专利名称：提高水稻磷吸收效率的基因及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种提高水稻磷吸收效率的基因 0sa-miR399k,同时涉及该基因在转基因水稻中的应用。本发明采用反向遗传学的方法，分 离克隆了提高水稻磷吸收效率基因0sa-miR399k，通过超量表达0sa-miR399k基因，使转基 因水稻出现磷吸收效率提高的表型，证实了该基因具有提高水稻磷营养吸收的功能。本发 明还涉及该基因家族0sa-miR399的其它成员例如0sa_miR399a-—0sa_miR399k，以及含有 其核心序列5’ tgccaaaggaaatttgccccg 3’的其它DNA片段或与其核心序列对比不超过5 个碱基变异的其它DNA片段或其它物种的同源基因的载体或涉及利用该基因或其功能类 似物提高植物磷吸收效率，从而减少磷肥的施用量，促进植物在低磷土地上生长。
背景技术：
水稻作为重要的粮食作物，世界上三分之一以上的人口以其为主食。同时，由于水 稻具有基因组小、精细的遗传和物理图谱、相对容易的转基因技术及与其它禾本科作物的 共线性，而被视做模式植物。为解决人口增长与耕地面积减少的矛盾，提高水稻单位面积 产量仍是人们面临的挑战。土壤中部分营养元素的缺乏是限制水稻产量提高的因素之一。 磷是作物生长发育所必需三大营养元素之一，是继氮之后为植物体所吸收的第二大营养元 素，在植物光合作用、呼吸作用和生理生化的调节中具有重大作用。但由于土壤中的磷大部 分被其中的镁、铁、铝氢氧化物及钙盐所固定或被土壤胶体吸附而成为无效态(难溶性)， 以及磷有机复合体的形成，使得世界上30% -40%耕地的有效磷含量不能满足植物体正常 生长发育的需要。即使施以磷肥，磷肥的当季利用率也只有10% 25%。因此，磷缺乏成为 限制作物产量重要的因素之一。大量施用磷肥是解决土壤缺磷问题、维持和提高产量的传 统途径，然而却造成了资源浪费、环境污染、农业生产成本增加等系列问题。更为严峻的是， 磷肥的主要来源磷矿石，是一种不可再生资源。据估计我国高品质磷矿资源可用年度不足 10年。因此，发掘作物自身磷高效利用的潜力、选育磷高效作物品种、提高磷肥利用率，是改 善作物磷素营养状况、减少磷肥施用、生物修复土壤污染、提高作物产量的更为经济、环保、 长远的途径。植物对磷吸收利用是一个复杂的过程，为了提高植物对土壤中磷的利用效率，植 物在进化过程中形成了许多适应机制如扩大根系面积来增加对土壤磷的利用；通过和菌 根形成共生关系获取磷元素；植物还通过调节新陈代谢来保持磷的动态平衡，如把老叶中 磷转运到新叶中等方式重复利用植物体内的磷元素，从而保持植物体内和细胞内磷的动态 平衡；同时植物为了适应低磷条件还通过调控基因的表达水平，包括上调磷饥饿诱导基因 以及下调新陈代谢相关的基因，如一些光合作用相关基因来维持生长发育；植物甚至通过 分泌磷酸酶、核酸酶以及有机酸促进吸收土壤中的磷。高等植物在吸收磷酸盐的时候，磷酸盐首先进入表皮和皮层的质外体，然后在 磷酸盐转运子的作用下跨膜进入共质体，再经木质部输送到地上部分，从而分配到不 同器官。高等植物同时具有两种吸收系统一类是组成型表达的低亲和力系统(Pi LowAffinity Transporter)，生长环境中磷供应充足时，磷的吸收就靠这一吸收转运系统， 同时它可能也参与植物体内磷元素的传导；另一类是高亲和力系统(Pi High Affinity Transporter)，是磷饥饿诱导表达的系统，以便有效吸收低浓度的有效磷。(刘芳，2010，水 稻中0sPHR2调控磷酸盐转运子0SPT2的分子和遗传分析。博士论文，华中农业大学)。第一个编码植物磷酸盐转运蛋白(PTs)的基因(AtPTl和AtPT2)是从拟南芥中 分离出Jfe白勺(Muchhal et al. 1996, Phosphate transporters from the higher plant Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad SciUSA 93:10519—10523)。 ；tM，^Cfi白勺 PTs — 因从各种各样的植物家族中被鉴定出，包括禾本科，豆科以及茄科。根据其不同的特征分为 Phtl、Pht2和Pht3三个家族。迄今为止，克隆到的植物磷酸盐转运蛋白基因基本上归属于 Phtl和Pht2两大家族。其中，绝大部分属于H2P047nH+共运体的Phtl家族。到目前为止，在水稻中已鉴定了 13个磷酸盐转运蛋白0sPTl-0sPT13。这些蛋白在 水稻植株中对磷素的吸收和转运起着至关重要的作用，其中大部分的磷酸盐转运蛋白基因 主要或者只在根部，受低磷环境或丛枝菌根真菌的侵染强烈诱导表达。OsPTl是组成型表 达，0sPT2和0sPT6是受低磷胁迫诱导在根部表达最强的两个Phtl家族蛋白，同时在叶中 也有较弱表达。0sPT6是高亲和力转运子，在植物的磷吸收和转运方面起着较为广泛的作 用，而0sPT2是一个低亲和力转运子，负责转运植物植物体内储存的磷。OsPTll和0sPT13 的表达受菌根诱导。到目前为止，对0sPT3、0sPT4、0sPT5、0sPT7、0sPT8、0sPT9、OsPTlO和 0sPT12的报道还非常少。其中0sPT4、0sPT7、0sPT8和0sPT12也是受低磷胁迫的诱导在根 部表达，而0sPT3和0sPT5的表达不受外界磷环境的影响，在水稻根和叶中都无表达(高佳 等，水稻磷酸盐转运蛋白Phtl家族研究进展。中国农学通报，2009，25 (15) :31_34)。磷酸盐转运基因表达受上游基因的调控，AtPHRl在拟南芥的磷信号系统中起着 关键作用。AtPHRl的功能缺失体导致几个磷饥饿诱导基因如AtlPSl，AtRNSl和At4的 表达量的降低，并在叶部积累花青素，这是拟南芥缺磷的明显症状(Ragh0thama，1999， Phosphate Acquisition. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50 :665_693)。而超表 达AtPHRl导致拟南芥中过量积累磷。已有人提出存在于拟南芥磷饥饿信号路径的调节系 统(Schachtman and Shin,2007,Nutrient sensing and signaling :NPKS. Annu Rev Plant Biol, 2007, 58 47-69)。在这个调节系统中，AtPHRl被一个依赖AtSIZl的过程SUMO化修 饰。AtSIZl是一个植物小类泛素修饰(SUMO)E3连接酶，主要控制磷饥饿反应。AtPHRl调 控下游Mt/TPSIl家族或PH02基因，再通过它们调控下游的磷酸盐转运基因。同时AtPHRl 还可以直接调控磷酸盐转运基因。(刘芳，2010，水稻中0sPHR2调控磷酸盐转运子0SPT2的 分子和遗传分析。博士论文，华中农业大学)。磷的吸收和体内代谢是一个复杂的生化过程，对植物磷酸盐吸收以及运输的机制 还有待进一步的认识，才能为生产上选育耐磷胁迫、优质高产的品种奠定基础。本发明采 用反向遗传学的方法，分离克隆了提高水稻磷吸收效率基因0sa-miR399k，通过超量表达 0sa-miR399k基因，使转基因水稻出现提高磷吸收效率的表型，证实了该基因的功能。本 基因的克隆和转基因运用，有望应用于水稻磷高效育种中，减少磷肥施用、降低农业生产成 本，提高作物产量，还有利于生态保护环境。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种提高水稻磷高效利用基因0sa-miR399k(基因登 录号:MI0001063, http //www. mirbase. org/)，其核苷酸序列如 SEQ. ID. NO 1 所示的核苷 酸序列，或该基因家族0sa-miR399其它成员0sa_miR399a-—0sa_miR399k，以及含有其核 心序列5’ tgccaaaggaaatttgccccg 3’的其它DNA片段或包含有与其核心序列对比不超过 5个碱基变异的其它DNA片段。本发明的另一个目的在于提供一种提高水稻磷吸收效率基因0sa-miR399在转基 因水稻中的应用。本发明的再一个目的在于提供一种提高水稻磷吸收效率基因0sa-miR399在转基 因水稻植株培育中的应用。通过提高0sa-miR399基因或其功能类似基因在水稻中的表达 量来提高水稻磷吸收效率，也可以通过0sa-miR399基因在特定时空的表达提高水稻磷吸 收效率。本基因的克隆还对阐明0sa-miR399基因家族的生物学功能有重要意义以及植物 对磷吸收的分子机理研究有重要的推动作用。实现本发明的简要过程如下1.超表达载体构建水稻中0sa-miR399家族共有11个成员，即0sa-miR399a-0sa_miR399k，其剪切出 的成熟miRNA序列基本相同。选其中的一个成员0sa-miR399k来构建超表达载体，研究其 功能。0sa-miR399k编码的小分子RNA序列如下0sa_miR399k 5' ugccaaaggaaauuugccccg 3'采用用PCR方法，直接从水稻基因组中扩增0sa-miR399k的前体基因组序列，其核 苷酸序列如SEQ. ID. NO 1所示。设计的PCR引物序列是miR399k_F(BamHI)5， CAAGGATCCacattctccttcaacaatRR 3，miR399k-R (KpnI) 5，AGAGGTACCRaaaRtctRaaaccaRtRRa 3，按PCR反应-酶切-连接反应-电转化-挑单克隆-酶切验证-PCR验证-测序 验证的程序构建至转化载体PU1301上(图1)。 经过测序验证正确的质粒命名为pUmiR399k，经电转化到农杆菌EHA105中，抽提质粒， PCR验证，取750μ 1含构建好载体的农杆菌菌液加等体积的50%甘油混勻，于-70°C保存。2.遗传转化采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome. Plant J, 2003, 35 :418_427)将超 表达载体pUmiR399k导入中花11号水稻品种中，转基因植株命名为0sa-miR399_0X。遗传转化结果共得到转化苗40株。转基因植株PCR阳性检测检测结果40株转化苗35棵阳性，5棵阴性，阳性率为87. 5% (图2)。3. TO代转基因植株磷吸收效率提高与转基因共分离在40株TO代转化苗中，转基因阳性单株出现磷吸收效率提高，叶片末端出现磷累 积的表型。而转基因阴性单株没有出现磷累积的表型(图3，图4)。4. Southern杂交检测TO代拷贝数
采用Southern杂交的方法检测转基因的拷贝数，结果见图5，图中第3、9、16、19泳 道为转基因单拷贝。5. Tl代转基因植株磷吸收效率提高与转基因共分离选其中的1个单拷贝种植下一代(Tl代)，出现3 1分离，转基因阳性单株中P 含量高，叶片末端出现磷累积的表型。阴性单株P含量正常，表型无变化。说明Tl代转基 因植株与P含量提高是共分离的(图6)。6.不同P浓度胁迫处理，转基因植株磷吸收效率提高水培肥料采用国际水稻研究所(IRRI)配方。总共设置8种P浓度梯度(正常P的浓度为1\朽，分别是3XP、2XP、1XP、 1/2 XP、1/4XP、1/8 XP、1/10 XP和1/50 XP培养转基因植株和对照中花11号，采用连续流 动注射法测定植物样品中的全磷(见附录2)。试验结果表明在3XP、2XP、1XP的条件 下，转基因阳性单株磷吸收效率提高，叶片末端出现磷累积的表型。但在1/2XP、1/4XP、1/8XP、1/10XP和1/50XP培养条件下，转基因植株与对照 品种中花11号没有明显的表型差异。说明在高磷浓度中转miR399k基因的植株磷吸收效 率比对照品种提高(图7，图8)。本发明的优点和效果1.本基因的克隆对阐明0sa-miR399基因家族的生物学功能有重要意义以及植物 对磷吸收的分子机理研究有重要的推动作用。2.通过提高0sa-miR399基因或其功能类似基因在水稻中的表达量来提高水稻磷 吸收效率。3.同时还可以通过特异表达启动子调控0sa-miR399的不同时空表达模式(如只 在根中表达等)更加有效的吸收利用磷。4. 0sa-miR399基因的克隆有望在水稻磷高效育种中应用，减少磷肥施用、降低农 业生产成本，提高作物产量，还有利于保护环境。
图1. pU1301载体图，携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素启动子。图2. TO代阳性检测胶图，40株转化苗35棵阳性，5棵阴性(红色箭头表示)， 87. 5%阳性率。图3.为TO代转化植株表型，第1个为阴性植株，第2至6号单株为转pUmiR399k 的阳性单株，表现为叶片中不同程度的磷累积。图4.为TO代转化子叶片出现磷累积，左边为阴性对照，右边为阳性转基因植株。图5Southern检测转基因植株拷贝数，图中第3、9、16、19泳道为单拷贝。图6. Tl代表型共分离，选1个TO代单拷贝种植下一代(Tl)，出现3 1分离，阳 性单株为1，3，4，6，8，9，10的P含量高，叶片出现磷积累表型。阴性单株2，5，8的P含量正 常，表型正常。说明Tl代也是共分离。图7.连续流动注射法测定植物样品中的全磷在2XP和IXP胁迫时转基因阳性植株叶片出现磷积累表型。2XP胁迫时，超表 达单株与对照比，在根中的P含量没有差异，在老叶和新叶中超表达单株都比对照高，说明超表达单株吸收P的能力比对照强。1X P胁迫时，超表达单株与对照比，在根中的P含量没 有差异，在老叶和新叶中超表达单株都比对照高，说明超表达单株吸收P的能力比对照强。 超表达单株老叶中P含量比对照高出近10倍，P在老叶中聚集。在1/10XP和1/50XP胁迫时超表达单株与对照比没有明显差异，根、老叶和新叶 P含量都低，都出现缺P症状。图8. 5 种 P 胁迫处理 3XP、1XP、1/2XP、1/4XP、1/8XP。对照中花 11 号(左边) 转基因阳性植株(右边)。试验结果可以看出在3XP和IXP胁迫中，转基因植株磷吸收效 率提高，叶尖出现磷累积，在1/2XP，1/4XP和1/8XP胁迫条件下转基因植株和对照中花 11号没有明显差别。
图9. Alliance-Futura—流动分析仪全磷模块的分析流程示意图(括号内数字是流 速ml/min)。
具体实施例方式实施例1 分离克隆0sa-miR399基因及遗传转化载体构建在已知的水稻miRNA家族(http://www. mirbase. org/)中选取了 52个家族，每个 家族选其中的一个成员构建超表达载体，并转化水稻品种中花11号(ZHll)，获得了 52个超 表达水稻 miRNA群体。0sa-miR399k (基因登录号MI0001063，http //www. mirbase. org/)， 是其中一个。水稻中0sa-miR399家族共有11个成员，即0sa_miR399a-—0sa_miR399k，其 剪切出的成熟miRNA序列基本相同，它们的核苷酸序列如下所示0sa_miR399a 5' ugccaaaggagaauugcccug 3'0sa_miR399b 5' ugccaaaggagaauugcccug 3'0sa_miR399c 5' ugccaaaggagaauugcccug 3'0sa_miR399d 5' ugccaaaggagaguugcccug 3'0sa_miR399e 5' ugccaaaggagauuugcccag 3'0sa-miR399f 5' ugccaaaggagauuugcccag 3'0sa_miR399g 5' ugccaaaggagauuugcccag 3'0sa_miR399h 5' ugccaaaggagacuugcccag 3'0sa_miR399i 5' ugccaaaggagagcugcccug 3'0sa_miR399j 5' ugccaaaggagaguugcccua 3'0sa_miR399k 5' ugccaaaggaaauuugccccg 3'选其中的一个成员0sa_miR399k构建超表达载体，0sa_miR399k前体序列为5’ AGCUGCAUUGCUGGGCAA⑶UGUCCUUUGGCAGAU⑶UGCAGUUCAUCAUCGAUGCCUGGGG⑶UAC CAGACUACUGCCAAAGGAAAUUUGCCCCGGAAUUCAUCU 3’。
列
0sa-miR399k前体序列形成的径环结构如下下划线部分为成熟0sa-miR399k序
ccgugauguugcaguucaucaucg
5' ag ug auu c gggcaaguu uccuuuggcaga
I Il III I lllllll lllllllllU
3， uc ac uaa r CCCRuuuaa aRRaaaccRUcg
7
uu g c-aucagaccauugggggucc所用转化载体是本申请人所在的华中农业大学作物遗传改良重点实验室构建的 pU1301。pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice, encoding a LRR receptor kinase-like protein. Plant Journal. 37 :517_527)基础上改建的，携带具 有组成型和超量表达特征的玉米泛素启动子的农杆菌介导的遗传转化载体(图1)。pCAMBIA1301 载体由澳大利亚 CAMBIA 实验室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture) ； 贝曾。ffi PCR 力夕去，M巾# 11 号基因组DNA为模板，从水稻基因组中扩增得到如序列表SEQ. ID. NO 1所示的目标基因 0sa-miR399k，扩增片段长度为591bp。PCR扩增采用的引物序列为miR399k-F(BamHI)5' CAAGGATCCacattctccttcaacaatgg 3，miR399k-R (KpnI) 5' AGAGGTACCgaaagtctgaaaccagtgga 3，PCR反应反应体系的总体积为20 μ 1，水稻基因组DNA模板1 μ 1 (约50ng)、 IXTaq 酶反应缓冲液、25mM MgCL2 1. 2μ l,2mM dNTP 1. 5 μ 1、IOuM 引物各 0. 2 μ 1、50% 甘 油2μ 1、0. 3单位rTaq酶(Takara公司)，加ddH20至20 μ 1。反应程序为94°C变性5min， 94°C 45s,55°C 45s,72°C lmin、35cycles，72°C 延伸 5min，扩 10 管，收集 PCR 产物于 1. 5ml 离心管纯化，加等体积24 1氯仿异戊醇，轻摇5分钟，12000rpm离心15分钟，吸上清，加 2倍体积95%乙醇，1/10体积3M醋酸钠(PH5. 2)，_20°C放置30分钟，12000rpm离心20分 钟，弃上清，加500 μ 1 75%乙醇放置5min, 12000rpm离心5分钟，弃上清，晾干，加75 μ 1 ddH20溶解。酶切把纯化的PCR产物及pU1301载体酶切，体系总体积100 μ 1，PCR产物或 载体质粒75 μ 1，限制性内切酶BamHl 30U，限制性内切酶Kpnl 30U, 10ΧΚ buffer 5μ 1, ddH20 16μ1，37 酶切5小时。纯化酶切产物，方法同上，最后加10 μ 1 ddH20溶解。连接反应10μ1 PCR产物全部用于连接反应，载体0. 5μ1，2υ Τ4 ligase, 5Xbuffer 3 μ 1，总15 μ 1体积，连接24小时。电转取1μ 1连接产物，电压1800V，电转到大肠杆菌DH10B，加800μ 1 LB，复苏 45分钟，取200 μ 1涂于含卡那霉素(工作浓度为50微克/毫升)的LA平板，37 °C，过夜。 挑单克隆，扩大培养抽质粒，酶切验证，酶切方法同上。PCR验证，体系程序与从水稻基因组 扩目标基因相同。挑阳性克隆，抽质粒测序验证。测序验证测序引物为TEV 5，cgaatc tcaagc aatcaa gcat 3，。测序结果完全 正确。把测序验证正确的质粒载体电转农杆菌EHA105，抽质粒，PCR验证，取750 μ 1含 构建好载体的农杆菌菌液加等体积的50%甘油混勻，-70°C保存。将构建好的载体命名为 pUmiR399k。实施例2 :0sa-miR399基因的功能验证和应用1.转基因植株的获得采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Wu et al. ,Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome. Plant J, 2003,35 418-427)将超表达载体导入正常中花11水稻品种，将转化苗命名为0sa-miR399-0X。具体遗传转化 的试剂及培养基配方见附录1，农杆菌介导的遗传转化步骤如下1)愈伤诱导(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0. 15%氯化汞 (HgCl2) 15 分钟；(2)灭菌水洗种子4-5次；(3)将种子放在诱导培养基上；(4)置于黑暗处培养5周，温度25-27°C。2)愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温 度 25-27 0C ο3)预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4天，温度 25-27 °C。4)农杆菌培养(1)在带有卡那霉素的LA培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA105两天，温 度 28 0C ；(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28°C摇床上培养2-3小时。5)农杆菌侵染(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；(2)调节农杆菌的悬浮液至OD6tltl 0. 8-1. 0 ；(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度 19-20 "C。6)愈伤洗涤和选择培养(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；(2)浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30分钟；(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。筛选标记为潮霉素。(抑制 农杆菌用头孢霉素，第一次头孢霉素筛选浓度为400ppm，第二次以后为250ppm)7)分化(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天；(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照(20001x)下培养，温度26°C， 5-7 周。8)生根(1)拔出分化好的苗子，剪掉分化时产生的根；(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26°C。9)移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保
9持水分湿润。遗传转化结果共得到转化苗40株。遗传转化植株PCR阳性检测检测结果40株转化苗35棵阳性，5棵阴性，87. 5%阳性(图2)。针对转化载体上⑶S基因设计的PCR引物为GUSF :5，ACGACTCGTCCGTCCTGTAGAA 3，GUSR :5，CGGTTCGTTGGCAATACTCC 3，反应体系的总体积为20 μ 1，水稻基因组DNA模板1 μ 1 (约50ng)、1 X Taq酶反 应缓冲液、25mM MgCL2 1. 2μ l,2mM dNTP 1. 5 μ 1、IOuM 引物各 0. 2 μ 1、0. 3 单位 rTaq 酶 (Takara 公司)，加 ddH20 至 20 μ 1。反应程序为94 °C 变性 3min，94 °C 45s、55 °C 45s、 72°C lmin、35CyCles，72°C延伸5min。0. 8%琼脂糖胶电泳，EB染色，凝胶成像系统拍照。2. TO代转基因植株磷吸收效率提高与转基因共分离在40株TO代转化苗中，转基因阳性单株磷吸收效率提高，叶片末端出现磷累积的 表型。而转基因阴性单株没有出现磷累积的表型(图3，图4)。图3为TO代转化植株表型，第1个为阴性植株，第2至6号单株为转pUmiR399k 的阳性单株，叶片表现出不同程度的磷累积，从弱到强。图4显示转基因阳性单株叶片(右 边)末端出现磷积累，而阴性对照单株叶片(左边)表现正常。3. Southern杂交检测转基因拷贝数取每个TO代单株的新鲜叶片抽屉基因组DNA，采用CTAB法抽提(Murray MG等 1980, Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8 4321-4325)。Southern杂交的方法参照刘克德等的方法(Liu K等，1997，A genome-wide analysis of wide compatibility in rice and the precise location of the S5 locus in the molecular map. Theory Appl Genet 95:809-814)。用阳性检测的引物(GUSF 和 ⑶SR)PCR扩增片段为探针。结果见图5，图中第3、9、16、19泳道为单拷贝。4. Tl代转基因植株磷吸收效率提高与转基因共分离选其中的1个单拷贝种植下一代(Tl)，出现3 1分离，转基因阳性单株P含量 高，叶片末端出现磷累积的表型。转基因阴性单株P含量正常，表型正常。见图6阳性单株 为1，3，4，6，8，9，10，P含量高，叶片出现磷积累表型。阴性单株2，5，8，P含量正常，表型正 常。说明Tl代转基因阳性单株与植物体内磷含量升高也呈共分离。5.不同P浓度胁迫处理，转基因植株磷吸收效率提高表1显示了本实施例所用的水培肥料的配方(参照国际水稻研究所公开的配方)表1水稻水培液的配方
权利要求
1.水稻0sa-miR399k基因在提高磷吸收方面的应用，所述的0sa-miR399k基因的核苷 酸序列如SEQ ID NO 1所示。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及一种促进水稻磷吸收基因Osa-miR399k的分离克隆、功能验证及应用。所述的Osa-miR399k的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本发明克隆的Osa-miR399k是基因家族Osa-miR399的11个成员之一，该基因家族在水稻基因组中有多个同源基因Osa-miR399a---Osa-miR399k，其与拟南芥ath-miR399基因属于同一基因家族miR399。Osa-miR399家族基因具有提高水稻磷吸收功能，通过基因工程技术提高Osa-miR399家族基因在水稻中的表达量来促进植物对磷的吸收，从而减少磷肥的施用量，有利于植物在低磷土地上生长。
文档编号C12N15/29GK102002502SQ20101026381
公开日2011年4月6日 申请日期2010年8月25日 优先权日2010年8月25日
发明者吴昌银, 练兴明, 陈志辉 申请人:华中农业大学