专利名称：大白菜几丁质酶chb4基因及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及大白菜几丁质酶CHB4基因及其克隆方法。
背景技术：
众所周知病原真菌所致的病害在植物病害种类中占80％以上，直接影响作物的产量和品质，每年给作物生产造成巨大损失。利用杀菌药物防治真菌病害具有成本高、真菌易产生抗药性、环境污染等缺点。相比之下，抗病育种具有节约生产成本、减少环境污染及避免农药残毒等优点，是一种经济有效的稳定防治途径。随着分子生物学的迅速发展，抗病基因工程育种在作物真菌病害防治方面开辟了一条崭新的途径。几丁质酶普遍存在于大白菜、烟草等高等植物中，鉴于几丁质酶具有抗真菌活性，在抑制真菌的生长增殖、提高植物的抗病性等方面具有重要作用，利用生物工程技术将外源几丁质酶基因转入各种植物中，从而提高植物抗真菌能力，培育抗病品种无疑是经济有效的方法。迄今为止，科研工作者已成功获得了烟草、大豆、棉花、水稻和玉米等转几丁质酶基因植物，其表达的几丁质酶活性物质，不仅可抗真菌，还对植物线虫、昆虫和其它一些病原微生物具有抗性。
几丁质酶存在于大白菜中。2002年，国外有人开始克隆出大白菜几丁质酶基因片段(118bp)，但是，大白菜几丁质酶基因的全序列国内外至今未见报道。由于基因片段无法进行蛋白质的正确表达，因而也就不能作为正常的外源基因来进行利用。
大白菜的种植面积大，占秋播蔬菜面积的30～50％，材料易于获得，其栽培、育种等技术相当成熟。因此，对于大白菜几丁质酶CHB4基因的全长进行分离与克隆，并对其进行了生物信息学分析，对于加快基因工程培育作物抗病品种、提高作物抗病性等具有十分重要的意义。
发明内容
本发明是为避免上述现有技术所存在的不足之处，提供大白菜几丁质酶CHB4基因，并提供大白菜几丁质酶CHB4基因的克隆方法，为更进一步利用生物工程技术将外源几丁质酶基因转入各种植物中，从而提高植物抗真菌能力，培育抗病品种提供基础。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是本发明大白菜几丁质酶CHB4基因，其特征是所述几丁质酶CHB4基因的全长1517bp，序列如下aacatggctc tcacaaaatt atccttggtt ctttttcttt gcttcttagg tttatactca gaaaccgtca agtctcaaaa ctgcggttgtgccccaaacc tgtgttgcag tcagttcggt tactgcggtt ccaccgacgc ttattgtggt actggttgcc gatcaggcccttgcagaagc cctggtggaa ccccttctcc ccctggtggt ggatcagttg gtagcattgt gacacaagct ttctttaacg gtattatcaa
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本发明大白菜几丁质酶CHB4基因的克隆方法的特征是利用已知的十字花科植物几丁质酶基因序列，通过比较设计引物，从大白菜基因组DNA中克隆特异性DNA片段，以及5′端序列片段；利用水杨酸诱导并以酶活力最高的处理植株的叶片RNA为模板，通过RACE反应得到3′端序列片段，在大白菜几丁质酶基因片段已经克隆的基础上，重新设计引物通过PCR反应从基因组DNA中扩增出该几丁质酶CHB4基因的全长1517bp。。
本发明方法具体按如下步骤操作1、根据已知十字花科植物几丁质酶基因的保守序列设计特异性引物，以大白菜叶片基因组DNA为模板，通过PCR反应扩增出长度为1096bp的特异性DNA片段和长度为150bp的几丁质酶基因5′端序列片段；2、利用不同浓度的水杨酸处理苗龄为7天的大白菜植株，处理浓度为1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、7.5mmol/L，以未处理的为对照，分别在处理后8、12、16、20小时提取粗酶液并测定酶活力，选择其中酶活力最高的处理植株叶片提取叶片总RNA；3、采用Trizol试剂法提取经1mmol/L水杨酸处理的大白菜叶片总RNA，利用3′RACE技术扩增得到大白菜几丁质酶CHB4基因的3′端436bp；4、在已克隆大白菜几丁质酶基因片段的基础上，设计引物通过PCR反应从基因组DNA中扩增出该几丁质酶CHB4基因的全长1517bp序列；5、对大白菜几丁质酶CHB4基因全序列进行核苷酸序列分析，对该基因编码的氨基酸序列进行同源性分析，确认大白菜几丁质酶CHB4基因。
与已有技术相比，本发明有益效果体现在1、几丁质酶是高等植物普遍存在的一种能降解几丁质的糖苷酶，由于能催化真菌细胞壁所含几丁质的水解，使其原生质外渗，故能抑制真菌的生长增殖，具有提高植物的抗真菌能力，本发明通过诱导和克隆大白菜的几丁质酶CHB4基因，并与其他物种ClassIV类几丁质酶基因的比较分析，从而探讨大白菜与其他物种的几丁质酶基因的关系，为进一步研究该基因的功能及其利用提供了可靠的依据。
2、对于大白菜几丁质酶CHB4基因的利用至少有三种途径一是将该基因表达的酶液施于灌溉水或与种衣剂混合，以保护幼苗免受土壤真菌的侵染；二是将该几丁质酶基因引入根围细菌，使该工程菌表达分泌几丁质酶；三是将几丁质酶基因导入其他植物，提高转基因植物的抗真菌能力。
3、本发明在序列比较的基础上，设计特异引物从大白菜叶片基因组DNA中直接扩增得到几丁质酶基因的特异片段，避免了从cDNA中扩增基因片段所经过的RNA提取、RT-PCR反应等繁琐步骤与困难。
4、本发明利用不同浓度的水杨酸处理苗龄为7天的大白菜植株，并设置不同的处理时间，提取粗酶液并测定酶活力，从中选择酶活力最高的处理组合来提取RNA，这是因为几丁质酶是一种诱导酶，在正常情况下不表达或表达水平很低，当受到外源因子—水杨酸诱导后，能大大提高其表达活性。
5、本发明提取经1.0mmol·L-1水杨酸处理的大白菜叶片RNA，进行3′RACE反应，得到大白菜几丁质酶CHB4基因的3′端。避免了筛库法需建立cDNA文库，需要耗费大量的时间和经费才能获得足够信息的缺点；以及计算机杂交法所要求的绝大多数功能基因的编码区比较保守等要求。
6、本发明在大白菜几丁质酶基因片段已克隆的基础上，设计引物通过PCR反应从基因组DNA中扩增出该几丁质酶CHB4基因的全长。从基因组DNA中扩增全基因，步骤比较简单，操作简便，而且能够扩增出包括内含子在内的全序列，为进一步研究该基因的结构及功能提供了保证。
图1为大白菜几丁质酶CHB4基因的PCR扩增产物，图中，M为DL2000；1为几丁质酶全基因的PCR产物图2为大白菜几丁质酶与其它物种的class IV chitinase(CHIV)氨基酸序列的多重比较分析。其中黑色表示该位置序列完全一致，灰色表示该位置序列高度相似或有相似。
以下通过具体实施方式
对本发明作进一步描述具体实施步骤如下1、大白菜几丁质酶基因中间特异片段的PCR扩增依据十字花科植物几丁质酶基因序列，使用Primer5.0程序设计一对特异引物，以大白菜基因组DNA为模板，扩增几丁质酶基因特异片段。经回收、连接、转化及筛选重组子，测序分析得到特异性DNA片段。
2、5′端150bp的PCR扩增根据已报道的大白菜几丁质酶基因片段(150bp)，在序列比较的基础上设计引物，以大白菜基因组DNA为模板，扩增出大白菜几丁质酶5′端150bp的特异片段。
3、大白菜几丁质酶的诱导与酶活的测定利用不同浓度的水杨酸处理苗龄为7天的大白菜植株，处理浓度为1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、7.5mmol/L，以未处理的为对照。分别在处理后8、12、16、20小时提取粗酶液并测定酶活。
4、大白菜几丁质酶基因的3′RACE反应采用Trizol试剂法提取经1mmol/L水杨酸处理的大白菜叶片总RNA，利用3′RACE反应得到大白菜几丁质酶基因的3′端。
5、几丁质酶CHB4基因的PCR扩增在已克隆大白菜几丁质酶基因片段的基础上，设计引物通过PCR反应从基因组DNA中扩增出该几丁质酶基因的全长(图1所示)。
6、对大白菜几丁质酶基因进行生物信息学分析a、利用BLAST软件分析大白菜几丁质酶CHB4基因的核苷酸序列及其推定的氨基酸序列大白菜几丁质酶CHB4基因包含一个长度为508bp(407-914)的内含子序列，全长1517bp，其外显子(1-406，915-1517)，编码区(4-406，915-1318)，编码的蛋白质由268个氨基酸残基组成。该蛋白质含有一个长度为72bp(4-75)组成的导肽区，其氨基酸组成为MALTKLSLVLFLCFLGLYSETVKS。
b、利用DNAMAN分析软件对大白菜几丁质酶与其它植物的classIV类几丁质酶(CHIV)的氨基酸序列进行比较分析(图2所示)ClassIV类几丁质酶氨基酸序列中含有两个高度保守区FAHF(/V)THETGHF(/M)CY及QGFGATIRAIN，而且ClassIV类几丁质酶的C端较N端保守性高。大白菜几丁质酶CHB4基因编码的氨基酸序列与油菜ClassIV类几丁质酶的氨基酸序列同源性达99％，与其它植物的同源性达到50％以上，表明ClassIV类几丁质酶的氨基酸序列具有较高的保守性，同时也表明本实验所克隆的大白菜几丁质酶CHB4基因是编码ClassIV类几丁质酶的基因序列。
本发明所涉及的几丁质酶CHB4基因的全长1517bp，序列表如下aacatggctc tcacaaaatt atccttggtt ctttttcttt gcttcttagg tttatactca gaaaccgtca agtctcaaaa 80ctgcggttgt gccccaaacc tgtgttgcag tcagttcggt tactgcggtt ccaccgacgc ttattgtggt actggttgcc 160gatcaggccc ttgcagaagc cctggtggaa ccccttctcc ccctggtggt ggatcagttg gtagcattgt gacacaagct 240ttctttaacg gtattatcaa tcaagccggt ggtggttgcg ccgggaagaa tttctacacc cgtgattctt tcattaacgc 320cgcaaatact ttcccaaact ttgccaattc ggttactaga cgtgaaattg caaccgtgtt tgctcatttc acccacgaga 400ctggacgtaa gaatcacttt ctctcttcgc ttccttaata tattagccat gtaaacaaaa catggtcaga tataaccgtt 480cctcagaata atatatttta ccgaccaaaa ctaaaattta gttttaagtt tatgagcaat ggaaaaaaaa aaaaatctta 560tagaaataac aaaatttgtg tatatacatc tagtctccgt aatcgccgat tctaattttt aaacaagaaa atacaaatag 640aatactctac atattgtcaa aatcttaggc atggataatc tctaaacgtt cgtttaaaaa aaaaaaaaaa agatgctgat 720tatataacac gtaaaaccag tataagacat aagaataaac cctcgattat tgaaagaaaa gaataataaa ccttcgatat 800aataaaatga aactgatatg acgtgatctc aattagttgg agtgatccta aagcaattta ttttgacaag tatcctaaag 880caattcgttt catgtttatc tttatcctct atagatttct gctacataga agaaataaac ggagcttcac gtgactactg 960cgacgagaac aacaggcagt acccatgtgc accaggcaaa ggctacttcg gtcgtggtcc gattcaacta tcatggaact 1040acaactacgg agcttgtggc cagagtctca accttaacct cttaggccag cccgagctag tgagtagcaa cccaactgtc 1120gctttcagga cgggtctgtg gttttggatg aatagcgtaa gaccggtact aaaccaaggg tttggagcca ccattagagc 1200catcaatgga atggagtgta acggtgggaa ctcaggtgcg gtcaatgcaa ggattaggta ctatagagac tattgtggac 1280agcttggtgt ggatcctggt cctaacctta gctgctaaag agttattcga acaaacacgc acacacgtga cgtgggaagt 1360gatggagaaa gttgaagtta tgaaataata aatgagacaa taaagttaaa tctcatatat atgctcctat gtggctatgt 1440tgggtcttag tgttccctgc gtcacaagca ataagtagtt gtaataatgt tgtgaaagtg attttctttt aaatggc151权利要求
1.大白菜几丁质酶CHB4基因，其特征是所述几丁质酶CHB4基因的全长1517bp，序列如下aacatggctc tcacaaaatt atccttggtt ctttttcttt gcttcttagg tttatactca gaaaccgtca agtctcaaaa ctgcggttgtgccccaaacc tgtgttgcag tcagttcggt tactgcggtt ccaccgacgc ttattgtggt actggttgcc gatcaggcccttgcagaagc cctggtggaa ccccttctcc ccctggtggt ggatcagttg gtagcattgt gacacaagct ttctttaacg gtattatcaatcaagccggt ggtggttgcg ccgggaagaa tttctacacc cgtgattctt tcattaacgc cgcaaatact ttcccaaact ttgccaattcggttactaga cgtgaaattg caaccgtgtt tgctcatttc acccacgaga ctggacgtaa gaatcacttt ctctcttcgc ttccttaatatattagccat gtaaacaaaa catggtcaga tataaccgtt cctcagaata atatatttta ccgaccaaaa ctaaaattta gttttaagtttatgagcaat ggaaaaaaaa aaaaatctta tagaaataac aaaatttgtg tatatacatc tagtctccgt aatcgccgat tctaatttttaaacaagaaa atacaaatag aatactctac atattgtcaa aatcttaggc atggataatc tctaaacgtt cgtttaaaaa aaaaaaaaaaagatgctgat tatataacac gtaaaaccag tataagacat aagaataaac cctcgattat tgaaagaaaa gaataataaa ccttcgatataataaaatga aactgatatg acgtgatctc aattagttgg agtgatccta aagcaattta ttttgacaag tatcctaaag caattcgtttcatgtttatc tttatcctct atagatttct gctacataga agaaataaac ggagcttcac gtgactactg cgacgagaac aacaggcagtacccatgtgc accaggcaaa ggctacttcg gtcgtggtcc gattcaacta tcatggaact acaactacgg agcttgtggccagagtctca accttaacct cttaggccag cccgagctag tgagtagcaa cccaactgtc gctttcagga cgggtctgtggttttggatg aatagcgtaa gaccggtact aaaccaaggg tttggagcca ccattagagc catcaatgga atggagtgtaacggtgggaa ctcaggtgcg gtcaatgcaa ggattaggta ctatagagac tattgtggac agcttggtgt ggatcctggtcctaacctta gctgctaaag agttattcga acaaacacgc acacacgtga cgtgggaagt gatggagaaa gttgaagttatgaaataata aatgagacaa taaagttaaa tctcatatat atgctcctat gtggctatgt tgggtcttag tgttccctgc gtcacaagcaataagtagtt gtaataatgt tgtgaaagtg attttctttt aaatggc。
2.一种权利要求1所述大白菜几丁质酶CHB4基因的克隆方法，其特征是利用已知的十字花科植物几丁质酶基因序列，通过比较设计引物，从大白菜基因组DNA中克隆特异性DNA片段，以及5′端序列片段；利用水杨酸诱导并以酶活力最高的处理植株的叶片RNA为模板，通过RACE反应得到3′端序列片段，在大白菜几丁质酶基因片段已经克隆的基础上，重新设计引物通过PCR反应从基因组DNA中扩增出该几丁质酶CHB4基因的全长1517bp。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是按如下步骤操作a、根据已知十字花科植物几丁质酶基因的保守序列设计特异性引物，以大白菜叶片基因组DNA为模板，通过PCR反应扩增出长度为1096bp的特异性DNA片段和长度为150bp的几丁质酶基因5′端序列片段；b、利用不同浓度的水杨酸处理苗龄为7天的大白菜植株，处理浓度为1mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、7.5mmol/L，以未处理的为对照，分别在处理后8、12、16、20小时提取粗酶液并测定酶活力，选择其中酶活力最高的处理植株叶片提取叶片总RNA；c、采用Trizol试剂法提取经1mmol/L水杨酸处理的大白菜叶片总RNA，利用3′RACE技术扩增得到大白菜几丁质酶CHB4基因的3′端436bp；d、在已克隆大白菜几丁质酶基因片段的基础上，设计引物通过PCR反应从基因组DNA中扩增出该几丁质酶CHB4基因的全长1517bp序列；e、对大白菜几丁质酶CHB4基因全序列进行核苷酸序列分析，对该基因编码的氨基酸序列进行同源性分析，确认大白菜几丁质酶CHB4基因。
全文摘要
大白菜几丁质酶CHB4基因及其克隆方法，其特征是利用已知的十字花科植物几丁质酶基因序列，通过比较设计引物，从大白菜基因组DNA中克隆特异性DNA片段，以及5′端序列片段；利用水杨酸诱导并以酶活力最高的处理植株的叶片RNA为模板，通过RACE反应得到3′端序列片段，在大白菜几丁质酶基因片段已经克隆的基础上，重新设计引物通过PCR反应从基因组DNA中扩增出该几丁质酶CHB4基因的全长1517bp。本发明为更进一步利用生物工程技术将外源几丁质酶基因转入各种植物中，从而提高植物抗真菌能力，培育抗病品种提供基础。
文档编号C12N9/24GK1974773SQ20061009615
公开日2007年6月6日 申请日期2006年9月22日 优先权日2006年9月22日
发明者甘德芳, 程备久, 朱苏文, 范军, 叶辉, 程郢, 项艳, 陶芳, 张建 申请人:安徽农业大学