专利名称：结核分枝杆菌rpfc基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，涉及结核分枝杆菌rpfc基因及其用途，尤其是在rpfC活性调控分子筛选、利用rpfC的结核病预防性疫苗和结核病诊断试剂方面的用途。
背景技术：
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是人类重要的致病菌。据世界卫生组织估计，每年有两百万人死于结核病；每三个人中就有一个人被感染；从2000年到2020年间，将会有近十亿人新感染结核病(http://www.theglobalfund.org/en/about/tuberculosis/default.asp)。特别是近年来，随着多重耐药菌株的出现及增多和艾滋病的流行，结核病的发病率也呈急剧上升趋势。结核分枝杆菌作为一种病原菌，成功之处主要在于能在寄主体内进入休眠状态，并保持持久的活性。当寄主的免疫系统因为某些原因(如衰老，感染HIV)免疫力下降时，这些休眠期的病原菌将会被重新激活并引发明显的临床症状。
藤黄微球菌的Rpf是迄今发现的第一个能使休眠状态的细菌复苏并促进其生长的因子。结核分枝杆菌与rpf相似的基因共5个，分别为rpfA(Rv0867c)，rpfB(Rv1009)，rpfC(Rv1884c)，rpfD(Rv2389c)和rpfE(Rv2450c)。在这五个基因中，rpfC的表达量最大，活性最高，突变后引起的全基因组表达图谱变化最大。
从rpfC出发，有可能开发治疗潜伏性结核病的新药，以及以其作为预防性疫苗，或者作为潜伏性结核病的诊断试剂的组分。
发明内容
本发明的目的在于提供，1.一种重组表达结核菌rpfC的工程菌；2.获得大量纯化的rpfC，进行抗体制备；3.利用含有rpfC的工程菌作为药物靶标研发新的药物的模型；4.含有rpfC的DNA疫苗或者亚单位疫苗的构建及其应用。
本发明的技术方案如下采用本领域技术人员熟知的技术，从结核菌基因组扩增rpfC基因，在大肠杆菌等适宜的宿主表达，纯化表达产物，进行抗体制备，亚单位疫苗制备以及DNA疫苗制备并检测效果。
实现上述目的的基本技术路线为总体技术方案是克隆包括提取结核菌基因组，利用合适的载体和限制性内切酶片段，构建转化载体，将基因组DNA克隆到合适的大肠杆菌宿主细胞。
1.基因模板提取将待克隆菌株在LB培养基或YE培养基或者Middlebrook 7H9、sauton等分枝杆菌能够生长的培养基中，培养到合适的菌体浓度，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法提取菌体DNA。
2.工程菌的构建 按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法，将基因组DNA克隆到适当的载体，转化适当的宿主菌，通过一定的选择标记，收集获得的工程菌。
3.功能基因的筛选 按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、完全可以从商业途径获得的载体、限制性内切酶和方法，将目标基因克隆到载体，转化宿主细胞，筛选转化子。分别根据已知的结核菌入侵人体和动物模型可能遭遇的不利环境，进行人工模拟，从基因组表达文库筛选相应的转化子，并进一步验证。
4.利用含有功能基因的重组菌，进行功能基因抑制剂或激活剂的筛选。
发明效果利用本技术方案涉及的方法，得到了1.一种重组表达结核菌rpfC的工程菌；2.获得大量纯化的rpfC，进行抗体制备；3.利用含有rpfC的工程菌作为药物靶标研发新的药物的模型；4.含有rpfC的DNA疫苗或者亚单位疫苗的构建及其应用。
图1.结核分枝杆菌rpfc PCR产物。
图2.重组表达的结核分枝杆菌rpfc产物。
具体实施例方式
1材料和方法1.1材料1.1.1菌株和培养基MTB H37Rv由重庆市肺科医院提供并灭活。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、质粒pET28a(+)和宿主菌E.coli BL21(DE3)为本实验室保存。藤黄微球菌(Micrococcus luteus CNCC(B)28001)由四川省抗生素研究所王明蓉惠赠。LB培养基，LMM(lactate minimal medium)含0.5％lithium L-lactate[3]。
1.1.2主要试剂限制性内切酶BamH I和EcoR I、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；PfuDNA聚合酶、dNTP和buffer、IPTG购自merck；DNA胶回收试剂盒购自Bioflux；Ni2+-Sepharose和KTA prime蛋白纯化系统购自Amersham Biosciences；低分子量蛋白标准购自上海生化所研究所。
1.2目的基因PCR扩增和克隆根据GenBank中mycobacterium tuberculosis H37Rv株rpfc的基因序列，自行设计一对扩增该成熟蛋白基因的PCR引物(由Invitrogen公司合成)，序列为cf 5’-ACAGGATCCACTTCCGGCGATATG-3’；cr5’TACTGAATTCTCAGCGCGGAATACTTG-3’(划线序列分别为BamH I和EcoR I酶切位点)。MTB基因组DNA按文献[4]抽提。以MTB基因组DNA为模板，以cf，cr为引物进行PCR，反应条件95℃5min；95℃60s，56.8℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。纯化后的PCR产物和质粒pET28a(+)以BamH I和EcoR I双酶切后，切胶纯化后，以T4DNA连接酶连接。连接产物转化至感受态E.coli BL21(DE3)，经菌体PCR筛选获得原核表达重组质粒pET28a-rpfc。送Invitrogen公司进行测序。
1.3目的基因的表达和SDS-PAGE分析将原核表达重组克隆接种于10ml(含50μg/ml卡那霉素)的LB培养基中，37℃200rpm/min培养过夜。1％接种到50ml LB(含50ug/ml卡那霉素)中，37℃200rpm/min培养至OD6000.5～0.8，加IPTG至1mmol/L诱导表达，诱导4h。以同样的方法诱导含空质粒pET28a(+)的E.coli BL21(DE3)做对照。
诱导收获的的菌液1ml，离心收集菌体。加入100μl 2×SDS凝胶上样缓冲液，振荡混匀，沸水煮沸5min，12000rpm/min离心10min，取上清15μl进行15％SDS-PAGE。
1.4重组Rpfc蛋白的纯化及浓度测定按上面的方法诱导1L重组菌。菌液4℃离心30min。用20ml 1×Ni2+-SepharoseBinding buffer(20mmol/LNaH2PO4，500mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑，pH 7.4)重悬细胞，再加入PMSF至终浓度1mmol/L。冰上超声破碎菌体，4℃离心，弃沉淀，上清0.45μm的滤膜过滤，然后用Ni2+-Sepharose亲合柱对蛋白进行纯化。10倍柱体积Binding buffer，10倍柱体积的Wash buffer(20mmol/L NaH2PO4，500mmol/L NaCl，80mmol/L咪唑，pH7.4)，10倍柱体积的Elution buffer(20mmol/LNaH2PO4，500mmol/LNaCl，500mmol/L咪唑，pH 7.4)。收集洗脱峰，进行SDS-PAGE分析。洗脱的重组蛋白4℃透析过夜，透析缓冲液含tris 50mmol/L pH 7.9，EDTA 0.5mmol/L，NaCl 50mmol/L，甘油5％(V/V)。蛋白浓度采用Bradford法进行测定。
1.5重组蛋白活性测定Rpfc样蛋白能促进休眠期的结核分枝杆菌的复苏，且能缩短在基本培养基上的延滞期。同时，由于Rpfc蛋白有种间活性，因此可以通过测定重组Rpfc能否缩短藤黄微球菌低密度(1∶103)在基本培养基LMM来检测其活性。
藤黄微球菌在营养琼脂培养基上传代。接少量菌体至LMM培养基中37℃振荡培养过夜，离心，上清0.22μm滤膜过滤除菌后立即使用作为阳性对照，透析buffer作为阴性对照，以及透析出盐后的重组Rpfc，各加40μl至30ml的LMM培养基中(调整RPF终浓度为pmol水平)，37℃，200rpm/min振荡培养，每4h观测一次OD600值(取200μl样品，在96孔板上，Moleculer Devices Spectra MAX 190读数)。
1.6Rpfc的生物信息学分析使用Vector NT I Suite9对蛋白氨基酸组成进行分析。使用在线软件SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对蛋白信号肽进行预测。使用NCBI的RPS-BLAST对氨基酸一级结构保守域进行比对。
2结果2.1Rpfc基因的扩增和克隆以MTB基因组DNA为模板，以cf，cr为引物进行PCR扩增。扩增产物。扩增产物经1.5％琼脂糖电泳分析，可见1条约450bp的DNA片断，与预期DNA片断大小一致。纯化的Rpfc PCR产物与pET28a(+)连接，构建的重组质粒通过菌体PCR检测，再通过测序鉴定，该序列和GenBank中Mycobacterium tuberculosis H37Rv rpfc除信号肽段部分的基因序列完全一致。
2.2重组RPFc的表达与纯化经过IPTG诱导，目的蛋白主要以包涵体形式表达。经凝胶扫描分析，目的蛋白占总蛋白的％。上清中的可溶重组蛋白经亲和层析后在考马斯亮兰染色的SDS-PAGE上只有单一的条带。
2.3重组Rpfc蛋白活性的测定从表一可以看出，Rpfc能显著缩短藤黄微球菌低密度接种到LMM培养基上的延滞期。
权利要求
1.结核分枝杆菌rpfc基因，其特征是表达结核菌rpfC的重组工程菌、纯化的重组酶以及利用纯化的酶或工程菌进行结核分枝杆菌rpfC调节分子的筛选。
2.权利要求1所述的结核分枝杆菌rpfc基因，其特征是rpfc包括其活性位点关键残基的不影响活性的变异体，包括rpfC的溶菌酶样功能域、糖苷酶功能域的关键残基如色氨酸-天冬氨酸二联体和甘氨酸-甘氨酸-任意氨基酸-丙氨酸-色氨酸-脯氨酸六肽区。
3.权利要求1或2所述的结核分枝杆菌rpfc基因在结核病诊断和药物治疗效果监控中的用途，其特征是利用重组表达的rpfC的抗体或者抗体类似分子进行免疫检测。
4.权利要求1或2所述的结核分枝杆菌rpfc基因在DNA疫苗或者亚单位疫苗中的应用，其特征是利用结核分枝杆菌rpfc基因及其产物，作为疫苗组分，预防结核病。
全文摘要
本发明属于医药生物技术领域，涉及结核分枝杆菌rpfc基因及其用途，尤其是在rpfC活性调控分子筛选、利用rpfC的结核病预防性疫苗和结核病诊断试剂方面的用途。
文档编号C12N1/21GK101037698SQ200610095339
公开日2007年9月19日 申请日期2006年12月25日 优先权日2006年12月25日
发明者谢建平, 柳云帆, 王洪海 申请人:西南大学