水稻转座子基因的制作方法

专利名称：水稻转座子基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻(Oryza sativa)非自主性转座子(nonautonomoustransposon)基因，自主性转座子(autonomous transposon)基因，以及转座酶基因，同时还涉及使转座子基因发生转座的方法以及通过转座而转化的植物。
背景技术：
基因破坏(gene disruption)一直作为分析水稻(Oryza sativa)基因组的工具。为了达到破坏水稻基因组的目的，已经使用的方法有通过将其中以转座酶基因(催化转座的酶)作为活化因子进行转导的水稻株与其中导入分离因子的水稻株进行配对，从而活化分离因子的方法；使用T-DNA的方法；以及使用逆转座子的方法等。但是，对水稻自发突变的分析显示一直以来并没有被用于发现活化转座子(细胞工程增补卷，植物细胞工程第14期，“植物基因组研究指南”2000年2月，Shujun出版社)。
在另一方面，全基因组测序计划正在确定包括水稻在内的许多植物的核苷酸序列，其结果被不断地补充入数据库。同时，动植物的转座子基因、可动基因在某种程度上具有独特的核苷酸序列，其信息使得针对转座子开展的更为广泛的研究成为可能。但是，到目前为止尚有许多解释未得到证实。此外，在由γ-射线诱导的水稻突变体中发现了一推定的转座子基因的核苷酸序列(Tetsuya Nakazaki等，“转座子样序列多态性插入可突变小颗粒基因(slender-granule gene)slg位点”，日本育种协会第100届研讨会8月会议，2001年10月)。
本发明要解决的问题本发明人在研究中发现，水稻基因组核苷酸序列的转座子基因有一特征性反向重复序列。通过对可能的转座子核苷酸序列使用不同的实验方法，本发明人证实该核苷酸序列为一转座子基因(非自主性转座子)。
此外，本发明人还在非自主性转座子基因的基础上发现了自主性转座子基因。同时本发明人还发现了转座酶基因，所述的基因能使所述的转座子基因发生转座。
解决问题的方法本发明人由1号染色体开始，对水稻基因组序列中的长末端重复序列(LTR)进行了检测，并将其逐一登记入数据库。本发明人注意到在登记号为AP002843的克隆中有一LTR(见表1)，对该序列进行深入研究后发现在临近LTR的下游有两个转座子基因特征性反向重复序列，分别位于第144459～144473位碱基及第144874～144888位碱基(见图1，SEQID NO6)。本发明人证实，位于两个反向重复序列中间的核苷酸序列(SEQ ID NO1)为一非自主性转座子基因，通过例如花药培养的常用的人工处理即可使其发生显著转座，在下文中将以实施例对此进行说明。
表1AP002843水稻基因组DNA，1号染色体，PA登记号 AP002843NCBI SRS基因组-网生物体 水稻NCBI SRS位点 AP002843148762bp DNA PLN 2001年1月26日特征 位置/限定词来源 1...148752/染色体＝“1”
/克隆＝“P0407B12”/栽培品种＝“Nipponbare”/生物体＝“水稻”/测序分子＝“DNA”LTR139482...139690/注释＝“5’端LTR”CDS139739...144052/基因＝“P0407B12.28”/注释＝“可能由于CDS读码框错码造成失活”/注释＝“假基因，与Oryza longistaminata，可能为gag/多蛋白U72725”/假LTR 144047...144255/注释＝“3’端LTR”CDS 联合(144653...144692，145148...145311)/密码子_起始＝1/基因＝“P0407B12.29”/注释＝“假定的蛋白”/蛋白_编号＝“BAB17191.1”/翻译＝“MRRSHGGGGRKRSVPSSSHPEKKAIDRIKREDAGRRAGRVSLVQPLAAFPATDGGGGGGLARLLRWW”接下来，本发明人用Blast搜索工具，对非自主性转座子基因(SEQ IDNO1)进行了同源性搜索(搜索DNA同源性)。大部分搜索结果都为该转座子基因(SEQ ID NO1)本身，但同时也获得了另两个被预期为转座子基因的序列，其登记号分别为AP004236和AP003968。将AP004236和AP003968的核苷酸序列进行比较，本发明人发现两者都位于第6号染色体上，且是同一个重叠区域的序列。
因此，非自主性转座子基因(SEQ ID NO1)的第1～253位碱基与AP004236的第89360～89612位碱基之间的同源性为252/253(99％)，且非自主性转座子基因(SEQ ID NO1)的第254～430位碱基与AP004236的第94524～94700位碱基之间的同源性为177/177(100％)。它们都是高度保守的序列。
非自主性转座子基因(SEQ ID NO1,430个bp)以及转座子(SEQID NO2,5341个bp)都有长度为15个bp的反向重复序列，并且都将TTA和TAA作为识别和插入位点。
对SEQ ID NO2(5341个bp)进行的开放读码框(ORF)搜索结果显示，有两个推定的读码框ORF I和ORF II。
图9的上半部分显示的是包含SEQ ID NO2的转座子基因结构。非自主性转座子基因(SEQ ID NO1,430个bp)位于第1～253位碱基及第5165～5341位碱基，ORF I位于第1526～1914位碱基及第1939～2663位碱基，ORF II位于第3190～4557位碱基。
此外，为了获得与包含SEQ ID NO2基因相似的基因，本发明人用Blast搜索工具，对SEQ ID NO2进行了同源性搜索(搜索DNA同源性)，其结果除SEQ ID NO2本身外，还有登记号为AP004753(2号染色体)及AP003714(6号染色体)的两个序列。这两个克隆具有相同的核苷酸序列(SEQ ID NO3)，并且位于不同的染色体上(数个拷贝)。由于该核苷酸序列同样存在于籼稻(indica)(一种水稻的变种)，该基因必然在由粳稻(japonica)至籼稻的多个变种中具有保守性。SEQ ID NO3(5166个bp)与SEQ ID NO2一样具有反向重复序列，同样也将TAA(3个bp)作为识别和插入位点。
对SEQ ID NO3进行开放读码框(ORF)搜索获得了ORF I和ORF II，两者可能编码两种蛋白。图9的下半部分显示的是包含SEQ ID NO3(5341个bp)的转座子基因结构。非自主性转座子基因(SEQ ID NO1，430个bp)位于第1～170位碱基及第5092～5166位碱基，但两者中间缺乏非自主性转座子基因(SEQ ID NO1,430个bp)的同源核苷酸序列。ORF I位于第1630～2652位碱基，ORF II位于第2959～4407位碱基。
比较粳稻(AP004753和AP003714)和籼稻所包含的SEQ ID NO3的核苷酸序列，发现两者之间的同源性大于90％，其结果显示于图10。此外，本发明人还检测了非自主性转座子基因(SEQ ID NO1,430个bp)在籼稻内的突变率，其结果如图11所示序列同源性大于95％。
本发明人目前对SEQ ID NO2及SEQ ID NO3的ORF I功能尚不了解。
为了了解ORF II是否编码转座酶(催化转座的酶)，本发明人对ORFII编码的氨基酸序列是否与已知的转座酶基因具有相同的保守区域进行了检验。SEQ ID NO2及SEQ ID NO3的ORF II编码的氨基酸序列分别被标记为SEQ ID NO4和5。这两个ORF II编码的氨基酸序列(SEQID NO4及5)之间的比对(alignment)显示于图12，两者的同源性大于75％(77％)。这两个氨基酸序列都具有DXG/AF/F基序和YREK基序(Q.H.Le，K.Turcotte和T.Bureau，Genetics 1581081-1088(2001))，因此可得出其均属于IS转座酶家族的结论。
SEQ ID NO2和3的ORF II核苷酸序列之间的同源性同样大于75％(79.3％)。
因此，本发明为一水稻转座子基因，其由一种核苷酸序列组成，该核苷酸序列与SEQ ID NO1之间的同源性至少为95％。与SEQ ID NO1同源性至少为95％的DNA被认为具有非自主性转座子的功能，用花药培养或化学试剂处理可使其发生转座。本发明还为一水稻转座子基因，其中插入有增强子或启动子。
此外，本发明为一水稻转座子基因，其核苷酸序列与SEQ ID NO2或3之间的同源性至少为90％。与SEQ ID NO2或3的同源性至少为90％的DNA被认为具有自主性转座子的功能，用花药培养或化学试剂处理可使其发生转座。
本发明还为一水稻转座酶基因，其DNA与SEQ ID NO2的第3190～4557位碱基或SEQ ID NO3的第2959～4407位碱基之间的同源性至少位75％。与上述核苷酸序列同源性大于等于75％的DNA被认为具有能够使转座子发生转座的功能。
本发明还为一转座酶基因，其编码的蛋白质由SEQ ID NO4或5的氨基酸序列或上述氨基酸序列发生一或数个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列组成。该转座酶可为一水稻转座子基因，其氨基酸序列与SEQ ID NO4或5之间的同源性至少为75％。
此外，本发明还为编码该蛋白质的转座酶基因。本发明也包括含有上述任一转座子基因的质粒。本发明同样包括含有启动子和任一上述转座酶基因的质粒。为达到该目的可使用Ti质粒和pBI-121质粒等双重载体。本发明中适用的启动子包括花椰菜花叶病病毒35s启动子，热休克启动子，趋化性(chemotaxis)启动子及其他启动子。本发明对整合启动子和上述基因组的方法并没有限制，基因工程的一般方法即可适用。
本发明包括转导入上述转座子基因的转化体(transformant)。植物为优选的宿主，尤其是水稻、大麦、小麦或玉米。通过使用基因工程的一般方法，我们可将这些基因组插入上述质粒并转化这些植物。
本发明还包括转导入启动子和上述转座酶基因的转化体。如果有必要的话还可转导其他转座子基因。上述启动子皆适用于本发明。植物为优选的宿主，尤其是大麦、小麦或玉米。通过使用基因工程的一般方法，我们可将上述基因组插入上述质粒并转化这些植物。
本发明的内容还包含使任一上述转座子基因发生转座的方法，包括对任一上述转化体进行花药培养或化学试剂处理。
本发明还包括通过任一上述方法使上述转座子基因发生转座，并用其转化的植物或种子。水稻或其邻种如大麦、小麦或玉米为优选的植物。
本发明还包括确定转座子基因整合区域的方法，包括用任一上述方法使任一上述转座子基因发生转座，由所获植物提取DNA，用在转座子基因内没有酶切位点的内切酶消化上述DNA，连接所获DNA片段，PCR扩增上述DNA片段，并确定上述PCR产物的核苷酸序列。上述PCR所用引物为包含来自SEQ ID NO1的5’端的10个连续碱基的寡聚核苷酸，优选方案为10～20个连续碱基，更优选方案为10～15个碱基；以及包含来自SEQ ID NO1的3’端10个连续碱基的寡聚核苷酸，优选方案为10～20个连续碱基，更优选方案为10～15个碱基；或包含与上述序列互补的核苷酸的序列的寡聚核苷酸。由于包含来自SEQ ID NO1的5’端10～15个连续碱基的寡聚核苷酸与包含来自SEQ ID NO1的3’端10～15个连续碱基的寡聚核苷酸互相重叠，因此如果该寡聚核苷酸少于15个连续碱基的话，我们可以使用单一引物。也就是说，我们可以使用包含来自SEQ ID NO1的5’端10～15个连续碱基的寡聚核苷酸，或包含与其互补的10～15个连续碱基的寡聚核苷酸作为PCR引物。通过这一方法，确定转座子基因的整合部位即可发现被破坏的基因组。


图1为登记号为AP002843的基因组核苷酸序列的一部分(SEQ ID NO6)。转座子基因特征性反向重复序列位于第144459～144473及第144874～144888位碱基，紧接着LTR之后。
图2为包含四种水稻变种成熟叶转座子DNA的DNA区域(登记号AP002843)PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果(实施例2)。Nihonbare在850bp附近的条带表明一转座子基因(430个bp)插入了该区域。而Koshihikari，Hitomebore以及Yamahoushi的条带均在420bp附近，则表明没有转座子基因插入。
图3为包含Nihonbare种子不同愈伤组织(callus)内转座子DNA的DNA区域(登记号AP002843)PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果(对比例1)。
图4为包含Nihonbare花药不同愈伤组织内转座子DNA的DNA区域(登记号AP002843)PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果(实施例3)。在420bp附近的条带表明缺失转座子基因。
图5为Nihonbare花药不同愈伤组织内转座子DNA的琼脂糖凝胶电泳结果(实施例4)。第1泳道为Nihonbare对照，第2～10泳道为由花药愈伤组织再生的植物。用包含部分转座子核苷酸序列的探针检测DNA条带。与Nihonbare对照相比，第2和第6泳道显示有阳性条带(用箭头表示)。
图6为实施例4中再生水稻中发现的转化体表型的照片。这种水稻的叶子短且卷曲。
图7为包含Nihonbare种子不同愈伤组织内转座子DNA的DNA区域PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果(实施例5)。上缘的数字表明5-氮胞苷的浓度。在300bp附近的条带表明该片段缺失转座子基因(430bp)。
图8为4个克隆的碱基序列，该4个克隆皆缺失转座子基因(430bp)。
图9为包含SEQ ID NO2及3的核苷酸序列的转座子基因结构。
图10为粳稻(AP004753和AP003714)和籼稻(支架6962(Scaffold6962))在SEQ ID NO3区域的核苷酸序列同源性。
图11为籼稻转座子基因(SEQ ID NO1,430bp)的突变率。
图12为SEQ ID NO2和3的ORF II编码的氨基酸序列之间的比对。两者之间的同源性大于75％(77.8％，同源氨基酸在图中用*标记)，且两者都具有DXG/AF/F基序和YREK基序。上方的线条为SEQ ID NO4的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO2的ORF II)，下方的线条为SEQ ID NO5的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO3的ORF II)。
图13-左图为包含Nihonbare花药不同愈伤组织内转座子DNA的DNA区域(登记号AP004236)PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果(实施例6)。在1.2Kbp处的条带表明转座子基因的缺失。图13-右图为包含来自Nihonbare种子的不同愈伤组织内转座子DNA的DNA区域(登记号AP004236)的琼脂糖凝胶电泳结果(对比例2)。
图14为表明在不同水稻变种中自主性转座子基因(SEQ ID NO2，在照片的上缘显示)存在或缺失的琼脂糖凝胶电泳结果(实施例7)。箭头所示的DNA条带表明在Nihonbare(第1泳道)和Koshihikari(第2泳道)中存在自主性转座子基因(SEQ ID NO2)，而在Taichung No.65(第3泳道)和Kasarasu(第4泳道)中则该DNA条带缺失。
图15为转导入Nihonbare自主性转座子基因(SEQ ID NO2)的Taichung No.65花药愈伤组织DNA的凝胶电泳结果(实施例8)。箭头所示的DNA条带表明在原始Taichung No.65(第2泳道)内缺失自主性转座子基因(SEQ ID NO2)，但在转导入自主性转座子基因(SEQ ID NO2)的Taichung No.65(第3～6泳道)内却存在该基因。
图16为包含转导入Nihonbare自主性转座子基因(SEQ ID NO2，实施例8)的Taichung No.65花药愈伤组织非自主性转座子基因DNA区域PCR产物的凝胶电泳结果。在L06基因位点观察到的DNA条带大小提示非自主性转座子基因的缺失。
图17为提示在L02基因位点缺失非自主性转座子基因的DNA片段的核苷酸序列。在该位点缺失了非自主性转座子基因(SEQ ID NO1)的核苷酸序列。
图18为提示在L06基因位点缺失非自主性转座子基因的DNA片段的核苷酸序列。在该位点缺失了非自主性转座子基因(SEQ ID NO1)的核苷酸序列。
具体实施例方式
首先，本发明为水稻非自主性转座子基因(SEQ ID NO1)，该DNA大小为430bp。该转座子基因有大小为15bp的末端反向重复序列，以及一个大小为215bp的对称结构(CT)。
接下来本发明还包括两种转座子基因(SEQ ID NO2及3)，两者都为自主性转座子基因，分别编码转座酶(SEQ ID NO4及5)。
自主性转座子基因的特点为其自身编码转座酶，具有可动的特点，并能诱导非自主性转座子基因的转座。而非自主性转座子基因缺乏转座酶，不具有可动的特点，并且需要在自主性转座子基因的协助下进行转座。比较自主性转座子基因与非自主性转座子基因的结构发现，除缺失的DNA区域外，两者的核苷酸序列具有同源性且高度保守。
携带本发明转座子的植物，或用本发明转座子转化的植物，或携带本发明转座酶基因的植物，或用本发明转座酶基因转化的植物能通过放射线照射、化学试剂处理、或花药培养诱导而活化，从而使本发明的转座子发生转座。由于用上述方法可使转座子高度活化，因此可轻而易举使人工转座子发生转座。
化学试剂法为用化学试剂处理植物如水稻的种子、叶、根、及腋芽的茎；或处理其愈伤组织。例如用5-氮胞苷或5-氮脱氧胞嘧啶处理这些植物的方法一般为将植物移植于含有0.01mM～5mM上述化学试剂的固体或液体培养基中，优选浓度为0.05mM～2mM。在本文中，愈伤组织为通过在加入合适浓度植物生长素或细胞激动素的合适培养基中培养植物器官如根、叶或茎等，使已分化的植物器官去分化，而形成的一个细胞团块。该细胞团块未分化，且在分化中具有全能性。分化全能性指该细胞团块能再生为新的器官如芽或根等。例如一片叶子可由愈伤组织介导产生上百个克隆。
花药培养是一种产生双单倍体(doubled haploid)培养的方法。从水稻雄蕊顶端取下花药，并在加入以植物生长素类激素为主并辅以多倍体诱导化学物质如秋水仙碱等激素的培养基中进行培养。由于单倍体细胞能轻易变成双倍体细胞，因此能够简单地由花药获得双倍体细胞，即携带一套基因的双倍体细胞。由花药培养的水稻愈伤组织自发地把染色体数目增加一倍，从而在长时期培养内获得双单倍体培养。通过愈伤组织培养可获得纯合体种子或突变植物。我们在再生培养中主要使用加入细胞激动素类激素的培养基。
由于插入了发生转座的转座子基因而遭到破坏的转座子基因可用探针进行检测，其制备方法为用转座子基因内适当的两个不同核苷酸序列设计一套引物，PCR扩增得到探针。检测转化水稻突变体与其基因之间的关系使得我们能够阐明该基因的功能。
用转座子标签系统(transposon tagging system)简单地确认一条被破坏的基因是一项具有挑战性的任务。现有许多方法如转座子显示等可直接确定转座子的确切整合部位。但是这些方法的操作方法往往都很复杂。本发明人用反向PCR建立了一种简单的方法。在这种方法中，在转座子基因内部设计PCR引物是一个非常重要的关键步骤。由植物中提取DNA，用合适的限制性内切酶消化DNA(我们在本例中用Alu I)，该内切酶在转座子基因内部必须没有酶切位点，再用连接酶使DNA发生分子内连接以形成环状分子。将所获环状DNA作为模板，设计一套引物进行PCR，该两个引物起初互相指向对方的相反方向，但在连接后的环状DNA分子内则互相指向对方。用于反向PCR的引物可以是至少包含来自SEQID NO1的5’端的10个连续碱基的寡聚核苷酸，以及至少包含来自SEQID NO1的3’端的10个连续碱基的寡聚核苷酸，优选方案为选择末端反向重复序列的内部区域(SEQ ID NO1的5’端和3’端的15个连续碱基)；或是包含与核苷酸序列互补的寡聚核苷酸。对所获PCR产物进行测序可明确转座子基因的整合部位。以应用非自主性转座子(SEQ ID NO1)为例，将增强子或启动子整合至非自主性转座子能诱导增强子或启动子与非自主性转座子一起发生转座。确切地说，将插入增强子或启动子的基因组转导入水稻或其他植物；或培养其花药；或用化学试剂对其进行处理；或诱导其基因组发生转座，我们能证明被转座基因组侧翼的其他基因组的活性表达，并且获得许多具有功能的突变体。
在上述例子中，我们可使用花椰菜花叶病病毒35s启动子作为启动子，以及35s启动子内的一系列四套增强子区域作为增强子(位于序列的-90～-440区域)。除携带SEQ ID NO1的基因组反向重复序列内部区域以外，对于增强子的整合位点没有任何其他限制。同样，除携带SEQ IDNO1的基因组反向重复序列内部区域，以及在其整合位点紧邻下游区域没有蛋氨酸存在以外，对于启动子的整合位点也没有任何其他限制。如果不影响转座子转座的话，增强子和启动子的优选整合位点都为SEQ IDNO1的250附近。我们可以使用将SEQ ID NO1基因组切成两段核苷酸片段的限制性内切酶酶切位点，或是使用PCR制备的克隆位点整合增强子和启动子。
发明作用由于长期以来人们不了解水稻基因，因此本发明第一次证明了水稻的可动性转座子基因。此外，本发明人还通过诸如花药培养等简单的方法证实了非自主性转座子基因是可转座的。也就是说我们成功地提供了一种使非自主性转座子基因发生人工转座的新方法。
在下文所列举的实施例中，我们证明了通过诸如花药培养等人工方法可使非自主性转座子基因缺失。此外，我们还直接证实了非自主性转座子基因插入的位点。由于我们发现了可实现人工转座的转座子基因，我们第一次成功地建立了水稻转座子标签系统。
本发明还进一步证实了水稻的转座子基因(SEQ ID NO2及3)，以及基因组内包括的转座酶基因。本发明人通过诸如花药培养或药物处理等简单的方法证实了转导入自主性转座子基因的水稻转座子基因可发生转座。也就是说本发明提供了转化这些植物的简单人工方法，籍此方法可将自主性转座子基因或转座酶基因人工转导入水稻或其他植物。
本发明的自主性转座子基因可用作随机诱变剂，以及在水稻及其他植物内建立转座子标签系统。本发明可用于制备数十种转座子随机发生转座的植物品种。由于植物在自然生长过程种发生自发转座的几率极小，因此可在植物组织培养所获的花药愈伤组织或5-氮胞苷处理的种子愈伤组织中有效地诱导转座的发生。有效诱导水稻以外的植物发生转座同样也是可行的，只需通过某种转化方法转导自主性转座子即可。所获突变植物的分析可通过基因分析或反向基因分析完成。
基因分析是一种分离导致突变体发生突变的原因基因的方法。如果本发明的转座子基因与某种突变体表现型相关，该表现型的原因基因可通过标签(转座子)被分离。
例如，如果希望寻找耐盐的水稻品种，可以通过检测转座子标签系统的种子培育而成的水稻的耐盐性，从而发现所需的水稻品种。
反向基因分析是一种由野生宿主群中分离失去某种基因功能的突变体的方法。如果用转座子标签标记某种所需基因，则该基因相关的表现型应该被突变。由不同的突变体分离DNA，并建立标签基因组文库。我们可由公共储存中心获取这样的转座子标签系统。通过筛选转座子标签系统，我们可用PCR将所需的基因-转座子作为一个整体分离。
基因组工程的最新进展使得制备一套与整个水稻基因组相对应的突变体以及与不同突变体相对应的转座子插入位点数据库成为可能。使用者可通过搜索该数据库定购所需的种子。
下文中列举的实施例能够详细说明本发明，但其原意并非为限制本发明的使用范围。
实施例1由一种水稻的栽培品种Nihonbare(Kikuchi等(1998)植物生物技术1545-48)提取DNA。为了扩增位于转座子DNA两端的两个末端反向重复序列之间的中心DNA区，我们用包含SEQ ID NO7的序列的寡聚核苷酸作为PCR引物。PCR反应系统为GeneAmp9600系统(ABI Co.)。每个反应体系(100μl)由200ng DNA，2.5单位TaKaRa Ex Taq酶(TakaraCo.)10μl 10×Ex Taq缓冲液，8μl dNTP混合物(每种dNTP为2.5mM)，以及200pmol引物组成。每个PCR循环包括94℃变性30秒，55℃复性1分钟，72℃延伸12分钟。总共35个循环。反应结束后，用1％SeaKemGTG琼脂糖凝胶(FMC Co.)分离DNA。扩增的DNA片段大约450bp，由凝胶回收DNA片段后用TA克隆试剂盒(In Vitrogen)将其亚克隆入pCRII-TOPO质粒。用310DNA测序仪(ABI Co.)对所有克隆进行测序。所确定的核苷酸序列被命名为SEQ ID NO1，由430bp组成。
实施例2由4种水稻栽培品种Nihonbare，Koshihikari，Hitombore及Yamahoushi的叶子提取DNA。为了用PCR扩增包含转座子基因(登记号AP002843)的DNA区域，我们用包含SEQ ID NO8及9的序列的寡聚核苷酸作为PCR引物。每个反应体系(100μl)由200ng DNA，2.5单位AmpliTaq Gold酶(ABI Co.)10μl 10×GeneAmp PCR缓冲液(含15mM MgCl2)，10μlGeneAmp混合物(每种dNTP为2mM)，以及200pmol引物组成。每个PCR循环包括96℃变性30秒，55℃复性1分钟，72℃延伸1分钟。总共35个循环。反应结束后，用2％LO3琼脂糖凝胶(Takara Co.)分离DNA。图2为琼脂糖凝胶电泳结果。仅在Nihonbare(第2泳道)上可见一在850bp附近的条带。850bp附近的条带提示该DNA片段包含实施例1中所述的SEQ ID NO1转座子基因(430bp)。同时在Koshihikari，Hitomebore和Yamahoushi中发现不包含转座子基因的DNA条带，大小为420bp。在这些水稻变种中，包含SEQ ID NO1的基因仅在Nihonbare中存在提示该基因的作用可能为转座元件。
对比例1
用3％次氯酸钠溶液处理Nihonbare种子15～30分钟使其灭菌，灭菌水漂洗后接种于内置20ml～30ml培养基的90mm×20mm的皮氏培养皿(Iwaki Co.)中，每个培养皿中接种9粒种子，30℃、光照下诱导培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中含有4g CHU(N6)BasalSalt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，0.1g内消旋肌醇(Sigma Co.)，2.878g脯氨酸(Wako)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(gelrite)(Wako)的固体培养基组成。在诱导培养的第10天，诱导种子的愈伤组织被植入内置20～30ml培养基的90×20mm的皮氏培养皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生长培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，0.1g内消旋肌醇(SigmaCo.)，2.878g脯氨酸(Wako)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。
在培养两周后由种子愈伤组织提取DNA。为了通过PCR扩增包含转座子DNA的DNA区域，我们用实施例2中提及的包含SEQ ID NO8及9的序列的寡聚核苷酸作为PCR引物。每个反应体系(100μl)由200ngDNA，2.5单位AmpliTaq Gold酶(ABI Co.)，10μl 10×GeneAmp PCR缓冲液(含15mM MgCl2)，10μl GeneAmp混合物(每种dNTP为2mM)，以及200pmol引物组成。每个PCR循环包括96℃变性30秒，55℃复性1分钟，72℃延伸1分钟。总共35个循环。反应结束后，用2％LO3琼脂糖凝胶(Takara Co.)分离DNA。图3为琼脂糖凝胶电泳结果。仅发现一条在850bp附近的条带。该850bp附近的条带提示该DNA片段包含转座子基因。缺失转座子基因的DNA片段预期大小为420bp，在电泳中却没有发现。发现大小在420bp附近的DNA条带的概率为0/64个愈伤组织(0％)。因此，该结果证明在种子愈伤组织中转座子基因是不可动的。
实施例3将Nihonbare的谷穗在出现前即收割下来，在10℃冷处理10天，再用1％次氯酸钠溶液灭菌1分钟，并用无菌水漂洗。将花药由花上摘下，接种于内置3ml液体培养基的35×10mm皮氏培养皿(CORNING Co.)中，每个培养皿中接种50个花药，30℃、光照下诱导培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)的液体培养基。在诱导培养3～4周后，诱导花药的愈伤组织被植入内置20～30ml培养基的90×20mm的皮氏培养皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生长培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4gCHU(N6)Basal Salt Mixture(SigmaCo.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2ml α-萘乙酸溶液(Sigma Co.)，2ml激动素溶液(Sigma Co.)，3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。
在培养两周后由花药愈伤组织提取DNA。为了通过PCR扩增包含转座子DNA的DNA区域，我们用实施例2中提及的包含SEQ ID NO8及9的序列的寡聚核苷酸作为PCR引物。每个反应体系(100μl)由200ngDNA，2.5单位AmpliTaq Gold酶(ABI Co.)10μl 10×GeneAmp PCR缓冲液(含15mM MgCl2)，10μl GeneAmp混合物(每种dNTP为2mM)，以及200pmol引物组成。每个PCR循环包括96℃变性30秒，55℃复性1分钟，72℃延伸1分钟。总共35个循环。反应结束后，用2％LO3琼脂糖凝胶(Takara Co.)分离DNA。图4为琼脂糖凝胶电泳结果。如图4所示，有两条分别位于850bp和420bp的DNA条带。850bp附近的条带提示该DNA片段包含转座子基因。420bp附近的条带提示该DNA片段缺失转座子基因。发现大小在420bp附近的DNA条带的概率为11/64个愈伤组织(17.2％)。
本实施例中大小为420bp左右的DNA条带提示该片段缺失转座子基因，且是花药愈伤组织的PCR产物，将所扩增的DNA片段(大小为420bp左右，N＝5)由凝胶上回收，并用TA克隆试剂盒(In Vitrogen)将其亚克隆至pCRII-TOPO质粒。用310DNA测序仪对这5个克隆进行了测序。这些核苷酸序列的比对证明了在这5个克隆中转座子基因的缺失(数据在本文中未显示)。因此，本发明人在核苷酸序列水平上证实了转座子基因的缺失。
在对比例1中，子叶盘(种子)细胞培养的转座子基因是不可动的，但是在本实施例中，花药细胞培养物的转座子基因在很大概率上是可动的。
实施例4将Nihonbare的谷穗在出现前即收割下来，在10℃冷处理10天，再用1％次氯酸钠溶液灭菌1分钟，并用无菌水漂洗。将花药由花上摘下，接种于内置3ml液体培养基的35×10mm皮氏培养皿(CORNING Co.)中，每个培养皿中接种50个花药，30℃、光照下诱导培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)的液体培养基。在诱导培养3～4周后，诱导花药的愈伤组织被植入内置20～30ml培养基的90×20mm的皮氏培养皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生长培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(SigmaCo.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2ml α-萘乙酸溶液(Sigma Co.)，2ml激动素溶液(Sigma Co.)，3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。将生长培养两周后的花药愈伤组织移植入内置20～30ml培养基的90×20mm皮氏培养皿中，30℃、光照下再生培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4.3g MS Basal Salt Mixture(Gibcobrl Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。
用CTBA法由9棵花药愈伤组织再生幼苗提取DNA。用限制性内切酶Hind III消化所提取的DNA，0.8％LO3琼脂糖(Takara Co.)凝胶电泳，再通过碱印迹法将DNA转移至尼龙膜上(HybondN+)(AmershamCo.)。Southern杂交用试剂盒为DIG发光DNA检测试剂盒(Roche Co.)。用于制备探针的是PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Co.)。为了通过PCR扩增包含转座子DNA的内部DNA区域，我们用实施例2中提及的包含SEQ ID NO10及11(两者都位于SEQ ID NO1(转座子基因)的内部)的序列的寡聚核苷酸作为PCR引物。图5为琼脂糖凝胶电泳结果。如图5所示，与Nihonbare对照相比较，在第2和第6泳道发现了两条新的条带(箭头所示)。这两条条带表明转座子基因插入了这些幼苗，并随后被破坏。
在本实施例的基础上，转座子基因插入新的基因位点这一事实得到了证实。此外，如图6所示还在再生水稻中发现了一个形态学突变的例子(其相关基因尚未发现)，该突变例可能提示有形态学相关基因由于转座子基因的插入而遭到破坏。
实施例5用3％次氯酸钠溶液处理Nihonbare种子15～30分钟使其灭菌，灭菌水漂洗后接种于内置20～30ml培养基的90×20mm的皮氏培养皿(IwakiCo.)中，每个培养皿中接种9粒种子，30℃、光照下诱导培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，0.1g内消旋肌醇(SigmaCo.)，2.878g脯氨酸(Wako)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。
数天后，水稻种子子叶盘内开始形成愈伤组织，并在培养的第10天逐渐变成乳白色，长度达到5mm。将该5mm长、乳白色的愈伤组织分别移植入添加了0mM、0.01mM、0.03mM、0.05mM、0.1mM或0.3mM5-氮胞苷(Sigma Co.)的生长培养基中，并在30℃、光照下生长培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal SaltMixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，0.1g内消旋肌醇(Sigma Co.)，2.878g脯氨酸(Wako)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。
在生长培养基中培养两周后，用Dneasy植物袖珍型试剂盒(QIAGEN)提取种子愈伤组织DNA。为了通过PCR扩增包含转座子DNA的DNA区域，我们用包含SEQ ID NO12及13的寡聚核苷酸作为PCR引物。
我们用HotStarTaq Master Mix试剂盒(QIAGEN)制备PCR反应混合物。
每个PCR循环包括96℃变性30秒，55℃复性1分钟，72℃延伸1分钟。总共45个循环。反应结束后，用2％LO3琼脂糖凝胶(Takara Co.)分离DNA。
在添加了0.03mM～0.3mM 5-氮胞苷的培养基中培养得到的愈伤组织DNA中，可观察到两条分别位于730bp和300bp的条带(图7)。730bp附近的条带提示该DNA包含一转座子基因。而300bp附近的条带则提示该DNA不包含转座子基因(430bp)。
将300bp的DNA片段由凝胶上回收，并用TA克隆试剂盒(InVitrogen)将其亚克隆至pCRII-TOPO质粒。用310DNA测序仪(ABI Co.)对所获4个克隆进行测序。图8为该4个克隆核苷酸序列的多重比对。在这4个克隆中均未发现转座子基因序列。
本实施例显示，一种去甲基化试剂5-氮胞苷甚至可在种子愈伤组织中诱导本发明转座子基因的转座。在此结果的基础上，我们可预期用一粒种子可获得数百个由该转座子基因转座的克隆。
实施例6将Nihonbare的谷穗在出现前即收割下来，在10℃冷处理10天，再用1％次氯酸钠溶液灭菌1分钟，并用无菌水漂洗。将花药由花上摘下，接种于内置3ml液体培养基的35×10mm皮氏培养皿(CORNING Co.)中，每个培养皿中接种50个花药，30℃、光照下诱导培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)的液体培养基。在诱导培养3～4周后，诱导花药的愈伤组织被植入内置20～30ml培养基的90×20mm的皮氏培养皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生长培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(SigmaCo.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2ml α-萘乙酸溶液(Sigma Co.)，2ml激动素溶液(Sigma Co.)，3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。将生长培养两周后的花药愈伤组织移植入内置20～30ml培养基的90×20mm皮氏培养皿中，30℃、光照下再生培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4.3g MS Basal Salt Mixture(Gibcobrl Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，10ml 6-苄氨基嘌啉溶液(Sigma Co.)，2ml α-萘乙酸溶液(Sigma Co.)，3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。
在生长培养基中培养两周后，提取花药愈伤组织DNA(Kikuchi等(1998)植物生物技术1545-48)。为了通过PCR扩增包含转座子DNA的DNA区域，我们用包含SEQ ID NO14(AP004236的第88933～88962位碱基)及SEQ ID NO15(AP004236的第95545～95574位碱基)的序列的寡聚核苷酸作为PCR引物。每个反应体系(100μl)由200ng DNA，2.5单位TaKaRa LA Taq酶(Takara Co.)，10μl 10×LAPCR缓冲液II，6μl 25mM MgCl2，8μl dNTP混合物(每种dNTP为2.5mM)，以及100pmol引物组成。
每个PCR循环包括94℃变性30秒和68℃延伸12分钟。总共35个循环。反应结束后，用0.8％LO3琼脂糖凝胶(Takara Co.)分离DNA。位于6.6kbp附近的条带提示该DNA条带包含本发明转座子基因(5341bp)。由于本发明转座子基因的大小约为5.4kbp，因此我们可预计位于1.2kbp附近的条带缺失该转座子基因。本实施例中获得一位于1.2kbp附近的DNA条带(图13)。以上这些结果表明花药愈伤组织的转座子基因是可动的。发现大小在1.2kbp附近的DNA条带的概率为3/64个愈伤组织(4.7％)。本实施例证明水稻携带SEQ ID NO2的MITE在花药愈伤组织内是可动的。
对比例2将水稻的一个栽培品种Nihonbare的种子用3％次氯酸钠溶液处理15～30分钟使其灭菌，灭菌水漂洗后接种于内置20～30ml培养基的90×20mm的皮氏培养皿(Iwaki Co.)中，每个培养皿中接种9粒种子，30℃、光照下诱导培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，0.1g内消旋肌醇(Sigma Co.)，2.878g脯氨酸(Wako)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。在诱导培养的第10天，诱导种子的愈伤组织被植入内置20～30ml培养基的90×20mm的皮氏培养皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生长培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal SaltMixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，0.1g内消旋肌醇(Sigma Co.)，2.878g脯氨酸(Wako)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。在生长培养基内培养两周后由种子愈伤组织提取DNA(Kukuchi等(1998)植物生物技术1545-48)。为了通过PCR扩增包含转座子DNA的DNA区域，我们用包含SEQ IDNO14及15的序列的寡聚核苷酸作为PCR引物。每个反应体系(100μl)由200ng DNA，2.5单位TaKaRa LA Taq酶(Takara Co.)10μl 10×LAPCR缓冲液II，6μl 25mM MgCl2，8μl dNTP混合物(每种dNTP为2.5mM)，以及100pmol引物组成。每个PCR循环包括94℃变性30秒和68℃延伸12分钟。总共35个循环。反应结束后，用0.8％LO3琼脂糖凝胶(TakaraCo.)分离DNA。在所有种子愈伤组织样品中均可发现一条位于6.6kbp附近的DNA条带，但却没有位于1.2kbp附近的条带(图13)。该结果提示在种子愈伤组织中转座子基因是不可动的。发现大小在1.2kbp附近的DNA条带的概率为0/64个愈伤组织(0％)。
实施例7在本实施例中，为了寻找不携带自主性转座子基因(SEQ ID NO2)的栽培品种，并阐明在携带与不携带自主性转座子基因(SEQ ID NO2)的愈伤组织内非自主性转座子基因的转座效率之间是否有区别，我们由各栽培品种诱导了不携带自主性转座子基因(SEQ ID NO2)的花药愈伤组织，并检测了其中非自主性转座子基因的转座效率。用CTAB法提取了四种水稻栽培品种Nihonbare、Koshihikari、Taichung No.65和Kasarasu叶子DNA。所提取DNA用限制性内切酶HindIII消化，1.0％LO3琼脂糖凝胶电泳分离，碱印迹法将DNA转移至尼龙膜(HybondN+，Amersham Co.)后，用DIG发光DNA检测试剂盒(RocheCo.)进行Southern杂交检测。制备探针所用试剂盒为PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Co.)为了通过PCR扩增自主性转座子基因特异性DNA区域，我们用包含SEQ ID NO16及17的序列的寡聚核苷酸作为PCR引物。Southern杂交的结果显示在Nihonbare和Koshihikari中各有一个自主性转座子基因的拷贝存在，但在Taichung No.65和Kasarasu中则没有(图14)。
随后我们由Taichung No.65花药诱导了愈伤组织，并对非自主性转座子基因(SEQ ID NO1)是否发生转座进行了检测。
将Taichung No.65的谷穗在形成前即由顶芽上收割下来，10℃冷处理10天，1％次氯酸钠溶液灭菌处理1分钟后无菌水漂洗。将花药由颖果上摘下，接种于内置3ml液体培养基的35×10mm皮氏培养皿(CORNINGCo.)中，每个培养皿中接种50个花药，30℃、光照下诱导培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)的液体培养基。在诱导培养3～4周后，诱导花药的愈伤组织被植入内置20～30ml培养基的90×20mm的皮氏培养皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生长培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(SigmaCo.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2ml α-萘乙酸溶液(Sigma Co.)，2ml激动素溶液(Sigma Co.)，3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。
在生长培养基内培养两周后由花药愈伤组织提取DNA(Kukuchi等(1998)植物生物技术1545-48)。为了通过PCR扩增自主性转座子基因特异性DNA区域，我们用包含SEQ ID NO18及19(L02)、SEQ ID NO20及21(L06)、SEQ ID NO22及23(L07)的序列的寡聚核苷酸作为PCR引物。每个反应体系(100μl)由200ng DNA，2.5单位AmpliTaq Gold酶(ABI Co.)，10μl 10×GeneAmp PCR缓冲液(包含15mM MgCl2)，10μl Gene Amp混合物(每种dNTP为2mM)，以及200pmol引物组成。每个PCR循环包括96℃变性30秒，55℃复性1分钟，以及72℃延伸1分钟。总共35个循环。反应结束后，用2％LO3琼脂糖凝胶(Takara Co.)电泳分离DNA。结果显示在不携带自主性转座子基因(SEQ ID NO1)的Taichung No.65的L02、L06和L07位点都没有发生非自主性转座子基因的转座(表2，第一行)。但是如对比例3中所示，在携带自主性转座子基因(SEQ ID NO2)的Nihonbare花药愈伤组织中，非自主性转座子基因以高效率(10.9％～31.3)发生转座。
表2

对比例3将Nihonbare的谷穗在出现前即收割下来，在10℃冷处理10天，再用1％次氯酸钠溶液灭菌1分钟，并用无菌水漂洗。将花药由花上摘下，接种于内置3ml液体培养基的35×10mm皮氏培养皿(CORNING Co.)中，每个培养皿中接种50个花药，30℃、光照下诱导培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)的液体培养基。在诱导培养3～4周后，诱导花药的愈伤组织被植入内置20～30ml培养基的90×20mm的皮氏培养皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生长培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(SigmaCo.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2ml α-萘乙酸溶液(Sigma Co.)，2ml激动素溶液(Sigma Co.)，3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。在生长培养基内培养两周后由花药愈伤组织提取DNA。为了通过PCR扩增包含转座子基因DNA的DNA区域，我们用实施例7中提及的包含SEQ ID NO5及1的序列的寡聚核苷酸作为PCR引物。每个反应体系(100μl)由200ngDNA，2.5单位AmpliTaq Gold酶(ABI Co.)，10μl 10×GeneAmp PCR缓冲液(包含15mM MgCl2)，10μl Gene Amp混合物(每种dNTP为2mM)，以及200pmol引物组成。每个PCR循环包括96℃变性30秒，55℃复性1分钟，以及72℃延伸1分钟。总共35个循环。反应结束后，用2％LO3琼脂糖凝胶(Takara Co.)电泳分离DNA。我们发现两条位于850bp和420bp附近的DNA条带。850bp附近的条带提示该DNA包含一转座子基因。而420bp附近的条带则提示这些DNA片段中缺失了转座子基因。发现大小在420bp附近的DNA条带的概率为11/64个愈伤组织(17.2％)。
实施例8在本实施例中，我们分离了包含自主性转座子基因(SEQ ID NO2)的DNA区域，将其转导入不携带自主性转座子基因(SEQ ID NO2)的栽培品种(Taichung No.65)内，并检测该栽培品种中非自主性转座子基因(SEQ ID NO1)发生转座的概率。
为了扩增一水稻栽培品种Nihonbare包含自主性转座子基因(SEQ IDNO2)的DNA区域，我们设计了两个引物核苷酸序列SEQ ID NO24和25以进行PCR反应，两者的序列分别位于目的DNA区域(SEQ ID NO2)的紧邻上游和下游。我们合成了SEQ ID NO24和25的寡聚核苷酸，并用其作为PCR引物。用CTAB法提取Nihonbare叶子DNA。每个反应体系(100μl)由200ng DNA，2.5单位TaKaRa LA Taq酶(Takara Co.)，10μl 10×LAPCR缓冲液II，6μl 25mM MgCl2，8μl dNTP混合物(每种dNTP为2.5mM)，以及100pmol引物组成。每个PCR循环包括94℃变性30秒以及68℃延伸1分钟。总共35个循环。反应结束后，用0.8％LO3琼脂糖凝胶(Takara Co.)电泳分离DNA。我们获得了包含自主性转座子基因、大小约为6.6kbp的DNA条带。切胶回收DNA片段(6.6kbp附近)，并用TA克隆试剂盒(In Vitrogen)将其亚克隆至pCRII-TOPO质粒，选择ApaI和KpnI作为酶切位点将多克隆位点由pCRII-TOPO质粒中切除出来，亚克隆至携带一选择性标记物基因(耐潮霉素基因)且能用于植物转染的二元载体，并用电穿孔法将其转导入重组质粒转化土壤杆菌(Agrobacteria)EHA101。重组质粒转化土壤杆菌感染花药愈伤组织三天前，将重组质粒转化土壤杆菌划线接种至含有卡那霉素(Wako)和潮霉素(Wako)的AB培养基上。
随后，将包含自主性转座子基因(SEQ ID NO2)的DNA片段(约6.6kbp)由重组质粒转化土壤杆菌介导转导至一水稻栽培品种TaichungNo.65的花药愈伤组织内。
将Taichung No.65的谷穗在出现前即收割下来，在10℃冷处理10天，再用1％次氯酸钠溶液灭菌1分钟，并用无菌水漂洗。将花药由花上摘下，接种于内置3ml液体培养基的35×10mm皮氏培养皿(CORNING Co.)中，每个培养皿中接种50个花药，30℃、光照下诱导培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)的液体培养基。在诱导培养3～4周后，诱导花药的愈伤组织被植入内置20～30ml培养基的90×20mm的皮氏培养皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生长培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(SigmaCo.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2ml α-萘乙酸溶液(Sigma Co.)，2ml激动素溶液(Sigma Co.)，3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。
在生长培养基内培养两周后，用重组质粒转化土壤杆菌转染TaichungNo.65花药愈伤组织。将重组质粒转化土壤杆菌划线接种至AB培养基表面培养3天后，用刮铲将其刮下，与添加了10mg/L乙酰丁香酮的AAM培养基(25ml)混匀。将混有转染用重组质粒转化土壤杆菌的培养基置于皮氏培养皿(IWAKI)内。将于生长培养基内培养两周的花药愈伤组织置于金属丝网内，浸入转染混合培养基2分钟。随后将金属丝网置于无菌纸巾上以除去多余培养基。用镊子将滤纸固定于共生培养基上，将愈伤组织置于滤纸上，外科胶带密封，28℃黑暗中培养3天。我们所使用的共生培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)，10g葡萄糖(Wako)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)，10mg乙酰丁香酮的固体培养基。共生培养3天后，将愈伤组织置于锥形瓶内，加入100ml无菌水，振荡后将水弃去。用无菌水洗涤数次后，再用添加了500mg/ml carbenisillin的漂洗液洗涤后，将愈伤组织移植入皮氏培养皿内，每个培养皿内植入9个愈伤组织，外科胶带密封后25℃光下培养一个月。我们所使用的选择培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，2.878g脯氨酸(ICN)，0.1g内消旋肌醇(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，500mg潮霉素(Wako)，50mg羧苄青霉素(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。
在选择培养基内培养3～4周后，我们检测了耐潮霉素愈伤组织内Nihonbare自主性转座子基因以及非自主性转座子基因(SEQ ID NO1)可能发生的转座。
根据(Kikuchi等(1998)植物生物技术1545-48)内所述方法由耐潮霉素愈伤组织提取DNA。为了通过PCR扩增包含自主性转座子基因(SEQ ID NO2)的DNA区域，我们用包含分别位于目的DNA区域(SEQID NO2)紧邻上游和下游的SEQ ID NO24及25的序列的寡聚核苷酸作为PCR引物。
每个反应体系(100μl)由200ng DNA，2.5单位TaKara LA Taq酶(Takara Co.)，10μl 10×LA PCR缓冲液，6μl 25mM MgCl2，8μl dNTP混合物(每种dNTP为2.5mM)，以及100pmol引物组成。每个PCR循环包括94℃变性30秒以及68℃延伸12分钟。总共35个循环。反应结束后，用0.8％LO3琼脂糖凝胶(Takara Co.)电泳分离PCR产物。如图15所示，我们证实了Nihonbare自主性转座子基因在耐潮霉素的TaichungNo.65愈伤组织中发生了转座。
为了通过PCR扩增包含非自主性转座子基因的DNA区域，我们用包含SEQ ID NO18及19(L02)、SEQ ID NO20及21(L06)、SEQ ID NO22及23(L07)的序列的寡聚核苷酸作为PCR引物。我们用HotStarTaqMaster Mix试剂盒(QIAGEN)制备PCR反应混合物。每个PCR循环包括96℃变性30秒，55℃复性1分钟，以及72℃延伸2分钟。总共45个循环。反应结束后，用2％LO3琼脂糖凝胶(Takara Co.)电泳分离DNA。我们检测了38个转导入自主性转座子基因的愈伤组织内非自主性转座子基因缺失的概率，结果发现一DNA条带(箭头所示)，该条带提示在L06基因位点有非自主性转座子基因的缺失(图16)。非自主性转座子基因在L02、L06、L07基因位点缺失的概率约为0～5.3％(表2，第2行)。
将提示非自主性转座子基因在L02和L06基因位点缺失的DNA片段由凝胶回收，并用TA克隆试剂盒(In Vitrogen)亚克隆至pCRII-TOPO质粒。用310DNA测序仪(ABI Co.)测定所获克隆的核苷酸序列。结果发现这些克隆中都没有非自主性转座子基因(图17、18)。
上述结果显示在转导入Nihonbare自主性转座子基因的TaichungNo.65花药愈伤组织内非自主性转座子基因被诱导发生了转座。
在上述结果的基础上，我们可得出如下结论，即SEQ ID NO2所表达的转座子基因不仅能在花药愈伤组织内自主转座，还能调节非自主性转座子基因的转座。
实施例9在本实施例中，我们检测了SEQ ID NO3在经5-氮胞苷处理的花药愈伤组织以及子叶盘愈伤组织内的转座活性。
将Nihonbare的谷穗在出现前即收割下来，在10℃冷处理10天，再用1％次氯酸钠溶液灭菌1分钟，并用无菌水漂洗。将花药由花上摘下，接种于内置3ml液体培养基的35×10mm皮氏培养皿(CORNING Co.)中，每个培养皿中接种50个花药，30℃、光照下诱导培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，30g蔗糖(Wako)的液体培养基。在诱导培养3～4周后，诱导花药的愈伤组织被植入内置20～30ml培养基的90×20mm的皮氏培养皿(Iwaki Co.)中，30℃、光照下生长培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(SigmaCo.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2ml α-萘乙酸溶液(Sigma Co.)，2ml激动素溶液(Sigma Co.)，3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。在生长培养基内培养两周后根据(Kikuchi等(1998)植物生物技术1545-48)内所述方法由花药愈伤组织提取DNA。
将水稻的一个栽培品种Nihonbare的种子用3％次氯酸钠溶液处理15～30分钟使其灭菌，灭菌水漂洗后接种于内置20～30ml培养基的90×20mm的皮氏培养皿(Iwaki Co.)中，每个培养皿中接种9粒种子，30℃、光照下诱导培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4g CHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(Sigma Co.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，0.1g内消旋肌醇(Sigma Co.)，2.878g脯氨酸(Wako)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。在诱导培养的第10天，诱导种子的愈伤组织被植入内置20～30ml添加了0mM、0.1mM、0.5mM 5-氮胞苷(Sigma Co.)的生长培养基中，30℃、光照下生长培养24小时。我们所使用的培养基为1L培养基中包含4gCHU(N6)Basal Salt Mixture(Sigma Co.)，1ml MS维生素溶液(SigmaCo.)，2mg 2，4-二氯苯氧乙酸(Sigma Co.)，0.3g酪蛋白氨基酸(DIFCO)，0.1g内消旋肌醇(Sigma Co.)，2.878g脯氨酸(Wako)，30g蔗糖(Wako)，2g脱乙酰吉兰糖胶(Wako)的固体培养基。在生长培养基内培养两周后用Dneasy植物袖珍试剂盒(Qiagen)由种子愈伤组织提取DNA。
为了通过PCR扩增包含转座子DNA的DNA区域，我们用包含SEQID NO26及27的序列的寡聚核苷酸作为PCR引物。每个反应体系(100μl)由200ng DNA，2.5单位TaKaRa LA Taq酶(Takara Co.)10μl10×LAPCR缓冲液II，6μl 25mM MgCl2，8μl dNTP混合物(每种dNTP为2.5mM)，以及100pmol引物组成。每个PCR循环包括94℃变性30秒和68℃延伸12分钟。总共35个循环。反应结束后，用0.8％LO3琼脂糖凝胶(Takara Co.)分离PCR产物。
结果显示包含SEQ ID NO3的核苷酸序列的转座子基因在花药愈伤组织和子叶盘愈伤组织中均没有发生转座，但在经5-氮胞苷处理的子叶盘愈伤组织中转座的发生率很高(表3)。
表3

包含SEQ ID NO3的核苷酸序列的转座子基因有一自主性转座子基因的结构，其中还包括一转座酶的编码序列，因此可被5-氮胞苷活化，并控制非自主性转座子基因(SEQ ID NO1)的转座。
实施例10用Dneasy植物袖珍试剂盒(QIAGEN)提取一水稻栽培品种Kasarasu的成熟叶DNA。为了通过PCR扩增紧邻插入转座子基因的DNA区域，我们使用反向PCR法。我们包含来自SEQ ID NO1的5’端15个碱基(5’-CCATTGTGACTGGCC-3’)的寡聚核苷酸作为PCR引物。PCR所使用的系统为GeneAmp9600系统(ABI Co.)。用于制备PCR反应溶液的使HotStarTaq Master Mix试剂盒(QIAGEN)。每个PCR循环包括96℃变性30秒，44～58℃复性1分钟，以及72℃延伸1分钟。总共45个循环。反应结束后，用2％LO3琼脂糖凝胶(Takara Co.)电泳分离PCR产物。将所扩增的DNA片段用TA克隆试剂盒(In Vitrogen)亚克隆至pCRII-TOPO质粒。用310 DNA测序仪(ABI Co.)测定所获克隆的核苷酸序列。
序列表<110>独立行政法人 科学技术振兴机构<120>水稻转座子基因<130>FS02-290PCT<160>27<210>1<211>430<212>DNA<213>水稻<400>1ggccagtcac aatgggggtt tcactggtgt gtcatgcaca tttaataggg gtaagactga 60ataaaaaatg attatttgca tgaaatgggg atgagagaga aggaaagagt ttcatcctgg 120tgaaactcgt cagcgtcgtt tccaagtcct cggtaacaga gtgaaacccc cgttgaggcc 180gattcgtttc attcaccgga tctcttgcgt ccgcctccgc cgtgcgacct ccgcattctc 240ccgcgccgcg ccggattttg ggtacaaatg atcccagcaa cttgtatcaa ttaaatgctt 300tgcttagtct tggaaacgtc aaagtgaaac ccctccactg tggggattgt ttcataaaag 360atttcatttg agagaagatg gtataatatt ttgggtagcc gtgcaatgac actagccatt 420gtgactggcc430<210>2<211>5341<212>DNA<213>水稻<400>2ggccagtcac aatggaggtt tcactggtgt gtcatgcaca tttaataggg gtaagactga 60ataaaaaatg attatttgca tgaaatgggg atgagagaga aggaaagagt ttcatcctgg 120tgaaactcgt cagcgtcgtt tccaagtcct cggtaacaga gtgaaacccc cgttgaggcc 180gattcgtttc attcaccgga tctcttgcgt ccgcctccgc cgtgcgacct ccgcattctc 240ccgcgccgcg ccgcgccacg cctccttccc gcgtgaacat tcctccttcc cgcgcgagcg 300attccaccat ctcccccgtc cggcgcctac ggagtacacc gcaaccggtc gccccaatcc 360ggcgcctaga ccgtgaccca cccgccatct tccgcaagac cgaatcccca acccacccac 420catcttccgc cgcccccgtc cccgtccccg gccatggatc cgtcgccggc cgtggatccg 480tcgccggccg tggatccgtc gccggctgct gaaacccggc ggcgtgcaac cgggaaagga 540ggcaaacagc gcgggggcaa gcaactagga ttgaagaggc cgccgccgat ttctgtcccg 600gccaccccgc ctcctgctgc gacgtcttca tcccctgctg cgccgacggc catcccacca 660cgaccaccgc aatcttcgcc gattttcgtc cccgattcgc cgaatccgtc accggctgcg 720ccgacctcct ctcttgcttc ggggacatcg acggcaaggc caccgcaacc acaaggagga 780ggatggggac caacatcgac catttcccca aactttgcat ctttctttgg aaaccaacaa 840gacccaaatt catggtacat gtattttctt ctttttctgt tactttcaac ctacggtaac 900tctaattcat ggatgagact actgccattg tgcagttcaa tgctttttct tcatgttata 960tttcgtccag ctgtgagtta tggtttgaag attgctgtgg ttgtttcatt gctgagtatg 1020tgaaagatag atggatgaaa gagagaatta tattttagtc tgtaatcttg ctcatccagt 1080tgctcatgta tgaccttggt tctagaatgt tgccctgact gtatgcttaa tgttcagaga 1140agtgatgcct aaagcagtga gatcagtggg atcagattag ctatcgacat ataatattag 1200ctatctcagt tgtgaaagag agatgggtga aaaggcaccc cttggattaa ttctgtagta 1260tcaaattctg caccttgtct gtccatatgt tctgcttggt tggtgggtgc agtgcatttg 1320taaaaaatag tttgcttctg atccttaata tatgtaacag ggaatgaatt ttcacccatc 1380tcagttgtaa aggtactgtc ttgctatgca atatgtgtaa attgacaaac ctgaaaatag 1440tctgtttgga atttgcaaaa gcaattcgat agtttggaat ttccaaacct cagtcagcag 1500taggcaatcc attttagttc ttgctatgca caaaaacagt acacctgata tgctcatttt 1560aatacaactt ttttgtctct gttacagttt ggtcaggggt tatcctccag gagggtttgt 1620caattttatt caacaaaatt gtccgccgca gccacaacag caaggtgaaa attttcattt 1680cgttggtcac aatatgggat tcaacccaat atctccacag ccaccaagtg cctacggaac 1740accaacaccc caagctacga accaaggcac ttcaacaaac attatgattg atgaagagga 1800caacaatgat gacagtaggg cagcaaagaa aagatggact catgaagagg aagagagact 1860ggtattcatc ggatactttt acatttccat atgtctttgt tttgactaat acttgacagg 1920tcattaactg attcttgtag gccagtgctt ggttgaatgc ttctaaagac tcaattcatg 1980ggaatgataa gaaaggtgat acattttgga aggaagtcac tgatgaattt aacaagaaag 2040ggaatggaaa acgtaggagg gaaattaacc aactgaaggt tcactggtca aggttgaagt 2100cagcgatctc tgagttcaat gactattgga gtacggttac tcaaatgcat acaagcggat 2160actccgacga catgcttgag aaagaggcac agaggctgta tgcaaacagg tttggaaaac 2220cttttgcgtt ggtccattgg tggaagatac tcaaagatga gcccaaatgg tgtgctcagt 2280ttgaatcaga gaaagacaag agcgaaatgg atgctgttcc agaacagcag tcacgtccta 2340ttggtagaga agcagcaaag tctgagcgca atggaaagcg caagaaagaa aatgttatgg 2400aaggcattgt cctcctaggg gacaatgtcc agaaaattat aaaggtccac gaagaccgga 2460
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<213>人工序列<400>23gaaaagaaaa acaaacaaga a 21<210>24<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>24gggtgagtga agtgagtgag tgagcagcat 30<210>25<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>25agttagggga ggagagttgg gcataggaat 30<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>26cctcacaacc aatccctacc a 21<210>27<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>27agccaccaca ataaccaaag t 21权利要求
1.一种水稻转座子基因，其由一种核苷酸序列组成，该核苷酸序列与SEQ ID NO3具有至少90％的同源性。
2.一种水稻转座酶基因，其由一种核苷酸序列组成，该核苷酸序列与SEQ ID NO3的第2959～4407位碱基具有至少75％的同源性。
3.编码一种蛋白质的转座酶基因，所述的蛋白质包含SEQ ID NO5的氨基酸序列、或在该氨基酸序列中发生一或数个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。
4.一种转座酶，其包含SEQ ID NO5的氨基酸序列、或在该氨基酸序列中发生一或数个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。
5.含有权利要求1的转座子基因的质粒。
6.含有一种启动子及权利要求2或3的转座酶基因的质粒。
7.使水稻转座子基因发生转座的方法，包括对导入了权利要求1所述的转座子基因的转化体进行花药培养或用化学试剂进行处理，所述水稻转座子基因包含与SEQ ID NO1具有至少95％的同源性的核苷酸序列。
8.权利要求7的方法，其中的宿主为植物。
9.权利要求8的方法，其中所述的植物为水稻、大麦、小麦或玉米。
10.使水稻转座子基因发生转座的方法，包括对导入了一种启动子及权利要求2或3所述的转座酶基因的转化体进行花药培养或用化学试剂进行处理，所述水稻转座子基因包含与SEQ ID NO1具有至少95％的同源性的核苷酸序列。
11.权利要求10的方法，其中的宿主为植物。
12.权利要求11的方法，其中所述的植物为水稻、大麦、小麦或玉米。
13.权利要求7至12中任一项的方法，其中所述的化学试剂为5-氮胞苷或5-氮脱氧胞嘧啶。
全文摘要
本发明涉及水稻(Oryza sativa)非自主性转座子基因，自主性转座子基因，以及转座酶基因，同时还涉及使转座子基因发生转座的方法以及通过转座而转化的植物。本发明人检测了水稻基因组核苷酸序列，发现了非自主性转座子基因，自主性转座子基因和转座酶基因，并证实了转导入这些基因的水稻栽培品种中转座子的转座。
文档编号C12N9/00GK1920037SQ200610095860
公开日2007年2月28日 申请日期2002年11月6日 优先权日2001年11月8日
发明者菊池一浩, 平野博之, 和田正三 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构