositol)lOg加水定容至1000ml，4°C保存备用。5)MSmax 母液(10X)硝酸铵(NH4N03)16. 5g硝酸钾19. Og磷酸二氢钾1.7g硫酸镁3. 7g氯化钙4. 4g在20-25 °C下溶解并定容至1000ml。
0124]6)MSmin 母液(100X)
0125]碘化钾0.083g
0126]硼酸0.62g
0127]硫酸锰(MnS04 4H20)2. 23g
0128]硫酸锌(ZnS04 7H20)0. 86g
0129]钼酸钠(Na2Mo04 2H20) 0. 025g
0130]硫酸铜(CuS04 5H20)0. 0025g
0131]氯化钴(CoCl2 6H20)0. 0025g在20-25 °C下溶解并定容至1000ml。7)2，4-0贮存液(111^/1111)2. 4-D lOOmg.lml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在 20-25 °C下保存。8)6_BA 贮存液(lmg/ml)6-BA lOOmg.
10
lml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在 20-25 °C下保存。9) NAA 贮存液(lmg/ml)NAA lOOmg.lml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4°C保
存备用。10) IAAC存液(lmg/ml)IAA lOOmg.lml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4°C保
存备用。11)葡萄糖贮存液(0. 5g/ml)葡萄糖125g蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4°C保存备用。12) AS 贮存液AS 0. 392gDMSO 10ml分装至1. 5ml离心管内，4°C保存备用。13) IN氢氧化钾贮存液氢氧化钾 5. 6g蒸馏水溶解定容至100ml，在20-25 °C下保存备用。14) KT 贮存液(lmg/ml)KT lOOmg.lml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在 20-25 °C下保存。(3)培养基配方1)诱导培养基N6max 母液(10X)100mlN6mix 母液(100X)10mlFe2+EDTA 贮存液(100X) 10ml维生素贮存液(100X) 10ml2，4-DC存液2.5ml脯氨酸(Proline)0. 3gCH0. 6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸(100°C )并定容至1000ml， 分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。2)继代培养基N6max 母液(10X)100ml
11
N6mix 母液(100X)10ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)10ml
维生素贮存液(100X)10ml
2，4-D贮存液2. 0ml
脯氨酸0. 5g
CH0. 6g
蔗糖30g
Phytagel3g
加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸(100°C )并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
3)预培养基
N6max 母液(10X)12. 5ml
N6mix 母液(100X)1. 25ml
Fe2+EDTA 贮存液(100X)2. 5ml
维生素贮存液(100X)2. 5ml
2，4-D贮存液0. 75ml
CH0. 15g
蔗糖5g
琼脂粉(Agarose)1.75g
0190]加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。
0191]使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 u 1 AS贮存液，分装倒入
培养皿中(25ml/皿)。4)共培养基N6max 母液(10X)12.5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml2，4-DC存液0.75mlCH0. 2g蔗糖5g琼脂粉1. 75g
0201]加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。
0202]使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 u 1 AS贮存液，分装倒入
培养皿中(25ml/皿)。5)悬浮培养基N6max 母液(10X)5mlN6mix 母液(100X)0. 5mlFe2+EDTA 贮存液(100X) 0.5ml维生素贮存液(100X)lml
2，4-D贮存液0．2ml
CH0．08g
蔗糖2g
加蒸馏水至lOOml，调节pH值到5．4，分装到两个lOOml的三角瓶中，封口灭菌。
使用前加入lml葡萄糖贮存液和100 u l AS贮存液。
6)选择培养基
N6max母液(IOX)25ml
N6mix母液(IOOX)2．5ml
Fe“EDTA贮存液(IOOX)2．5ml
维生素贮存液(IOOX)2．5ml
2，4-D贮存液0．625ml
CH0．15g
蔗糖7．5g
琼脂粉1．75g
加蒸馏水至250ml，调节pH值到6．0，封口灭菌。
使用前溶解培养基，加入250 u l 50mg／ml的潮霉素和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml／皿)。
7)预分化培养基
N6max母液(IOX)25ml
N6mix母液(IOOX)2．5ml
Fe“EDTA贮存液(IOOX)2．5ml
维生素贮存液(IOOX)2．5ml
6一BA贮存液0．5ml
KT贮存液0．5ml
NAA贮存液50 u l
IAA贮存液50 u l
CH0．15g
蔗糖7．5g
琼脂粉1．75g
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5．9，封口灭菌。
使用前溶解培养基，加入250 u l 50mg／ml的潮霉素和400ppm头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml／皿)。
8)分化培养基
N6max母液(IOX)lOOml
N6mix母液(IOOX)lOml
Fe“EDTA贮存液(IOOX)lOml
维生素贮存液(IOOX)lOml
6一BA贮存液2ml
K／贮存液2m1
NAA C存液0. 2mlIAA C存液0. 2mlCHlg蔗糖30gPhytagel 3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到6. 0。煮沸(100°C )并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。9)生根培养基MSmax 母液(10X)50mlMSmix 母液(100X)5mlFe2+EDTA 贮存液(100X)5ml维生素贮存液(100X)5ml蔗糖20gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 8。煮沸(100°C )并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。
10) LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)蛋白胨2. 5g酵母粉1. 25g氯化钠2. 5g琼脂粉3. 2g蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后20_25°C保存备用。
1权利要求
一种调控水稻株型的方法，其特征在于，利用GAL4 UAS异位表达系统调控水稻Osa miR156e基因的表达模式，达到控制水稻株型的目的，所述的Osa miR156e基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及一种调控水稻株型的方法，其特征在于通过GAL4-UAS异位表达系统调控水稻Osa-miR156e基因，或其基因家族的其它同源基因Osa-miR156a-Osa-miR156l，或其功能类似物的表达模式达到改良水稻株型的目的。所述的Osa-miR156e基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，本发明采用GAL4-UAS两因子系统调控水稻株型，有望在水稻株型育种中应用，塑造理想株型，达到增产的目的。
文档编号C12N15/29GK101974559SQ201010263800
公开日2011年2月16日 申请日期2010年8月25日 优先权日2010年8月25日
发明者吴昌银, 张启发, 陈志辉 申请人:华中农业大学