专利名称：核酸测序过程中悬臂的应用的制作方法
发明
背景技术：
领域 在此描述的方法和仪器涉及分子生物学和核酸分析的领域。特别的是，所公开的方法和仪器涉及通过检测在掺入标记的核苷酸过程中质量和/或表面应力的变化对核酸进行测序。
背景技术：
遗传信息以组织进入染色体中的脱氧核糖核酸(DNA)的非常长分子的形式被储存的。人类基因组含有大约30亿个DNA序列碱基。DNA序列的信息决定了每个个体的多种特征。许多普遍的疾病至少部分是以DNA序列变异为基础的。
人类基因组整个序列的测定为鉴定这些疾病的遗传基础提供了基础。但大量的工作仍需进行，以便鉴定与每种疾病相关的遗传变异。这需要对表现有每种疾病的个体或家族中的部分染色体进行DNA测序，以便鉴定可促进疾病的DNA序列的特殊变化。核糖核酸(RNA)，一种遗传信息加工过程中的中间分子，也被测序以鉴定多种疾病的遗传基础。
以检测已根据大小被分开的荧光标记核酸为基础的已有的核酸测序方法，受被测序的核酸长度的限制。典型地，一次仅有500至1,000个核酸序列碱基可被测定。这比DNA的功能单位长度要短的多，功能单位是指基因，长度为数万甚至数十万的碱基。使用目前的方法，测定一条完整的基因序列需要产生基因的多个拷贝，切断成为多个重叠的片段并测序，之后重叠的DNA序列被组装成完整的基因。这个过程是非常费力的，花费较大，效率较低，并浪费时间。也可典型地需要使用荧光或放射活性标记，也潜在地存在安全性和废物处置问题。
最近，已经开发了许多核酸测序的方法，涉及与已确定序列、附着在DNA芯片上特定位置的短核苷酸杂交。这种方法可用来推断短核苷酸序列或在样品中检测特异核酸的存在，但不适合鉴定长的核酸序列。
附图简述 下面的图表构成了部分说明书，并被包含在此，以进一步说明本发明的某些实施方案。参考这些图表中的一个或多个，结合在此提供的详细描述，可以更好地理解这些实施方案。
图1图解说明了用于核酸214分析的一个实例仪器100(未按比例绘制)。
图2A，2B和2C图解说明了核酸214分析的另一个实例仪器100(未按比例绘制)。
图3图解说明了测序数据的一个实例，该数据可采用在此描述的方法和仪器100来产生。
图4图解说明了测序数据的另一个实例，该数据可采用在此所描述的方法和仪器100来产生。
说明性实施方案的描述定义 如在此所使用的，“一个(a)”和“一个(an)”的含义是一种对象中的一个或多个。
如在此所使用的，“大约”的含义是在一个数量5％的加减范围内。例如，“大约100”的含义为在95至105之间的任何数量。
如在此所使用的，“可操作连接”的含义是在两个或多个单位之间功能性的相互作用。例如，检测单位118可与结构116、212“可操作地连接”，如果检测单位118的放置可检测结构116、212特性中的变化。
如在此所使用的，“液体交通”是指在两个或更多区室之间的功能性连接，可允许液体在区室间通过。例如，如果液体可从第一个区室通过到达第二个区室和/或第二个区室到达第一个区室，则第一个区室与第二个区室处于“液体交通”状态。
“核酸”214包括DNA，RNA，单链，双链或三链和其任何化学修饰形式。在本发明的某些实施方案中，可使用单链的核酸214。实际上可考虑核酸214的任何修饰形式。“核酸”214可以是几乎任何长度，从10，20，50，100，200，300，500，750，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，6000，7000，8000，9000，10,000，15,000，20,000，30,000，40,000，50,000，75,000，100,000，150,000，200,000，500,000，1,000,000，2,000,000，5,000,000或甚至更大长度的碱基，直至全长的染色体DNA分子。
说明性实施方案的详细描述 在此公开的方法和仪器100可用来迅速的、自动的对核酸214进行测序。相对于本领域中现有方法的优势包括可在单个测序轮次中读取长的核酸214的能力，更高的获取序列数据的速度，较低的测序成本和在每单位序列数据所需的操作时间内的更高效率。在本发明的一些实施方案中，对核酸214测序不需要荧光或放射性标记的能力也是有优势的。
下面详细的描述包含了许多特别的细节以便对公开的本发明的实施方案提供更为全面的理解。但对于本领域专业技术人员来说是很明显的，即不需要这些特别的细节本发明也可实施。在其他的情况下，在本领域中为人所熟知的装置、方法、步骤和个别部件在此不详细描述。
本发明的某些实施方案涉及核酸214测序的方法和仪器100。在本发明的一些实施方案中，要被测序的核酸214可与结构116，212附加在一起，如纳米级或微米级悬臂116，212。在本发明的多个实施方案中，被附加的核酸214可作为产生互补链220(complementarystrands)或复制副本核酸214的模板。在本发明的一些实施方案中，用来合成互补链220的核苷酸218可用较大的基团标记，可对每种类型的核苷酸218提供独特的质量标记。核酸214，220可在含有四种类型的标记核苷酸218的溶液中孵育。随着每个核苷酸218被加入至一个生长链220(growing strand 220)中，它就加入至与结构116，212附着的物体上。因为每个核苷酸218可通过其独特的质量来鉴定，因此有可能通过测量质量依赖的特性和/或在结构116，212表面应力上的变化，如它们的共振频率或偏移，以核苷酸的加入顺序来鉴定核苷酸218。在本发明的多个实施方案中，包括将相同核酸模板214的多个拷贝与每个结构116，212附着在一起，许多互补链220的合成可同时发生，在质量上和/或表面应力的变化上提供了显著性增加量，以便可在序列中添加每种核苷酸218的过程中可被检测到。
在本发明的可选择实施方案中，在一次当中，生长的互补核酸220仅可暴露给单一类型的核苷酸218。核苷酸218的掺入仅在核苷酸218与模板链214中的相应核苷酸218互补时可发生。因此，仅在存在正确的核苷酸218时，与结构116，212附着的核酸214，220的质量和/或结构的表面应力发生变化。相同类型的核苷酸218的连续添加可由相应质量和/或表面应力的较大幅度变化而指示。在这个实施方案中，不需要每种类型核苷酸218都有一个可识别的质量标记。
在图1中图解说明了与核酸214测序的实例仪器100有关的多个实施方案。图1中的仪器100包括数据处理和控制单元110，该单元可操作地与仪器100的其他部件连接，如试剂容器112，分析室114，210，检测单元118和出口128。图1中的试剂容器通过入口124与分析室114，210处于液体交通状态。分析室114，210包括附着模板核酸214的一个或多个结构116，212。微型流体控制(Microfluidic)装置可被引入以转运酶，标记的核苷酸218，和/或其他试剂至分析室114，210和从其中转运出来。
在序列中与模板核酸214互补的核酸链220可通过已知的技术被合成，例如使用已知的核酸聚合酶222。将标记的核苷酸218掺入进互补链220中可通过测量附着结构116，222的任何质量依赖特性和/或表面应力而检测。
可使用的结构116，212的非限制性实例包括悬臂(cantilever)，隔膜(diaphragm)，通过弹簧或其他弹性结构悬挂或支持的平台(platform)，或在本领域中已知的可测量质量依赖特性和/或表面应力的测量指标，如偏移和/或共振频率，的任何其他结构116，212。适当结构116，212的实例是如在图1中显示的悬臂116，212。已知的微制造技术可用来使用一种或多种这样的结构116，212来制造分析室114，210(如，B aller等人，2000，Ultramicroscopy.821-9；美国专利No.6,073,484)。制造纳米级的悬臂116，212阵列(nanoscalecantilever 116，212 arrays)的技术是已知的(例如，Bailer等人，2000；Lang等人，Appl.Phys.Lett.72383，1998；Lang等人，Analytica ChimicaActa 39359，1999；也可见http//monet.physik.unibas.ch/nose/inficon/；http//www.phantomsnet.com/phantom/net/phantomsconf/doc/Abadal.pdf；http//lmn.web.psi.ch/annrep/mntech3.pdf；www.nnf.cornell.edu/2001 cnfra/200138.pdf；http//www.princeton.edu/～cml/html/research/biosensor.html)。在本发明的可选择实施方案中，压电材料如石英晶体微量天平可用作结构116，212。(例如，Zhou等人，Biosensors & Bioelectronics 1685-95，2001；Yamaguchi等人，Anal.Chem.651925-1927；Bardea等人，Chem.Commun.7839-40，1998.) 一种或多种模板核酸214可与每个悬臂116，212附着。检测单元118可监测悬臂116，212的位置和/或共振频率。在本发明的一些实施方案中，检测单元118可以包括与光电检测器122可操作连接的光源120。可选择地是，一个压电传感器可操作地与探测器122连接或直接连接于数据处理和控制单元110。
在图1中的本发明实例方案显示了悬臂116，212偏移的光学检测。检测方法是以光学杠杆技术为基础，已知为原子力显微镜(AFM)。低功率激光束132可聚焦在悬臂116，212的游离端。反射的激光束132轰击方位敏感的光电探测器122(PSD)。当悬臂对被附着的核酸214，220的质量和/或悬臂116，212的表面应力变化反应发生弯曲时，反射的激光束132轰击PSD122的方位发生移动，产生偏移信号。质量和/或表面应力的变化和随后悬臂116，212的偏移度可从在PSD122上被反射的激光束132的位移来计算。
在本发明的多个实施方案中，标记核苷酸218的溶液被导入进分析室114，210中，每次导入一个标记的核苷酸218。例如，由标记鸟嘌呤(″G″)核苷酸218组成的溶液通过试剂容器112被导入进分析室114，210中。溶液与模板核酸214，引物224或互补核酸220和聚合酶222孵育适当的时间。如果模板核酸214序列中的下一个核苷酸218是胞嘧啶(″C″)，则标记的G将被掺入进生长的互补核酸220链并检测到结构中发生相应的变化。如果模板核酸214的下一个核苷酸218不是C，则检测不到变化。含有标记G核苷酸218的溶液从分析室114，220中去除，导入含有下一个标记核苷酸218的溶液(腺嘌呤-″A″，胸腺嘧啶-″T″或胞嘧啶-″C″。在所有四种标记核苷酸218溶液已经通过分析室114，220被循环后，重复该循环，继续直至核酸214被测序。模板核酸214的序列通过将已测量到的结构特性变化与不同核苷酸218与模板214接触的顺序关联而进行测定。当相同类型的多个核苷酸218被掺入进互补链220中，要注意结构116，212特性成比例的变化。例如，如果单个核苷酸218的掺入在结构116，212特性中产生了“X”的变化，则相同类型的两个或三个核苷酸可期望分别产生大约2X或3X的变化。
在本发明的可选择实施方案中，靶核酸214序列的一部分是已知的。例如，核酸214已经被部分测序，或未知核酸214序列已经被连接至载体，连接子(linker)或其他已知序列的DNA上。在这种情况下，不是从头至尾进行所有四种核苷酸218循环，而是针对在序列中的下一次添加的正确核苷酸218直至到达未知序列区时才被加入。部分已知序列的使用也可用来校准系统，并检查正确的功能。在某些实施方案中，例如当单核苷酸多态性(SNP)被分析时，除了单个位点以外整个核酸214序列是已知的，典型地含有两个核苷酸218中的一个。这些实施方案可通过分析室114，210对核苷酸218进行更为有效的循环。
图2A，图2B和图2C图解说明了实例分析室114，210的详细视图，包括悬臂116，212和与悬臂116，212附着的模板核酸214。图2B图解说明了于悬臂116，212附着的模板核酸214的放大视图。模板214与引物224寡核苷酸杂交，该核苷酸在序列中与模板分子214的3’末端是互补的。核算聚合酶222，如DNA聚合酶222，与引物224的3’末端附着，开始合成互补链220。序列中的每个核苷酸218通过聚合酶222被添加至引物224的3’末端或互补链220。互补链220的序列通过用模板链214进行标准沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对形成而测定，其中A仅与T(或在RNA模板214时，为尿嘧啶-″U″)结合，C仅与G结合。尽管在此所讨论的本发明实施方案考虑了从DNA模板链214中合成DNA的互补链220，但在本发明的可选择实施方案中考虑到RNA模板214可被用于合成互补链RNA或DNA链220，或DNA模板可被用于合成互补RNA链220。在RNA合成时，例如使用RNA聚合酶222，不需要使用引物224。
在掺入核苷酸218的过程中质量和/或表面应力的变化可使用光学检测法或压电装置通过悬臂116，212的偏移或共振频率转变来检测(见美国专利Nos.6,079,255和6,033,852)。图2C图解说明检测对核苷酸218掺入响应的悬臂116，212偏移(Δd)的实例方法。为了增加准确性和降低背景干扰，含有新掺入核苷酸218的悬臂212的位置可与一个或多个对照悬臂212进行比较，在对照中核苷酸218的掺入已经被阻断了，例如通过在引物224的3’末端使用双脱氧核苷酸。如在本领域中所已知的，双脱氧核苷酸的作用是阻断或终止核酸220的合成。
在本发明的多个可选择实施方案中，核苷酸218可独特地用较大的基团标记，如纳米颗粒和/或不同质量的纳米颗粒聚集物，它们可用来鉴定每种类型的核苷酸218。核苷酸218的溶液含有一种，两种，三种或四种不同类型的标记核苷酸218(A，G，C和T或U)。在本发明的某些可选择实施方案中，四种类型核苷酸218中仅有两种可用质量标记，例如A和C核苷酸218。在未标记嘧啶(C，T或U)和嘌呤(A，G)核苷酸218之间的质量差异应该可以通过质量和/或表面应变检测来检测到，标记和未标记的核苷酸218之间的差异也应该如此。
被掺入至互补核酸220链中的核苷酸218的同一性可通过质量和/或表面应力的显著变化和它们发生的顺序来测定。在本发明的某些实施方案中，每种核苷酸218用独特的较大基团来标记。掺入的标记核苷酸218的同一性可从结构116，212的质量和/或表面应力的显著变化来确定。在本发明的可选择实施方案中，每种核苷酸218可用相同或相似的较大基团来标记。通过鉴定添加标记核苷酸218以延伸互补核酸链220的序列，可以测定模板核酸链214的序列。
在本发明的某些实施方案中，要被加入的核苷酸218可以是DNA前体-脱氧腺苷酸5′三磷酸(dATP)218，脱氧胸苷5′三磷酸(dTTP)218，脱氧鸟苷5′三磷酸(dGTP)218和脱氧胞苷5′三磷酸(dCTP)218。在本发明的可选择实施方案中，核苷酸218可以是RNA前体，如腺苷5′三磷酸(ATP)218，胸苷5′三磷酸(TTP)218，鸟苷5′三磷酸(GTP)218和胞苷5′三磷酸(CTP)218。
可采用与单个核苷酸218溶液连续接触获得的代表性数据的图解在图3中提供。如图所示，对于每个循环，模板214，引物224或互补链220和聚合酶222将顺序地与四种核苷酸218类型(G，T，A和C)中的每一种接触。在循环1中，当加入T溶液时观察到质量和/或表面应力的变化，表明在模板214上有相应A的存在。在循环2中，当加入G溶液时，见到质量和/或表面应力有变化，表明在模板214中有C等等。模板214的线性序列可通过连续的循环添加和测量而鉴定。
可采用可选择方法获得的数据实例在图4中图解，该法中所有四种核苷酸218被区别标记，并加入至相同的溶液中。为了说明的目的，质量标记可任意选择，因此G具有单个质量单位，A具有2个质量单位，T具有三个质量单位和C具有4个质量单位。专业技术人员要意识到质量单位的准确值并不重要，只要它们可区分四种类型核苷酸218的每一种。如图4中所示，第一个被加入的核苷酸218具有3个质量单位，与T对应，第二个被加入的核苷酸218具有1个质量单位，对应于G，第三个被加入的核苷酸218具有4个质量单位，与C对应，等等。从5’至3’读取互补220链，序列显示为TGCAC。从3’至5’模板214链的对应序列为ACGTG。
在涉及与所有四种核苷酸218混合物接触的多个模板链214的本发明的实施方案中，聚合反应可被同步化，例如通过温度的可控变化，加入等体积的聚合酶222和/或引物224，迅速混合，或相似的已知技术使相同的核苷酸218被同时加入至每个互补链220中。对于较长的测序轮次，需要对聚合反应进行周期的再同步化。可选择的是，同步化的聚合作用可在互补核酸链220的3’末端使用一个或多个保护基团。仅在去除以前掺入的核苷酸218的保护基团之后掺入另外的核苷酸218。从核苷酸218添加和切除保护基团是为人熟知的，包括化学和/或光切割的基团，如美国专利6310,189所述。
在使用标记核苷酸218的本发明的实施方案中，逐级测定长的模板链214的序列，以避免或减少用于标记的较大基团的可能空间阻遏效应。空间阻遏作用潜在地干扰核酸聚合酶222的活性。在一个非限制性的实例中，为了测序模板DNA分子214，如上所述通过加入含有单个标记核苷酸218(A，G，T或C)的溶液可加入引物224和已测序的前10个碱基。在分析后，去掉标记的核苷酸218，例如使用核酸外切酶活性，和通过接触含有单个未标记核苷酸218溶液用未标记核苷酸取代。模板214中的下10个碱基通过接触含有单个标记核苷酸218的溶液而被测序，然后用未标记核苷酸218取代标记的核苷酸218。重复该过程直至整个模板214被测序。专业技术人员会意识到这种图解仅是代表性的，该法并不被限制于在一次中测序10个碱基。在聚合酶222活性产生实质上的干扰作用前，本领域专业技术人员很容易测定被掺入进互补链220中的连续标记核苷酸的数量。这个数字部分依赖于聚合酶222的类型和使用的标记类型。
在本发明的某些实施方案中，与悬臂116，212结合的模板核酸分子214的数量被限制。在本发明的另一个实施方案中，模板核酸214被附着于一个或多个悬臂116，212上，以特殊的图案结构和/或方向，以获得优化的信号。模板分子214的图案结构，例如可通过如下所述用多种已知的功能基团覆盖结构116，212而达到。
模板核酸214的分析可以以时间和成本有效方式提供关于生物试剂或疾病状态的信息。从分析核酸214获得的信息可用来确定有效的治疗，如疫苗的施用，抗体治疗，抗病毒给药或其他治疗。微电机械系统(MEMS) 微电机械系统(MEMS)是包括机械元件、传感器、传动器和电子设备的集成系统。所有的组件都通过已知的微制造技术在普通的芯片上制造，该芯片包括硅基或同等基片(例如，Voldman等人，Ann.Rev.Biomed.Eng.1401-425，1999)。MEMS的传感器组件可用来测量机械，温度，生物学，化学，光学和/或磁性现象。电子设备可处理从传感器和控制传动装置如泵、阀、加热器、冷却器、滤器、等获得的信息，因此可控制MEMS的功能。
MEMS的电子组件可采用集成电路工艺(IC)制造(例如，CMOS(互补型金属-氧化物-半导体)，双极，或BICMOS(双极与CMOS兼容)工艺)。它们可采用已知用于计算机芯片制造的光刻和蚀刻法来制造图案。微机械组件可采用相配合的“显微机械加工”工艺来制造，这种工艺可选择性的蚀刻掉硅晶片的部分或添加新的结构层形成机械和/或机电元件。在MEMS制造中的基本技术包括将薄膜材料镀在底物上，将图像掩模通过光刻印像或其他已知的平板印刷法用于薄膜顶部，并选择性的蚀刻薄膜。薄膜厚度的范围为几纳米至100微米。使用的淀积技术，包括化学方法如化学气相淀积(CVD)，电镀，外延和热氧化，以及物理方法象物理气相淀积(PVD)和浇铸。
并不限制制造方法，可使用本领域中已知的任何方法，如激光消融，喷射铸造，分子束外延，蘸水笔纳米平板印刷术，反应性离子束蚀刻，化学辅助的离子束蚀刻，微波辅助的等离子蚀刻，聚焦离子束铣削，电子束或聚焦离子束技术或压印蚀刻技术。制造纳米机电系统的方法可用在本发明的某些实施方案中。(见，例如，Craighead，Science 2901532-36，2000.)多种形式的微制造芯片可从商业渠道获得，例如从Caliper Technologies Inc.(Mountain View，C A)和ACLARABioSciences Inc.(Mountain View，CA)。
在本发明的多个实施方案中，考虑到在图1和图2中举例说明的核酸测序仪器100的一些或所有组件可被构造为集成MEMS装置的一部分。
悬臂 在本发明的某些实施方案中，核酸214，220要附着的结构116，212包括一个或多个悬臂116，212。悬臂116，212是很小，很细的弹性杠杆，可一端被附着，另一端游离。制造悬臂116，212阵列的方法是已知的(例如，Bailer等人，Ultramicroscopy 821-9，2000；美国专利No.6,079,255)。用作原子力显微镜的悬臂116，212典型地大约为100至200微米(μm)长和大约1μm粗。范围是15至400μm长，5至50μm宽和320纳米(nm)粗，能够检测单一大肠杆菌细胞的二氧化硅悬臂116，212已经由已知的方法制造(Ilic等人，Appl.Phys.Lett.77450，2000)。材料不限制，可使用任何其他的材料构造悬臂116，212，如硅或氮化硅。在本发明的其他实施方案中，可使用大约50μm长，10μm宽和100nm粗的悬臂116，212。在本发明的某些实施方案中，可使用更小的尺寸，纳米级的悬臂116，212，小至100nm长。在本发明的一些实施方案中，可使用大约10至500μm之间长，1至100μm之间宽和100nm至1μm之间粗的悬臂116，212。
当悬臂116，212被诱导共振时，可将聚焦在悬臂116，212游离端的激光束132偏移。通过用光束探测器122测量悬臂116，212偏移，可测量到悬臂116，212的共振振荡频率。可选择地，悬臂116，212的偏移可通过使用位置敏感的光电探测器122来测量被反射的光束132，因此可测定悬臂116，212的位置。这些方法是不受限制的，可在要求的主题内容之内使用可测量结构特性变化的任何方法，该结构受核苷酸218掺入的影响。例如，当悬臂116，212弯曲和电线长度(和宽度)发生变化，与该表面附着或被引入进悬臂116，212中的金属线预期将改变其电阻。将纳米电线附着或引入进悬臂116，212中的方法在本领域中是已知的，测量电阻的方法也是一样。
检测单位 检测单位118可用来检测悬臂的偏移和/或共振频率。例如，可采用光学和/或压阻探测器122(例如，美国专利No.6,079,255)和/或表面应力探测器122(例如，Fritz等人，Science 288 316-8，2000)来检测悬臂116，212的偏移。
在本发明的一个实例实施方案中，压阻电阻器可植入在悬臂116，212臂的固定末端。悬臂116，212游离末端的偏移可沿悬臂116，212产生应力。这种应力可与悬臂116，212的偏移程度成比例的改变电阻器116，212的电阻。电阻测量装置可与压阻电阻器连接在一起以测量其电阻，并产生对应于悬臂116，212偏移的信号。这种压阻探测器122可安装在悬臂116，212固定末端的缢痕中，这样当悬臂116，212被偏移时，探测器122可承受更大的应力(PCT专利申请WO97/09584)。
电阻的变化可使用本领域已知的方法来计算悬臂116，212偏移和/或共振频率的变化。制造小压阻悬臂116，212的方法也是已知的。在一个非限制性的实例中，压阻悬臂116，212的形成可通过将一个或多个悬臂116，212在硅绝缘体(SOI)晶片的顶层上成形。悬臂116，212可掺入硼或其他的掺杂剂产生一个p型的传导层。为形成电接点可将金属镀在掺杂层和通过去掉在其下面的大块硅而释放的悬臂116，212上。这种方法可使用如上所述的已知的平版印刷法和蚀刻技术。
在本发明的一些可选择实施方案中，在导入掺杂剂以减少压敏电阻器中所固有的干扰信号后可生成一个薄的氧化层。压敏电阻器悬臂116，212也可采用已知的技术通过汽相外延形成。在本发明的某些实施方案中，压力可用来驱动悬臂116，212的振动。通过使用基准电阻器将压敏电阻器掺入进惠斯顿(Wheatstone)电桥电路中，悬臂116，212的电阻系数可被监测。
在本发明的其他实施方案中，可采用光偏移传感器118来检测悬臂116，212偏移和/或共振频率。这种探测单位118包括光源120，如激光二极管，或垂直空腔表面发射激光器(VCSEL)的阵列，和位置敏感的光电探测器。前置放大器可用来将光电流转变为电压。光源120发射的光被引导至悬臂116，212的游离末端上，被反射至一个或多个光电二极管122上。在本发明的某些实施方案中，悬臂116，212的游离末端包被以高度反射性的表面，如银，可增加反射光束132的强度。悬臂116，212的偏移可引起反射光束132位置的变化。这种变化可被位置敏感的光电探测器122探测和分析以测量悬臂116，212位移的量。悬臂116，212的位移反过来可用来测量附着于悬臂116，212的核酸214，220的附加质量。专业技术人员将意识到在此所讨论的实例检测技术可用于其他类型的结构116，212，如隔膜或悬空操作台。
在本发明的其他实施方案中，结构116，212的偏移和/或共振频率可采用压电(PE)和/或压磁探测单位118来测量(例如，Ballato，″通过等效网络建模压电和压磁装置和结构，″IEEE Irons.Ultrason.Ferroelectr.Freq.Control 481189-240，2001)。压电探测单位118使用了传感元件的压电效应来产生电荷输出。PE探测单位118的操作不需要外来的电源。“弹性”传感元件可产生与外加应力量成比例的指定数量的电子。许多天然的和人造材料，如晶体，陶瓷和少量的聚合物显示这种特性。这些材料具有规则的晶体结构，当应变时净电荷发生变化。
压电材料在其不受力的状态下也具有偶极子。在这些材料中，通过应力变形产生电场，引起压电反应。电荷实际上没产生，相反被替代。当电场沿偶极子的方向产生时，产生流动电子从压电材料的一个末端通过信号探测器122移动至压电材料的另一端以闭合电路。移动电子的数量市压电材料中应变程度和系统电容的函数。
专业技术人员将意识到在此讨论的探测技术仅为实例，可使用任何已知的技术来测量偏移和/或共振频率中的变化，或结构116，212的任何其他质量和/或表面应力依赖特性。
核酸 被测序的核酸分子214可通过任何已知的技术来制备。在本发明的一个实施方案中，核酸214可以天然存在的DNA或RNA分子。实际上任何天然存在的核酸214可通过公开的方法来制备和测序，包括但不限于染色体、线粒体或叶绿体DNA，或信使、异源核、核糖体或转运RNA。制备和分离多种形式核酸214的方法是已知的(见，例如，分子克隆技术指南，主编，Berger and Kimmel，Academic Press，NewYork，NY，1987；分子克隆实验室手册，第二版，主编Sambrook，Fritsch和Maniatis，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。在引用的参考文献中公开的方法仅作为实例，可使用本领域中已知的任何变化。
在单链DNA(ssDNA)214被测序的情况下，可从双链DNA(dsDNA)通过任何已知的方法制备ssDNA214。这种方法涉及加热dsDNA，使双链分离，或可选择性的涉及通过已知的扩增或复制方法从dsDNA制备ssDNA214，如克隆进M13中。任何这种已知的方法可被用来制备ssDNA或ssRNA214。
尽管上面的讨论涉及天然存在的核酸214的制备，实际上能够附着于悬臂或相当结构116，212的任何类型核酸214可通过已公开的方法被测序。例如，通过多种扩增技术，如聚合酶链式反应(PCRTM)扩增制备的核酸214可被测序。(见美国专利Nos.4,683,195，4,683,202和4,800,159。)被测序的核酸214可选择性地被克隆进标准载体中，如质粒，粘粒，BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)。(见，例如，Berger和Kimmel，1987；Sambrook等人，1989。)核酸插入物214可从载体DNA中分离，例如，通过合适的限制性内切酶的切除，然后通过琼酯糖凝胶电泳。分离插入核酸214的方法是为人熟知的。
被测序的核酸214可从很宽范围种类的生物体中分离，包括但不限于，病毒，细菌，病原生物体，真核生物，植物，动物，哺乳动物，狗，猫，羊，牛，猪，山羊和人。也考虑应用的是核酸214或核酸214的扩增部分。
被用来测序的核酸214可通过任何已知的方法来扩增，如聚合酶链式反应(PCR)扩增，连接酶链式反应扩增，Qbeta复制酶扩增，链置换扩增，转录为基础的扩增和核酸序列为基础的扩增(NASBA)。
核酸合成 本发明的某些实施方案涉及互补DNA220的合成，例如使用DNA聚合酶222。这种聚合酶222可与引物分子224结合，并将标记核苷酸218添加至引物224的3’末端。潜在用途的聚合酶222的非限制性实例包括DNA聚合酶222，RNA聚合酶222，逆转录酶222，和RNA依赖的RNA聚合酶222。这些聚合酶222之间的差异，就其“校对”活性和需要或不需要引物224和启动子序列而言，在本领域中是已知的。当使用RNA聚合酶222时，被测序的模板分子214是双链DNA214。可使用的聚合酶222的非限制实例包括Thermatogamaritima DNA聚合酶222，AmplitaqFSTMDNA聚合酶222，TaquenaseTMDNA聚合酶222，ThermoSequenaseTM222，Taq DNA聚合酶222，QbetaTM复制酶222，T4 DNA聚合酶222，特莫氏属(thermusthermophilus)DNA聚合酶222，RNA-依赖RNA聚合酶222和SP6 RNA聚合酶222。
许多聚合酶222可从商业渠道购得，包括Pwo DNA聚合酶222(Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN)；Bst聚合酶222(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)；IsoThermTMDNA聚合酶222(Epicentre Technologies，Madison，WI)；莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶222，Pfu DNA聚合酶222，禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶222，Thermus flavus(Tfl) DNA聚合酶222和Thermococcus litoralis(Tli) DNA聚合酶222(Promega Corp.，Madison，WI)；RAV2逆转录酶222，HIV-1逆转录酶222，T7 RNA聚合酶222，T3 RNA聚合酶222，SP6 RNA聚合酶222，Thermus aquaticus DNA聚合酶222，T7 DNA聚合酶222+/-3′-＞5′核酸外切酶，DNA聚合酶I 222的Klenow片段，Thermus‘ubiquitous’DNA聚合酶222，和DNA聚合酶I 222(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。可使用在本领域已知能够进行标记核苷酸218的模板依赖性聚合作用的任何聚合酶222。(见，例如，Goodman和Tippin，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.l(2)101-9，2000；美国专利No.6,090,589)。使用聚合酶222从标记核苷酸218合成核酸220的方法是已知的(例如，美国专利No.4,962,037；5,405,747；6,136,543；6,210,896)。
引物 通常，引物224的长度在10至20个碱基之间，尽管可应用更长的引物224。再本发明的某些实施方案中，引物224可被设计为在序列中准确地与模板核酸214的已知部分互补。可使用已知的引物224序列，例如，其中选择鉴定已知常染色体序列附近的序列变异体的引物224，未知核酸214序列被插入进已知序列的载体中，或天然核酸214部分已经被测序。合成引物224的方法是已知的，自动寡核苷酸合成仪可从商业渠道购得(例如，Applied Biosystems，Foster City，CA；Millipore Corp.，Bedford，MA)。引物224也可从商业供应商处购得(例如，Midland Certified Reagents，Midland，TX)。
本发明的可选择实施方案涉及在缺少已知引物224结合位点的情况下对核酸214测序。再这种情况下，可能要使用随机引物224，如随机六聚物224或随机寡聚体224，长度为7，8，9，10，11，12，13，14，15个碱基或更长，以启动聚合作用。
核酸附着 在本发明的多个实施方案中，核酸分子214可通过非共价或共价结合附着于结构116，212。在一个非限制性实例中，附着的发生可通过用抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白包被结构116，212，然后生物素化核酸214和/或引物224结合。在不同的实施方案中，被附着的结构116，212的表面和/或核酸分子214可用多种已知的反应基团修饰以促进附着。
例如，表面可用醛基，羧基，氨基，环氧基，巯基，光敏或其他已知的基团来修饰。表面修饰可使用本领域中已知的任何方法，如用含有反应基团的硅烷包被。非限制性实例包括氨基硅烷，叠氮三甲硅烷，溴代三甲硅烷，碘代三甲硅烷，氯代二甲硅烷，双乙酸基二-t-丁氧硅烷，3-缩水甘油丙氧基三甲氧基硅烷(GOP)和氨丙基三甲硅烷(APTS)。可附着核酸的硅烷和其他表面涂料可从商业渠道购得(例如，United Chemical Technologies，Bristol PA)。
核酸214也可用多种反应基团来修饰以促进附着，尽管在下面所讨论的本发明的某些实施方案中，未修饰的核酸214也可被附着在表面上。再在特殊的实施方案中，核酸214可在其5’或3’末端和/或在内部残基上被修饰以包含一个表面反应基团，如巯基，氨基，醛，羧基或环氧基或光反应基团。在本发明的特殊实施方案中，核酸214用基团修饰以非共价的形式附着在表面上，如生物素，链霉抗生物素蛋白，抗生物素蛋白，毛地黄毒苷，荧光素或胆固醇。修饰的核酸，寡核苷酸和/或核苷酸可从商业渠道获得(见，例如http//www.operon.com/store/desref.php)或采用本领域中已知的任何方法来制备。
在本发明的特殊实施方案中，附着的发生可通过5’-磷酸化核酸214与化学修饰的结构116，212直接共价附着(Rasmussen等人，Anal Biochem.198138-142，1991)。在核酸214和结构116，212之间可形成共价键，例如，通过使用水溶性碳化二亚胺进行缩合作用。这种方法通过其5’-磷酸促进核酸214主要的5’-附着。在本发明的某些实施方案中，模板核酸214通过其3’末端被固定，使互补核酸220的聚合作用以5’至3’的方式进行。
附着的发生可通过用poly-L-Lys(赖氨酸)包被结构116，212，然后使用双能交联剂共价附着氨基或巯基修饰的核酸214。(Running等人，BioTechniques 8276-277，1990；Newton等人，NucleicAcids Res.211155-62，1993)。在本发明的可选择实施方案中，可使用光聚合物将核酸214附着于结构116，212上，该光聚合物含有光反应核素如氮宾，亚碳化物或羰游离基(见美国专利Nos.5,405,766和5,986,076)。附着的发生也可通过用金属如金，包被结构116，212，然后共价附着氨基或巯基修饰的核酸214。
双能交联剂可用来进行附着。实例的交联剂包括戊二醛(GAD)，双能环氧乙烷(OXR)，乙二醇二环氧甘油醚(EGDE)，和碳化二亚胺，如1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺(EDC)。在本发明的一些实施方案中，结构116，212共能基团可被共价地附着在交联化合物中以降低核酸分子214和聚合酶222之间的空间阻遏。典型地交联基团包括乙二醇寡聚体和二胺类。
在本发明的某些实施方案中，俘获寡核苷酸224可与结构116，212结合。俘获寡核苷酸224在模板核酸214上与互补序列杂交。一旦模板核酸214被结合，俘获寡核苷酸被用作引物224进行核酸聚合。
与每个结构116，212附着的核酸214的数量可根据结构116，212的敏感性和系统的噪声水平而变化。长度大约为500μm的大悬臂116，212上每个悬臂116，212附着的核酸214分子可达1010。但使用较小的悬臂116，212，附着的核酸214的数量大幅度减少。测定需要产生有效信号的附着核酸214的数量是为本领域中专业技术人员所熟知的。
附着在结构上的核酸的图案形成 在本发明的特殊实施方案中，以选择的优化信号幅度和减少背景噪声的特异图案，核酸214被附着在结构116，212表面上。以选择的图案将核酸214附着在表面上的方法是本领域中已知的，可使用任何这样的方法。
例如，硫醇衍生的核酸214可被附着在已经涂有薄层金的结构116，212上。硫醇基团与金表面反应形成共价键(Hansen等人，Anal.Chem.731567-71，2001)。核酸214通过可选择的方法以特殊的图案进行附着。在本发明的某些实施方案中，结构的整个表面可用金或可选择的反应基团来涂覆。经衍生的核酸214以选择的图案被置于表面上，例如通过蘸水笔纳米平板印刷术(dip-pen nanolithograpy)。可选择的金箔层可通过已知的方法被蚀刻进选择的图案中，如反应性离子束蚀刻，电子束或聚焦离子束技术。在与硫醇修饰的核酸214接触过程中，核酸214仅与有残余金箔层的结构116，212的表面结合。
也可采用光刻法来完成图案形成。将核酸214附着在表面上的光刻法是为人所熟知的(例如，美国专利No.6,379,895)。光掩模可用来保护或将结构116，212的选择区域暴露于光束。光束可活化特殊区域的化学性质，如光活化结合基团，使模板核酸214和活化区域附着，不与受保护的区域附着。光活化基团如叠氮基化合物是已知的，可从商业渠道购得。在本发明的某些实施方案中，纳米级的图案可采用已知的方法镀在结构的表面上，如蘸水笔平板印刷术，反应性离子束蚀刻，化学辅助离子束蚀刻，聚焦离子束铣削，低压电子束或聚焦离子束技术或压印技术。
已造型核酸214的喷镀可通过本领域已知的任何方法来完成。在本发明的某些实施方案中，核酸214的构型可使用自行组装的单层来进行喷镀，该单层已经使用已知的平板印刷技术，如低压电子束平板印刷术，被排列进构型中。例如，聚对二甲苯或相当的化合物层被喷镀在结构表面，并用发射法进行造型为核酸214的附着形成有图案的表面(例如，美国专利No.5,612,254；5,891,804；6,210,514)。
核苷酸标记 在本发明的某些实施方案中，一个或多个标记可被附着于一种或多种类型的核苷酸218上。标记可含有一个较大基团。可使用的标记的非限制性实例包括纳米微粒(例如，金纳米微粒)，聚合体，碳纳米管，球壳状碳分子，功能化的球壳状碳分子，量子圆点，树枝状物(dendrimers)，荧光，发光，磷光，电子致密或质谱标记。可使用任何类型的标记，如有机标记，无机标记和/或有机-无机杂交标记。标记可使用多种方法来探测，如结构116，212共振频率的变化，压电激发，结构116，212偏移，和其他测量质量和/或表面应力变化的手段。
标记的核苷酸218包括嘌呤或嘧啶碱基，可通过间隔区的臂连接至标记上。核酸218碱基，糖类和磷酸基团的修饰不需要顾及氢键的形成或核酸220的聚合。通过添加标记被修饰的嘌呤或嘧啶碱基的位置包括，例如鸟嘌呤的N2和N7位置，腺嘌呤的N6和N7位置，胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的C5位置，胞嘧啶的N4位置。
在本领域中已知的可使用的多种标记包括TRTT(四甲基若丹明异硫醇)，NBD(7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑)，德克萨斯红染料，酞酸，异酞酸，固定甲酚紫，甲酚蓝紫，亮甲酚蓝，对氨基苯甲酸，赤藓红，生物素，毛地黄毒苷，5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素，5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素，5-羧基荧光素，5-羧基若丹明，6-羧基若丹明，6-羧基四甲基氨基酞菁，甲亚胺，青色素，黄嘌呤，琥珀酰荧光素和氨基氮蒽。这些或其他标记可从商业渠道购得(例如，MolecularProbes，Eugene，OR)。多环芳族化合物或碳纳米管也可用作标记。
可与标记共价附着的核苷酸218可从熟悉的商业渠道购得(例如，Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN；Promega Corp.，Madison，WI；Ambion，Inc.，Austin，TX；Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。含有设计可与其他分子如核苷酸218共价反应的反应基团的多种标记可从商业渠道购得(例如，Molecular Probes，Eugene，OR)。制备标记核苷酸218的方法是已知的(例如，美国专利No.4,962,037；5,405,747；6,136,543；6,210,896)。
纳米微粒 在本发明的某些实施方案中，纳米微粒可用来标记核苷酸218。在本发明的一些实施方案中，纳米微粒为银或金纳米微粒。在本发明的多种实施方案中，可使用直径在1nm和100nm之间的纳米微粒，尽管可考虑不同尺寸规格和质量的纳米微粒。制备纳米微粒的方法是已知的(例如，美国专利No.6,054,495；6,127,120；6,149,868；Lee和Meisel，J.Phys.Chem.863391-3395，1982)。纳米微粒也可从商业渠道购得(例如，Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY；Polysciences，Inc.，Warrington，PA)。
在本发明的某些实施方案中，纳米微粒可以是单一的纳米微粒。可选择地，纳米微粒可以被交联产生纳米微粒的特殊聚合体，如二聚体，三聚体，四聚体或其他聚合体。在本发明的某些实施方案中，含有选择数量的纳米微粒(二聚体，三聚体等)的聚合体可通过已知的技术浓缩或纯化，如蔗糖溶液中的超速离心。
交联纳米微粒的方法是已知的(例如，Feldheim，″采用分子桥组装金属纳米微粒阵列″，The Electrochemical Society Interface，Fall，2001，22-25页)。金纳米微粒可以被交联，例如采用含有硫醇或巯基末端基团的双能连接化合物。在与金纳米微粒反应过程中，连接子形成了被连接子长度分隔的纳米微粒二聚体。在本发明的其他实施方案中，具有三个，四个或更多硫醇基团的连接子可用来同时与多个纳米微粒附着(Feldheim，2001)。使用对于连接化合物过量的纳米微粒可防止形成多种交联物和钠米微粒沉淀。
在本发明的可选择实施方案中，在与连接化合物附着之前纳米微粒可被修饰以含有多种反应基团。被修饰的纳米微粒可从商业渠道购得，如Nanogold那米微粒，来自Nanoprobes，Inc.(Yaphank，NY)。Nanogold纳米微粒可与每个纳米微粒附着的单个或多个马来酰亚胺，胺或其他基团一起获得。Nanogold纳米微粒也可以正电荷或负电荷的形式获得。这种修饰的纳米微粒可与多种已知的连接化合物附着以提供纳米微粒的二聚体，三聚体或其他聚集体。
在本发明的多种实施方案中，纳米微粒可与核苷酸218共价附着。在本发明的可选择实施方案中，核苷酸218可直接与纳米微粒附着或附着于连接化合物，该化合物可与纳米微粒共价或非共价键合。在本发明的这种实施方案中，不是一起交联两个或多个纳米微粒，连接化合物可用来将核苷酸218附着在纳米微粒或纳米微粒聚集体上。在本发明的特殊实施方案中，纳米微粒可用衍生的硅烷被包被。这种修饰的硅烷可采用已知的方法被共价附着在核苷酸218上。
在本发明的实例实施方案中，核苷酸218可分别用含有1个，两个，三个或四个相似大小纳米微粒的聚集体标记。可选择地是，用不同大小和质量的个别纳米微粒标记核苷酸8。使用的金纳米微粒实例可从Polysciences，Inc.购得，大小为5，10，15，20，40和60nm。在某些实施方案中，每个不同类型的核苷酸218(A，G，C和T或U)可用纳米微粒或不同质量的纳米微粒聚集体标记。
信息处理和控制系统和数据分析 在本发明的某些实施方案中，测序仪器100可与数据处理和控制系统110进行界面连接。在本发明的一个实例实施方案中，系统110合并了计算机110，该计算机由总线或其他交换信息的交换方式，处理器或与总线结合在一起处理信息的其他处理方式组成。在本发明的一个实施方案中，处理器选自Pentium处理器家族，包括PentiumII家族，PentiumIII家族和Pentium4处理器家族，可从Intel Corp.(Santa Clara，CA)购得。在本发明的可选择实施方案中，处理器可以是Celeron，Itanium，Pentium Xeon处理器或处理器X-级家族成员(Intel Corp.，Santa Clara，CA)。在本发明的多种其他实施方案中，处理器可基于Intel体系结构，如Intel IA-32或Intel LA-64体系结构。可选择使用其他处理器。
计算机110可进一步由随机存取存储器(RAM)或其他动态储存装置(主存储器)组成，为储存要被处理器执行的信息和指令与总线连接。主存储器也可用来储存临时变量或在处理器执行指令的过程中的其他中间信息。计算机110也包括只读存储器(ROM)和/或其他与总线连接以存储处理器的静态信息和指令的静态存储器。其他标准的计算机110组件，如显示器，键盘，鼠标，网卡，或其他本领域已知的组件可被合并进信息处理和控制系统中。专业技术人员将理解与在此所述实例装备不同的信息处理和控制系统110可用于某些执行过程。因此系统110的配置可发生变化。
在本发明的特殊实施方案中，探测单位118可与总线连接。处理器可从探测单位118处理数据。处理和/或原始数据被储存在主存储器中。导入进分析室114，210中的标记核苷酸218的质量和/或核苷酸218溶液的序列数据也储存在主存储器或ROM中。处理器将检测到的质量和/或表面应力的变化与标记核苷酸218质量进行比较以鉴定出合并入互补核酸链220中的核苷酸218的序列。处理器可从探测单位118中分析数据以测定模板核酸214的序列。
信息处理和控制系统110可进一步提供测序仪器100的自动化控制。来自处理器的指令可通过总线传递至多个输出装置上，例如控制泵，电泳或电渗引线和仪器100的其他组件。
应该注意的是当在此所述的过程在程序处理器的控制下进行时，在本发明的可选择实施方案中，该过程可完全或部分通过任何可编程或硬编码逻辑来实现，例如现场可编程门阵列(FPGAs)，TTL逻辑，或专用集成电路(ASICs)。另外，所述的方法可通过程序通用计算机110组件和/或定制硬件组件的任何组合来实施。
在本发明的某些实施方案中，可使用定制设计的软件包来分析从探测单位118中获得的数据。在本发明的可选择实施方案中，数据分析可采用数据处理和控制系统110和公共软件包来进行。可获得的DNA序列分析软件的非限制性实例包括PRISM(tm)DNA测序分析软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)。Sequencher(tm)package(Gene Codes，Ann Arbor，MI)，和通过National Biotechnology InformationFacility在网址www.nbif.org/links/l.4.l.php上获得的多种软件包。
* * * 按照本公开书，在此公开的所有方法和仪器100不需过多的实验就可制成和实施。对于本领域专业技术人员很明显地是多种变化可应用于在此所述的方法和仪器100，不背离在此所要求的主题内容的概念，精神和范围。更特殊地是，很明显地是某些化学和生理学相关的试剂可替代在此所述的试剂，只要可达到相同或相似的结果。对于本领域专业技术人员很明显的所有这些相似的替代和修饰被认为在所要求的主题内容的精神，范围和概念内。
权利要求
1.一个方法，包括a)将一种或多种模板核酸分子附着于一种或多种结构；b)从标记的核苷酸合成一种或多种互补核酸；c)检测结构特性中的变化；d)从结构特性的变化中鉴定被掺入的核苷酸；和e)测定模板核酸的序列。
2.权利要求1的方法，其中所述的结构特性的变化是所述附着核酸的质量的函数。
3.权利要求1的方法，其中所述的结构特性的变化是所述结构的表面应力的函数。
4.权利要求1的方法，其中所述的结构是悬臂。
5.权利要求1的方法，其中所述的结构特性的变化是通过光束探测，压电探测，压电电阻探测或电阻探测进行检测的。
6.权利要求1的方法，其中所述的结构特性的变化是通过结构共振频率或与结构有关的电路电阻的变化来检测的。
7.权利要求1的方法，其中所述的标记核苷酸包括至少一种质量标记基团。
8.权利要求7的方法，其中所述的每种不同类型的核苷酸包括可区别的质量标记基团。
9.权利要求7的方法，其中所述的质量标记基团选自纳米微粒，纳米微粒聚集体，碳纳米管，球壳状碳分子，功能化的球壳状碳分子，量子圆点，树枝状物，有机分子，聚合物，重原子，荧光标记，发光标记，和质谱标记基团。
10.权利要求1的方法，进一步包括将引物与模板核酸杂交。
11.权利要求10的方法，其中所述的标记核苷酸与引物的3’末端通过聚合酶共价连接。
12.权利要求1的方法，其中所述的模板核酸分子以选择的图案被置于结构一部分表面上。
13.权利要求1的方法，其中在一个时间仅有单一类型的核苷酸与模板和互补核酸接触。
14.权利要求8的方法，其中所述的四种类型核苷酸在相同的时间内可与模板和互补核酸接触。
15.一个用于核酸分析的方法，包括a)将至少一种模板核酸与一种或多种结构附着；b)合成至少一种互补核酸片段，其中包括已选择数量的标记核苷酸；c)在掺入标记核苷酸过程中，检测结构特性中的变化；和d)从结构特性的变化中测定核酸片段的序列。
16.权利要求15的方法，进一步包括e)用未标记的核苷酸来替代互补核酸片段中的标记核苷酸；f)合成邻近互补核酸片段，其中包括已选择数量的标记核苷酸；g)在掺入标记核苷酸的过程中，检测结构特性中的变化；和h)测定邻近互补核酸片段的序列。
17.权利要求16的方法，进一步包括重复(e)至(h)的步骤直至获得核酸序列。
18.权利要求16的方法，其中通过从标记核苷酸中去掉标记，所述的标记核苷酸用未标记的核苷酸替代。
19.权利要求15的方法，其中所述的结构是悬臂。
20.权利要求19的方法，其中所述的结构特性是悬臂的偏移，悬臂的共振频率或与悬臂有关的电路的电阻。
21.权利要求20的方法，其中所述的悬臂的偏移，悬臂共振频率的转变或与悬臂有关的电路电阻的变化是标记核苷酸质量的函数。
22.权利要求20的方法，其中所述的悬臂的偏移，悬臂共振频率的转变或与悬臂有关的电路电阻的变化是悬臂表面应力的函数。
23.权利要求15的方法，其中所述的模板核酸以选择的图案被置于结构的一部分表面上。
24.一个仪器，包括a)一个分析室，含有一个或多个结构；b)与所述分析室处于液体交通的一个或多个试剂容器；c)一个探测单位，与所述结构可操作地连接；和d)一个数据处理和控制单元。
25.权利要求24的仪器，进一步包括一种或多种附着到所述结构上的核酸。
26.权利要求25的仪器，进一步包括在分析室中的一种或多种聚合酶。
27.权利要求24的仪器，其中所述的结构是悬臂。
28.权利要求24的仪器，其中所述的探测单位包括位置敏感的光探测器，压电探测器或压电电阻器。
29.权利要求24的仪器，其中所述的探测单位包括激光。
30.权利要求25的仪器，所述的探测单位可检测附着于所述结构上的核酸质量变化和/或所述结构的表面应力变化。
全文摘要
本方法和仪器100涉及核酸214测序，是通过将核苷酸218掺入进核酸链220中进行的。核苷酸218的掺入可通过结构116，212的质量和/或表面应力的变化而检测到。在本发明的一些实施方案中，结构116，212由一个或多个纳米级或微米级悬臂组成。在本发明的某些实施方案中，每种不同类型的核苷酸218可用较大的基团进行可辨别的标记，每个掺入的核苷酸218可在核苷酸218的掺入过程中通过结构116，212的质量和/或表面应力的变化来鉴定。在本发明的可选择实施方案中，在一个时间，仅有一种类型的核苷酸218可暴露给核酸214，220。结构116，212特性的变化可被多种方法检测到，如压电探测，结构116，212共振频率的转变和/或位置敏感的光电探测。
文档编号C12M1/34GK1653194SQ03811307
公开日2005年8月10日 申请日期2003年4月18日 优先权日2002年5月20日
发明者N·桑达阿拉金, A·柏林, M·山川, X·苏, S·占, T－W·古 申请人:英特尔公司