单层云母片及其纳米孔电子器件的制备方法和应用

单层云母片及其纳米孔电子器件的制备方法和应用
【专利摘要】本发明公布了一种单层云母片及其纳米孔电子器件的制备方法和应用。首先制备超薄的云母单层，将其涂布在合适的支撑基底上，利用高能聚焦电子束或离子束在单层云母片上制备1～5nm纳米孔，得到基于单层云母片的固态纳米孔电子器件。使单链核酸或蛋白质分子在电场驱动下穿过该电子器件的纳米孔，通过实时检测过孔电流的变化，识别过孔单链核酸上的碱基或单链蛋白质上的氨基酸。本发明的电子器件可制备成高通量平行的分子器件，实现快速且超低成本的核酸/蛋白质测序。
【专利说明】
单层云母片及其纳米孔电子器件的制备方法和应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种单层纳米云母片和云母片纳米孔的制备方法，并制备生物传感器，可用于单分子核酸/蛋白质等生物大分子的测序、蛋白结构域、蛋白修饰和蛋白互作等领域。该发明属于第三代测序器件。
【背景技术】
[0002]核酸测序技术是近代生命科学发展的重要里程碑之一。随着低成本、高通量核酸测序技术的出现，生命遗传密码的彻底破译将成为可能，遗传信息大数据的普及将惠及到人类社会每一个普通成员的生存和健康。
[0003]目前大量使用的第二代高通量测序技术，通过对被测核酸进行平行扩增，构建测序文库，克隆出上百万固相化单链核酸模板片段，进行高通量并行序列测定，但存在一些问题:制备测序文库需要大量的分子生物学操作，制备时间长，成本高;通过核酸生物合成反应在核酸测序模板上进行逐个碱基阅读，一次生化反应仅能阅读一个碱基且读长较短。这也是测序速度和通量难以提升的瓶颈。
[0004]因此第三代测序技术是目前国际学术界和产业界追捧的对象。第三代测序技术有如下三个特点:(I)实现单分子测序，无需对测序对象进行扩增，能够克服由基因扩增引起的测序偏向性；(2)实现连续测序，也就是核酸链上碱基的阅读是不间断的，这一特性不仅能够大幅度提高测序速度，也会使核酸的读长大幅度增加；(3)更低的测序成本，在生化反应中无需不断加入生化试剂，测序没有试剂成本。由此看出，第三代测序技术的实现将会是生命科学和医学发展史上的又一里程碑，帮助人们随时随地、实时、低成本地获取人体、环境各种各样的核酸信息，随时掌控生命体中遗传与变异、表达与调控、感染和防卫等事件，真正促进4P和精准医疗的实现。
[0005]第三代测序中纳米孔测序法是目前研究最多的。纳米孔测序方法是单链核酸分子在电场驱动下穿过纳米尺度的微孔，通过实时检测过孔电流的变化，识别过孔单链核酸上的碱基。制备纳米孔的材料可以采用天然的或经改造的蛋白质分子，如α溶血素、Msp蛋白，也可以使用微纳加工制备的固态纳米孔，如氮化硅、石墨烯等。生物纳米孔在单链核酸分子碱基的准确识别方面还存在技术瓶颈。固态纳米孔由于孔径的可控性和稳定性、纳米孔长度、单链过孔速度等因素，尚未实现核酸链单个碱基的识别。
[0006]在纳米孔核酸测序技术的基础上，人们开发了能够精确鉴定氨基酸的蛋白单分子测序技术。研究人员将一对金属电极分隔在约两纳米的孔洞旁边，当线性多肽穿过这种纳米孔的时候，每一个氨基酸都会完成一个电回路，并发出相应的电信号。而这样的电信号可以帮助人们判断，通过纳米孔的是哪一个氨基酸。另外，基于纳米孔的蛋白质检测技术将会广泛用于研究蛋白结构域、蛋白修饰和蛋白互作等领域。
[0007]絹云母是一种天然细粒白云母，属白云母的亚种，是层状结构的硅酸盐，结构由两层硅氧四面体夹着一层铝氧八面体构成的复式硅氧层。解理完全，可劈成极薄片状，片厚可达IMi以下(理论上可解理成0.Snm单层)，径厚比大；与白云母相比，絹云母具有天然粒径小，易加工超细的特点。因此利用超薄的云母单层，控制纳米孔长度在0.8nm左右，而已知双螺旋碱基之间螺距为0.34nm，即云母单层允许2个碱基同时通过，通过比较不同双碱基通过的电化学信号，即可实现核酸单个碱基的识别。但到目前为止，还没有云母片应用于纳米孔测序的报道。
[0008]云母层带有负电，层间吸附大量钾离子，层间钾离子被云母层牢牢吸引，难以交换，因此云母具有很低的离子交换能，同时这些钾离子强烈地吸引着云母层，使其难以剥离。最早剥离云母的方法是尖锐工具切割法、胶带粘撕法，这些方法只能剥离大颗粒的云母，且效率非常低、云母片较厚。介质研磨法也是剥离云母的方法之一，但这方法不能完全破坏云母层间较强的作用力，因此制得的云母片厚度往往大于I微米，不属于纳米材料的范畴。中国专利申请公开说明书CN104445235A(【公开日】2015.03.25)公开了一种二维纳米白云母的制备方法，中国专利申请公开说明书0附04743562六(【公开日】2015.07.01)公开了一种絹云母纳米微片的制备方法，都是利用钠、锂等活泼性更高的离子替代云母层间的钾离子，云母微片厚度可达到1nm左右，但均无法实现单层云母的制备。

【发明内容】

[0009]本发明的目的提供一种单层云母的制备方法，并将单层云母涂布在合适的基底上，利用高能聚焦电子束(TEM)或离子束，制备孔径在I?5nm的纳米孔，当单链核酸或蛋白质分子等在电场驱动下穿过纳米孔，通过实时检测过孔电流的变化，即可识别过孔单链核酸上的碱基或者蛋白质链上的氨基酸，发展一种低成本、快速核酸/蛋白测序器件，可广泛应用于蛋白结构域、蛋白修饰和蛋白互作等领域。
[0010]为了能够对长片段单链核酸或蛋白质模板进行快速、低成本测序的方法，首先需要制备超薄的云母单层，控制云母厚度在0.8nm左右。
[0011]本发明提供的絹云母单层的制备方法包括以下步骤:
[0012]I)将絹云母粉加入含有碱金属氢氧化物的有机溶剂中，在200?300°C搅拌72?96h；
[0013]2)利用50?10Hz，1000?2000W的微波辐射处理步骤I)的溶液5?8min，8000?12000rpm离心3?1min沉淀云母片；
[0014]3)将云母片重悬于I?5%盐酸溶液中，超声处理7?10h，然后用蒸馏水反复冲洗，直到pH值6.5?7.5;
[0015]4)进行密度梯度离心，首先1000?2000rpm离心3?1min，弃沉淀;接下来5000?8000rpm离心3?lOmin，弃上清，沉淀重悬于去离子水中，得到单层云母悬液。
[0016]上述步骤I)中，絹云母粉的加入量优选为每mL溶液中加入0.1g;所述碱金属的氢氧化物例如氢氧化钾、氢氧化钠和氢氧化锂等，其浓度优选在0.05?lg/mL;所述有机溶剂优先选自下列溶剂中的一种或多种:四氢呋喃(THF)、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、苯类溶剂(例如苯、甲苯、二甲苯)等。
[0017]上述步骤2)中的离心速度优选为I OOOOrpm，离心时间5min。
[0018]上述步骤4)中，梯度离心的第一次离心去掉未完全解离的云母颗粒，第二次离心去掉云母碎片，重悬于去离子水中的即为单层云母片。
[0019]利用本发明制备的单层云母片可制备一种基于单层云母片的固态纳米孔电子器件，该电子器件包括支撑基底和单层云母片，其中:所述支撑基底带有孔洞，所述单层云母片位于孔洞之上，由支撑基底支撑;在该孔洞上的单层云母片部位具有一孔径在I?5nm的纳米孔。
[0020]在上述基于单层云母片的固态纳米孔电子器件的两边注入缓冲液，两边的缓冲液仅通过单层云母片上的纳米孔连通，当单链核酸或蛋白质分子在电场驱动下穿过单层云母片上的纳米孔时，通过实时检测过孔电流的变化，识别过孔核酸单链上的碱基或蛋白质单链上的氨基酸，实现核酸或蛋白质测序。
[0021]上述支撑基底可以是Si/Si02基片或石墨烯等薄膜材料，通过微纳加工手段在其上形成孔径在10?50nm的孔洞。所述单层云母片优选本发明方法制备的絹云母单层。
[0022]本发明基于单层云母片的固态纳米孔电子器件可通过下述方法制备:
[0023]I)在支撑基底上制备孔径在10?50nm的孔洞；
[0024]2)制备单层云母片悬液，将其滴在带孔洞的支撑基底上，然后在支撑基底下抽真空，自然风干，使单层云母片吸附在支撑基底上；
[0025]3)在单层云母片上位于所述孔洞的部位，利用高能聚焦电子束或离子束制备出直径I?5nm的纳米孔。
[0026]本发明利用云母单层只有0.Snm厚度的特点，将单层云母通过物理吸附的方式固定在基底上，利用高能聚焦电子束(TEM)或离子束，制备l-5nm纳米孔，单链核酸或蛋白质分子在电场驱动下穿过纳米孔，通过实时检测过孔电流的变化，识别过孔单链核酸上的碱基或单链蛋白质上的氨基酸，实现核酸单链上碱基序列或蛋白质单链上氨基酸序列的检测。
[0027]具体的，本发明还提供了一种核酸或蛋白质测序装置，包括上述基于单层云母片的固态纳米孔电子器件，以及微型溶液槽、驱动电极和过孔电流监测系统，其中:所述固态纳米孔电子器件封装在微型溶液槽中，并将微型溶液槽分隔成仅通过纳米孔连通的两部分，这两部分装有缓冲液，并分别放置一个驱动电极，通过驱动电极施加电场可驱动纳米孔一侧的单链核酸或蛋白质分子穿过纳米孔到另一侧，而过孔电流监测系统实时检测过孔电流的变化。
[0028]所述驱动电极通常是银/氯化银电极;所述过孔电流监测系统优选膜片钳测试系统，也可以使用电化学工作站。
[0029]有益效果:
[0030]本发明作为一种极具发展潜力的第三代测序方法，采用单层云母纳米孔结构的电子器件具备如下优点:无需制备特殊的测序文库，无需对核酸/蛋白质进行标记，可进行超长、连续、快速、精准的碱基阅读，可制备成高通量平行的分子器件，可实现超低成本的核酸/蛋白质测序等，具体描述如下:
[0031](I)本发明提出的单层云母制备方法，通过改进的解理方法，可实现真正意义上单层解理效果；
[0032](2)本发明提出的单层云母，相较于其它报道的固态纳米孔材料，如氮化硅等，厚度更薄，纳米孔长度在0.Snm左右，只允许2个碱基同时通过，通过比较不同双碱基通过的电化学信号，即可实现核酸单个碱基的识别；
[0033](3)本发明提出的单层云母固态纳米孔，相较于其它报道的固态纳米孔，如氮化硅等，孔的稳定性更强，有效避免了缩孔效应；
[0034](4)本发明提出的单层云母固态纳米孔器件，通过捕捉过孔电流的变化，实现核苷、氨基酸等底物生化反应过程的监测，无需对测序对象进行扩增和放大，即可直接完成分子测序，能够克服由基因扩增引起的测序偏向性；
[0035](5)本发明提出的单层云母固态纳米孔器件，可以实现连续、不间断的测序，这一特性不仅能够大幅度提高测序速度，也会使读长大幅度增加；
[0036](6)本发明提出的单层云母固态纳米孔器件，在测序过程中除了核酸/蛋白质溶液夕卜，无需加入其他生化试剂，在测序过程中无试剂成本。
【附图说明】
[0037]图1是实施例中制备的单层云母片的透射电子显微镜(TEM)照片。
[0038]图2是实施例中单层云母片上纳米孔透射电子显微镜(TEM)照片。
[0039]图3是本发明一种基于单层云母片的固态纳米孔电子器件的结构及检测电路示意图。
[0040]图中:1-硅基底，2-二氧化硅悬空膜，3-缓冲液，4-单层云母，5-银/氯化银电极，6_预检测的核酸/蛋白质分子。
【具体实施方式】
[0041]下面结合附图，通过实施例进一步对本发明进行说明，但不以任何方式限制本发明的范围。
[0042]实施例:
[0043](I)单层云母的制备:配制5g氢氧化钾(KOH)溶于50mL有机溶剂四氢呋喃(THF)中，室温搅拌24h;将Ig絹云母粉加入到上述溶液中，置于不锈钢锅中，250°C处理72h，其间用磁力搅拌子搅拌;利用微波福射处理溶液(60Hz，1000W)5-8min，1000rpm离心5min沉淀云母片；云母片重悬于1%盐酸(HCl)溶液中，超声处理7-10h，用蒸馏水反复冲洗，直到pH值7.0;进行密度梯度离心，首先2000rpm离心5min，弃沉淀，去掉未完全解离的云母颗粒，接下来6000rpm离心5min，弃上清，去掉云母碎片，沉淀重悬于去离子水中，得到单层云母悬液。
[0044](2)支撑基底的制备:利用光刻、干法刻蚀、湿法刻蚀、反应离子束刻蚀等一系列微纳加工手段制备Si/Si02悬空膜结构的支撑基底，如图3中所示。其中，厚度为30纳米的S12悬空膜2作为绝缘缓冲层，起到支撑云母单层、减少电学测量中电容效应的作用，S12悬空膜2上制备出孔径为10?50nm的孔洞;Si基底I主要起支撑S12的作用。
[0045](3)单层云母在支撑基底上的吸附结合:吸取步骤(I)制得的单层云母悬液10微升至步骤(2)制得的支撑基底上，支撑基底下方用空气栗抽真空，等待自然风干，使单层云母4吸附在支撑基底上，参见图3。
[0046](4)基底上单层云母的表征和打孔:利用透射电子显微镜(TEM)观察支撑基底表面，确认是否有单层云母片存在，如图1所示。然后通过300kV透射电子显微镜(TEM)的电子束，在孔洞处的单层云母片上加工出直径小于5nm的纳米孔，如图2所示，得到单层云母纳米孔芯片。
[0047](5)将单层云母纳米孔芯片，如图3所示，封装于一个微型溶液槽中，溶液槽被芯片分隔成两部分，向这两部分分别顺序注入3mL无水乙醇、3mL超纯水进行清洗，然后注入3mL氯化钾缓冲液(IM)，通过芯片中间的纳米孔将分隔的溶液槽两部分连通，在芯片两边的缓冲液3中分别放置一个银/氯化银电极5，构建纳米孔通道的纵向电学回路。
[0048](6)利用膜片钳测试系统(Axon 700B)通过银/氯化银电极5施加电压，监测过孔电流。过孔电流大小在纳安量级，电流的波动值在0.1纳安级。
[0049](7)从施加负电压的一端溶液加入适量的单链核酸/蛋白质，监测整套装置两端电流信号变化。电流的波动值与持续时间表示通过纳米孔的碱基/氨基酸种类，用于鉴别对应合成的碱基/氨基酸。
[0050](8)记录通过单层云母片的固态纳米孔器件电流波动谱，分析核酸/蛋白质模板序列。
【主权项】
1.一种絹云母单层的制备方法，包括以下步骤: 1)将絹云母粉加入含有碱金属氢氧化物的有机溶剂中，在200?300°C搅拌72?96h; 2)利用50?10Hz，1000?2000W的微波辐射处理步骤I)的溶液5?8min，8000?12000rpm离心3?1min沉淀云母片； 3)将云母片重悬于I?5%盐酸溶液中，超声处理7?1h，然后用蒸馏水反复冲洗，直到pH值6.5?7.5; 4)进行密度梯度离心，首先1000?2000印111离心3?10111；[11，弃沉淀；接下来5000?8000rpm离心3?lOmin，弃上清，沉淀重悬于去离子水中，得到单层云母悬液。2.如权利要求1所述的絹云母单层的制备方法，其特征在于，步骤I)中所述碱金属的氢氧化物是氢氧化钾、氢氧化钠和/或氢氧化锂，其在所述有机溶剂中的浓度为0.05?lg/mL。3.如权利要求1所述的絹云母单层的制备方法，其特征在于，步骤I)中所述有机溶剂选自下列溶剂中的一种或多种:四氢呋喃、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺和苯类溶剂。4.一种基于单层云母片的固态纳米孔电子器件，包括支撑基底和单层云母片，其中:所述支撑基底带有孔洞，所述单层云母片位于孔洞之上，由支撑基底支撑;在该孔洞上的单层云母片部位具有一孔径在I?5nm的纳米孔。5.如权利要求4所述的固态纳米孔电子器件，其特征在于，所述支撑基底是Si/Si02基片或石墨稀薄膜，所述孔洞直径为10?50nm;所述单层云母片的厚度为0.8nm。6.—种基于单层云母片的固态纳米孔电子器件的制备方法，包括以下步骤: 1)在支撑基底上制备孔径在10?50nm的孔洞； 2)制备单层云母片悬液，将其滴在带孔洞的支撑基底上，然后在支撑基底下抽真空，自然风干，使单层云母片吸附在支撑基底上； 3)在单层云母片上位于所述孔洞的部位，利用高能聚焦电子束或离子束制备出直径I?5nm的纳米孔。7.如权利要求6所述的固态纳米孔电子器件的制备方法，其特征在于，步骤I)中所述支撑基底是SVS12基片或石墨烯薄膜，通过微纳加工手段在其上形成孔径在10?50nm的孔洞。8.如权利要求6所述的固态纳米孔电子器件的制备方法，其特征在于，通过权利要求1?3任一所述的絹云母单层的制备方法制备步骤2)中所述的单层云母片悬液。9.权利要求4或5所述的基于单层云母片的固态纳米孔电子器件在核酸或蛋白质测序中的应用，在所述固态纳米孔电子器件的两边注入缓冲液，两边的缓冲液仅通过单层云母片上的纳米孔连通，使单链核酸或蛋白质分子在电场驱动下穿过纳米孔，通过实时检测过孔电流的变化，识别过孔单链核酸上的碱基或单链蛋白质上的氨基酸。10.—种核酸或蛋白质测序装置，包括权利要求4或5所述的基于单层云母片的固态纳米孔电子器件，以及微型溶液槽、驱动电极和过孔电流监测系统，其中:所述固态纳米孔电子器件封装在微型溶液槽中，并将微型溶液槽分隔成仅通过纳米孔连通的两部分，这两部分装有缓冲液，并分别放置一个驱动电极，施加电场驱动单链核酸或蛋白质分子穿过纳米孔，而过孔电流监测系统用于实时检测过孔电流的变化。
【文档编号】G01N27/00GK105883838SQ201610195641
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年3月31日
【发明人】陆祖宏, 李清宁, 魏颖颖, 丁韬力, 严勇, 万成, 孙利, 李成强, 孙杰, 王磊
【申请人】北京大学, 北京普若博升生物科技有限公司