用于保持核酸的载体的制作方法

专利名称：用于保持核酸的载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于固定化DNA等核酸的固体支撑体及其制造方法。
背景技术：
用于有效地分析丰富多彩的生物的全基因功能的技术开发一直在进行，作为这类分析方法，可以利用微阵列。微阵列通常为在载玻片等固体支撑体上使许多核酸片段整列固定化的方式，可利用将与在微阵列上被固定化的核酸片段具有互补性的核酸片段试样通过杂交在微阵列上固定化并进行检测的方法。作为所形成的杂合体的检测方法，已知有利用与核酸片段试样预先结合的荧光标记或放射性标记的方法、以及利用具有被进入杂合体的荧光发生基团或导电性基团的嵌入剂的方法等。对于制作微阵列，有在固体支撑体表面直接合成核酸的方法(称为芯片法(才 > · W ))和将预先制备成的核酸片段固定在固体支撑体表面的方法等。前者的芯片法是通过使用光照射选择性地除去保护基、利用用于半导体制造的光刻技术和固相合成技术、并通过用固体支撑体上的许多微小的矩阵进行组合反应(组合·合成)来同时合成多种核酸的方法。另一方面，后者的方法是通过在固体支撑体表面上将预先制备成的核酸片段试样等进行点样、并利用共价键或离子键进行键合固定的方法。作为这样的方法，可列举使用在微阵列制作装置中备有核酸片段试样的点样装置，在用聚阳离子(聚赖氨酸、聚乙烯亚胺等)进行了表面处理的固体支撑体表面上点样，利用核酸试样的电荷静电结合于固体支撑体而进行固定化的方法；预先合成导入有反应活性基团的核酸，并将它们在进行了表面处理的固体支撑体表面上使用点样装置进行点样，经由共价键而固定化的方法；以及在固体支撑体表面导入与核酸形成共价键的活性酯基等反应活性基团，使核酸经由共价键而固定化的方法等。另外，也已知有在具有基板、形成于基板上的静电吸引核酸的静电层和形成于静电层上的能够与核酸共价键合的官能团的固体支撑体表面上静电吸引核酸、经由共价键而固定化的方法(专利文献1)。对于在固体支撑体表面固定化核酸而形成许多的点，可使用将针前端与固体支撑体表面机械地接触的针方式或利用了喷墨打印机的原理的喷墨方式等的各种点样装置。这样固定化的点在形状上多散乱。例如，点成为月牙状或环状，或点为流动的点等。点的形状不是一定时，在信号的强度上也出现散乱，成为可靠性低的数据。因此，为了利用微阵列使分析精度提高，期望即使在使用任一种装置的情况下，形成于固体支撑体上的点样中，核酸在固体支撑体表面牢固地固定化，同时，其形状或大小尽可能一致，再现性良好。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特开2008-292482号公报发明内容
发明要解决的课题本发明的课题在于，提供一种固体支撑体，其用于在将核酸向固体支撑体上点样时，使核酸的固定化能力提高，并且保持均勻的点形状。解决问题的方法本发明人发现，在静电层上具有活性酯基的固体支撑体的制造中，在具有静电层的基材上导入羧基时，以所测定的羧基的量作为由X射线光电子分光分析(XPS)得到的Cis 光谱中的(coo峰值强度)/(C-C峰值强度)比为适当的值的方式进行调整，由此，可以使核酸的固定化能力提高，并且保持均勻的点形状。S卩，本发明包含以下的发明。(1) 一种用于将核酸固定化的固体支撑体，其是具有基材、静电吸引形成于基材上的核酸的静电层及形成于静电层上的羧基的基板，将由基板表面的X射线光电子分光分析 (XPS)得到的Cls光谱中的(COO峰值强度)/(c-c峰值强度)比为0. 10 0. 20的基板的羧基进行活性酯化而形成。(2)如(1)所述的固体支撑体，其具有由羧基的活性酯化而形成的N-羟基琥珀酰
亚胺基。(3)如(1)或( 所述的固体支撑体，其中，静电层是通过将基材在氨气气氛下进行等离子处理而形成的。(4)如(1) C3)中任一项所述的固体支撑体，其中，在基材的表面具有碳层，在其上形成静电层。(5) 一种用于将核酸固定化的固体支撑体，其由通过将基材用含氨基化合物进行处理而形成静电吸引核酸的静电层、在静电层上接触10 70g/l的浓度的多元羧酸溶液而导入羧基、活化羧基而形成活性酯基而得到。(6)如(5)所述的固体支撑体，其中，活性酯基为N-羟基琥珀酰亚胺基。(7)如(5)或(6)所述的固体支撑体，其中，多元羧酸为聚丙烯酸。(8)如( (7)中任一项所述的固体支撑体，其通过将基材在氨气气氛下进行等离子处理而形成静电层。(9) 一种核酸固定化固体支撑体，其是在(1) (8)中任一项所述的固体支撑体上固定化核酸而形成的。(10) 一种用于将核酸固定化的固体支撑体的制造方法，所述方法包含以下工序通过将基材用含氨基化合物进行处理而形成静电吸引核酸的静电层的工序；及在静电层上接触10 70g/l的浓度的多元羧酸溶液而导入羧基的工序；以及活化羧基而形成活性酯基的工序。(11)如(10)所述的方法，其中，活性酯基为N-羟基琥珀酰亚胺基。(12)如(10)或(11)所述的方法，其中，多元羧酸为聚丙烯酸。(13)如(10) (12)中任一项所述的方法，其通过将基材在氨气气氛下进行等离子处理而形成静电层。本说明书包含记载于作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请2009-209489 号的说明书和/或附图的内容。发明效果
根据本发明，在将核酸向固体支撑体上点样时，可以提高核酸的固定化能力，并且保持均勻的点形状。另外，可得到外观良好的固体支撑体。其结果，可以使利用微阵列的分析精度提高。


图1表示将导入有羧基的基板用X射线光电子分光分析装置进行测定而得到的 Cls光谱图。图2表示在固体支撑体上固定化荧光标记DNA、用CXD照像机拍摄点形状的结果。
具体实施例方式作为用于本发明的基材的材料，可以使用该技术领域中公知的材料，没有特别限制。可列举例如钼、钼黑、金、钯、铑、银、汞、钨及它们的化合物等贵金属以及石墨、碳纤维为代表的碳等导电材料；以单晶硅、非晶硅、碳化硅、氧化硅、氮化硅等为代表的硅材料、以 SOI (绝缘体上硅)等为代表的这些硅材料的复合原材料；玻璃、石英玻璃、硼硅酸玻璃、氧化铝、蓝宝石、陶瓷、镁橄榄石、感光性玻璃等无机材料；聚乙烯、乙烯、聚丙烯、环状聚烯烃、 聚异丁烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、不饱和聚酯、含氟树脂、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩醛、丙烯酸树脂、聚丙烯腈、聚乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛树脂、脲树脂、环氧树脂、三聚氰胺树脂、苯乙烯·丙烯腈共聚物、丙烯腈· 丁二烯乙烯共聚物、聚苯醚及聚砜等有机材料等。基材的形状也没有特别限制，优选为平板状。将本发明的固体支撑体用于微阵列的情况下，从集成化的观点考虑，优选使用具有微细的平板状结构的基材、例如2 5mm见方的平板状的基材。而且，从容易制造微细的平板状结构方面考虑，优选使用由硅材料或树脂材料构成的基材，特别更优选由单晶硅构成的基材。在单晶硅中，也包含一部分极细微地改变结晶轴的方向的单晶硅(有时称为镶嵌晶体)、或含有原子的尺度中的紊乱(格子缺陷)的单晶硅。作为基材，优选使用表面具有碳层的基材。通过形成碳层，可以将静电层或羧基牢固地固定化于基材上。作为碳层，虽然没有特别限制，但优选使用合成金刚石、高压合成金刚石、天然金刚石、软金刚石、非晶碳、碳系物质(例如石墨、富勒烯、碳纳米管)的任一种、 它们的混合物或将它们层压成的物质。另外，也可使用碳化铪、碳化铌、碳化硅、碳化钽、碳化钍、碳化钛、碳化铀、碳化钨、碳化锆、碳化钼、碳化铬、碳化钒等碳化物。这里，软金刚石是将所谓的类金刚石碳(DLC)等的作为金刚石和碳的混合体的不完全金刚石结构体总称，其混合比例没有特别限定。就碳层而言，在化学稳定性优异、可以经得起其后的静电层或羧基的导入及核酸的键合中的反应方面是有利的。另外，在与核酸的键合反应中，在非特异的吸附少方面也是有利的。基材自身也可以使用由碳层构成的物质。本发明中碳层的形成可以用公知的方法进行。可列举例如微波等离子体CVD (化学气相沉积)法、ECRCVD(电子回旋共振化学气相沉积)法、ICP(电感耦合等离子体)法、直流溅射法、ECR(电子回旋共振)溅射法、离子化蒸镀法、弧光式蒸镀法、激光蒸镀法、EB (电子束)蒸镀法、电阻加热蒸镀法等。碳层的厚度优选为Inm 100 μ m。另外，在基材的表面或背面可以制成Ti、Au、Pt、Nb、Cr、TiC、TiN等单层的膜或它们的复合膜作为反射层。反射层的厚度需要整体上均勻，因此，优选为IOnm以上，进一步优选为IOOnm以上。使用玻璃作为基材的情况下，其表面也优选在Ra(JIS B 0601)为Inm IOOOnm 的范围内有意地进行粗面化。这种粗面化表面，在基材的表面积增加、可以以高密度固定化大量的核酸方面是有利的。在基材上形成用于静电吸引核酸的静电层。作为静电层，只要是静电吸引核酸、使核酸的固定化量提高的静电层，就没有特别限制，可以使用例如含氨基化合物等具有正电荷的化合物来形成。作为上述含氨基化合物，可列举具有未取代的氨基(-NH2)或用碳数1 6的烷基等进行了一取代的氨基(_NHR;R为取代基)的化合物，例如氨、乙二胺、六亚甲基二胺、正丙基胺、单甲胺、二甲胺、单乙胺、二乙胺、烯丙胺、氨基偶氮苯、氨基醇(例如乙醇胺)、利凡诺、氨基苯甲酸、氨基蒽醌、氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、白氨酸、丝氨酸、苏氨酸、巯基丙氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸、半胱胺酸、谷氨酸、天门冬氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、苯胺或它们的聚合物(例如聚烯丙胺、聚赖氨酸) 或共聚物；4，4’，4”_三氨基三苯基甲烷、三氨蝶呤、亚精胺、精胺、腐胺、聚烯丙胺等多元胺 (多价胺)。静电层可以通过例如将基材在氨气气氛下进行等离子体处理来形成。或者，静电层也可以通过在将碳层制膜时将含氨基化合物(例如氨气)导入于制膜装置内、作为含有氨基的碳素皮膜(炭素系皮膜)进行制膜。在提高静电层和基材的亲和性、即密合性方面，可以在基材上使含氨基化合物和碳化合物蒸镀之后导入羧基。作为在此使用的碳化合物，只要可以作为气体供给，就没有特别限制，但优选例如在常温下为气体的甲烷、乙烷、丙烷。作为蒸镀的方法，优选离子化蒸镀法，作为离子化蒸镀法的条件，优选为工作压力是0. 1 50 、而且加速电压是200 1000V的范围。也可以通过在基材上、氯气中进行紫外线照射而将表面氯化，接着在含氨基化合物中、使例如聚烯丙胺、聚赖氨酸、4，4’，4”_三氨基三苯基甲烷、三氨蝶呤等多元胺反应、在不与基材键合的侧的末端导入氨基来形成静电层。在溶液中进行在静电层上导入羧基的反应(例如，使用二羧酸或多元羧酸的羧基的导入)的情况下，优选形成静电层之后导入羧基。作为上述溶液的溶剂，可列举例如水、 N-甲基吡咯烷酮、乙醇及它们的混合物。也可以通过将基材浸渍于含有含氨基化合物的溶液中来形成静电层。此时，使用多元胺、特别是聚烯丙胺作为含氨基化合物时，与基材的附着性优异，使核酸的固定化量进
一步提尚°静电层的厚度优选为Inm 500 μ m。如上所述，通过在形成于基材表面的静电层上导入羧基来制作基板。作为用于导入羧基的化合物，可列举例如化学式A-Ri-COOiK式中，X表示卤原子，R1表示碳数1 12 的2价的烃基)所示的卤代羧酸，例如氯醋酸、氟醋酸、溴醋酸、碘醋酸、2-氯丙酸、3-氯丙酸、3-氯丙烯酸、4-氯苯甲酸；化学式H00C-R2-C00H(式中，R2表示单键或碳数1 12的 2价的烃基)所示的二羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸；聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、偏苯三酸、丁烷四羧酸等多元羧酸；化学式=R3-CO-R4-COOH(式中，R3表示氢原子或碳数1 12的2价的烃基，R4表示碳数1 12的2价的烃基)所示的酮酸或醛酸；化学式=X-OC-R5-COOH(式中，X表示卤原子，R5表示单键或碳数1 12的2价的烃基)所示的二羧酸的单卤化物、例如琥珀酸单氯化物、丙二酸单氯化物；邻苯二甲酸酐、 琥珀酸酐、草酸酐、马来酸酐、丁烷四羧酸酐等酸酐。优选使用多元羧酸，更优选使用聚丙烯酸。使用多元羧酸的情况，羧基与静电层的氨基缩合而形成酰胺键，因此，可以经由牢固的键而导入羧基。另外，聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、偏苯三酸、丁烷四羧酸等多元羧酸也具有使亲水性提高的效果。羧基可以通过使具有静电层的基材与上述化合物、优选多元羧酸、更优选聚丙烯酸的溶液接触来导入。作为溶液的溶剂，可以使用水或醇等有机溶剂、例如乙醇、IPA、甲醇、 N, N-二甲基甲酰胺、丙酮、二噁烷、醇及它们的混合物。在如上述得到的静电层上导入羧基的基板，通过利用X射线光电子分光分析 (XPS)的碳的化学键状态的分析所得的Cls光谱中的(COO峰值强度)/(C-C峰值强度)比为0. 10 0. 20，优选为0. 12 0. 18。就该强度比而言，在X射线光电子分光分析中，在Cls 光谱(横轴为结合能，纵轴为能量强度)中，用来自结合能表现为^8.8eV(峰顶)的羧基 (C00 (H)键)的峰值的强度忙00峰值强度)和来自结合能表现为观4. 7eV (峰顶)的C-C 键的峰值强度(C-C峰值强度)之比表示。通过以满足该条件的方式调整羧基的量，可以在羧基的活化后的固体支撑体中， 使核酸的固定化能力提高(在核酸的检测中可得到良好的信号强度)，并且保持均勻的点形状。另外，也可以防止在固体支撑体上形成斑点，可得到良好的外观。羧基的量可以基于羧基的导入方法、得到上述峰值强度比的方式适当进行调整。 例如，使具有静电层的基材与为了导入羧基而使用的化合物的溶液接触时，通过调整该化合物的溶液的浓度，可以调整羧基的量。使用多元羧酸、更优选聚丙烯酸的溶液时，通过使用10 70g/l、优选10 35g/l的浓度的多元羧酸溶液，可以由X射线光电子分光分析 (XPS)得到的Cls光谱中的(C00峰值强度)/(C-C峰值强度)比为上述值的方式进行调整。通过将如上述导入的羧基进行活化而成为活性酯基(进行活性酯化)，可得到本发明的固体支撑体。活性酯基是指在酯基的醇侧具有酸性度高的吸电子基团而活化亲核反应的酯类，即反应活性高的酯基。是在酯基的醇侧具有吸电子基团、比烷基酯更活化的酯基。活性酯基具有对氨基、硫醇基、羟基等基团的反应性。更具体而言，苯酚酯类、苯硫酚酯类、N-羟基胺酯类、氰基甲酯、杂环羟基化合物的酯类等作为与烷基酯等相比具有较高的活性的活性酯基是已知的。作为活性酯基，具体列举对硝基苯基、N-羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酸酰亚胺基、邻苯二甲酸酰亚胺基、5-降冰片烯-2，3-二羧基酰亚胺基等，在固定化核酸方面，特别优选N-羟基琥珀酰亚胺基。活性酯基的导入(活性酯化)可以通过例如将如上述导入的羧基用氰胺或碳化二亚胺(例如，1-[3_( 二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺)等脱水缩合剂和N-羟基琥珀酰亚胺等化合物进行活性酯化来实施。通过该处理，可以经由酰胺键形成在烃基的末端键合有N-羟基琥珀酰亚胺基等活性酯基的基团(例如，日本特开2001-139532号公报)。对于本发明的固体支撑体，也可以固定化DNA以及RNA的任一种核酸。通常将1 200碱基、优选5 150碱基的核酸进行固定化。DNA的一条链、二条链均可以进行固定化。在本发明中，对于核酸也包含人工核酸。作为人工核酸，可以列举核酸中的磷酸二酯键变换为硫代磷酸酯键的核酸衍生物、核酸中的磷酸二酯键变换为N3’ -P5’亚磷酰胺键的核酸衍生物、核酸中的核糖和磷酸二酯键变换为肽核酸键的核酸衍生物、核酸中的尿嘧啶用C-5丙炔基尿嘧啶取代的核酸衍生物、核酸中的尿嘧啶用C-5噻唑尿嘧啶取代的核酸衍生物、核酸中的胞嘧啶用C-5丙炔基胞嘧啶取代的核酸衍生物、核酸中的胞嘧啶用吩噁嗪修饰胞嘧啶取代的核酸衍生物、核酸中的核糖用2’ -0-丙基核糖取代的核酸衍生物、 核酸中的核糖用2’-0_甲氧基核糖取代的核酸衍生物、以及核酸中的核糖用2’-甲氧基乙氧基核糖取代的核酸衍生物等。对于本发明的固体支撑体固定化核酸的方法没有特别限制。例如，将核酸溶解于缓冲剂而制作溶液，用点样仪将核酸溶液点在固体支撑体上，之后，在加热的烤箱中烘烤一定时间，其后，通过清洗除去没有固定化的核酸。通过使用点样仪，可以将其它种类的核酸在固体支撑体上的不同的位置固定化，因此，可以同时实施许多的试验。在本发明的固体支撑体上固定化核酸而形成的核酸固定化固体支撑体应用于例如基因表达的监测、碱基排列的确定、变异分析、多型分析等。以下，对使用本发明的固体支撑体的核酸试样的检测方法进行说明。首先，准备标记的核酸试样。作为核酸试样(目标核酸)通常使用其排列或功能未知的DNA或RNA。标记的核酸试样以研究基因表达为目的，一般通过如下方法来得到，即，如果为真核生物，则从其细胞或组织样品中提取mRNA之后，利用逆转录反应，一边吸入标记dNTP，一边合成cDNA。如果是细菌等原核生物，则mRNA的选择性的提取是困难的，因此，提取所有 RNA。在以染色体组为试样的情况下，可以从除红细胞之外的任意组织样品离析。除红细胞之外的任意的组织为例如外周血液淋巴细胞、皮肤、毛发、精液等。1次的杂交中所需要的 mRNA量也因液量或标记方法而异，但通常为数yg以下。需要说明的是，也有将mRNA用作反义RNA的方法。作为标记dNTP，从化学的稳定性方面考虑，优选使用标记dCTP。另外，在作为固定化于固体支撑体上的探针的核酸为低聚核苷酸的情况下，优选将核酸试样进行低分子化。标记的核酸试样以研究基因的变异或多型为目的，一般通过在包含标记引物或标记dNTP的反应体系中进行靶标区域的PCR来得到。作为标记，已知有RI标记和非RI标记(荧光法、生物素法、化学发光法等)，优选使用荧光标记。作为荧光标记，可列举Cy3以及Cy5等CyDye、FITC、RITC、若丹明、德克萨斯红、ΤΕΤ、TAMRA, FAM、HEX、ROX等，作为放射能标记，可列举α -32Ρ、y _32P、35S等。接着，将上述标记核酸试样溶解或分散于SSC等水性介质，制备试样的水溶液。将该水溶液与固定化有核酸的固体支撑体接触后进行培养并进行杂交。培养优选在室温 100°C的范围的温度下、用1 M小时的范围的时间实施。由此，固体支撑体上的探针核酸和具有与探针核酸互补的碱基排列的核酸形成杂合体。杂交结束后，优选使用表面活性剂的溶液和缓冲液的混合溶液进行清洗，除去未反应的核酸试样。作为表面活性剂，优选使用十二烷基硫酸钠。作为缓冲液，可以使用柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、Tris缓冲液或good's缓冲液等，优选使用柠檬酸缓冲液。接着，利用检测器检测来自在固体支撑体上所形成的杂合体的荧光信号。作为检测器，使用连结有例如荧光激光显微镜、冷却CCD照像机及电子计算机的荧光扫描装置，可以自动地测定固体支撑体上的荧光强度。取代CCD照像机，也可以使用共焦点型或非焦点型的激光。由此，可得到图像数据。可以由所得的数据对在固体支撑体上固定化的探针核酸鉴定为是具有互补性的目标核酸，基于此制作基因表达谱，可以确定核酸试样的碱基排列。而且，通过利用数据分析软件或外部数据基础，也可以进行基因的变异或多型等更复杂的分析。或者，作为试样，准备多种利用相互不同的荧光物质标记的核酸试样，将它们同时使用，由此，也可以在一个固体支撑体上进行表达量的比较或定量。本发明的固体支撑体也可以用于核酸例如DNA的伸长反应。此时，首先，在固体支撑体上将引物固定化，使一条链或二条链DNA杂交。其后，利用DNA伸长反应使与引物杂交的DNA互补的DNA伸长。作为引物，使用长度以及排列清楚的一条链或二条链的核酸。长度没有特别限定，优选为5 200碱基，进一步优选为10 100碱基。关于现有的固体支撑体，有时引物通过伸长反应中的热处理而剥离，但本发明的固体支撑体即使加热，引物也不剥离，可以在将引物固定化于固体支撑体的状态下使伸长反应进行。在该伸长反应时，吸入标记的核酸，伸长反应后，读取标记的信号，由此，可以检测是否特定的DNA与引物杂交并进行伸长反应。因此，在试验的试样中，可以判定是否含有能够与固定化支撑体上的引物杂交的DNA，可以成为研究及医疗中的有用的检测方法。关于标记及检测，与上述相同。另外，本发明的固体支撑体也可以用于核酸的增幅反应。在利用PCR反应增幅的情况下，例如，首先在固体支撑体上固定化正向引物，使一条链或二条链DNA杂交，其后，通过酶反应将互补链DNA伸长。而且，连续进行1)退火、2)杂交、3)伸长反应的工序，由此， 进行所谓的PCR反应。现有的固体支撑体存在如下问题通过PCR反应中的热处理，引物剥离，或热循环的控制失败，但本发明的固体支撑体即使加热，引物也不剥离，而且，不是在容器中而在固体支撑体上、在固定化有DNA的状态下进行反应，因此，PCR反应中的温度控制正确，对增幅的核酸的排列的正确性产生影响，或复制目的外的DNA的可能性也低，可以有效地增幅DNA。而且，通过将使用有上述标记核酸的检测和PCR引起的增幅组合，即使能够与固体支撑体上的引物杂交的DNA在试样中仅含有少量的情况下，也如上述那样复制DNA，结果，大量的DNA与固体支撑体上的引物杂交，其互补链伸长，因此，可以使检测灵敏度增大。或者，作为用于伸长反应的酶，通过选择链取代型DNA多聚酶并加入反向引物，可以不经过热循环而在恒温下使DNA在固体支撑体上增幅。链取代型DNA多聚酶为一种DNA 合成酶，其在可以合成与模板DNA互补的DNA链的过程中，在伸长方向存在二条链区域的情况下，可以一边将该链解离，一边继续进行互补链合成。作为链取代型DNA多聚酶，没有特别限定，可列举例如BcaBEST DNA多聚酶(宝生物)、Wii29 DNA聚合酶(阿玛西亚生物科学)等。通过以由mRNA合成的cDNA为对象，RNA也可以成为上述形态的对象。此时，由 mRNA利用逆转录反应得到cDNA，但可以与得到cDNA同时，使其在固体支撑体上固定化。首先，使逆转录引物与固体支撑体的活性酯基键合。作为引物，一般使用低聚dT引物、与特定碱基排列互补的引物、随机6碱基引物，其中，优选使用与RNA的5’末端的poly(A) +排列相对应、由连结有10 20个左右T(胸腺嘧啶碱基)的排列构成的低聚dT引物。在使用低聚dT引物的情况下，使成为模板的RNA的5’末端的poly(A)部分退火。其中使逆转录酶起作用，相对于模板RNA，使互补的dNTP与引物的3’末端依次聚合，由此，在5’ 3’的方向合成cDNA。该逆转录反应的引物的键合、退火、逆转录酶引起的互补链聚合可以通过按照常规方法进行温度控制(热循环)来实施。这样，可以进行逆转录反应，同时也进行对固体支撑体的固定化，因此，根据本发明的方法，可以有效地进行所谓的RT-PCR，即使作为 mRNA的定量用也是有用的。下面，利用实施例对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。实施例在实施了将2. 5英寸硅薄片((株)新阳制、η型)切割加工成3mm见方的硅基材上，使用离子化蒸镀法，在下述的条件下进行2层的DLC层的制膜。表1
第1层第2层原料气体 CH4 4.75 47.5 (sscm) H20.25 2.5 (sscm)
工作压力3.0 8.0 (Pa)
基板偏压直流电压 500 500 (V) 高频输出 100 -(W)
阳极电压50 50 (V)
灯丝电压 77(V)
电流 22 22 (A)将在所得的表面具有DLC层的硅基材，在下述的条件下、在氨气气氛下进行等离子体处理，由此导入氨基。表2
原料气体NH330(sscm)
工作压力8.0(sscm)
基板偏压直流电压500(Pa)
高频输出-(W)
阳极电压50(V)
灯丝电压7(V)
电流 22(A)将导入有氨基的基材浸渍于聚丙烯酸水溶液(浓度1、10、50、70、100或500g/l) (10分钟X室温)，用纯水进行清洗，实施利用氮气的喷涂干燥。需要说明的是，在本实施例中，使用和光纯药工業(株)社制的聚丙烯酸水溶液(25重量％)，将其用水稀释而制成上述浓度。将导入有羧基的基板用X射线光电子分光分析装置(ULVAC-PHI制ESCA5100，X射线源Mg，分析区域φ3mm)进行测定，得到Cls光谱。图1表示所得的图。而且，算出来自表现为结合能观8. SeV的羧基(COO(H)键)的峰值的强度和来自表现为结合能观4. 7eV 的C-C键的峰值的强度之比。其后，对没有实施ESCA的测定的部分在0. IM磷酸缓冲液(pH6) 300ml中溶解有 0. IM的1-[3-( 二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳化二亚胺和20mM的N-羟基琥珀酰亚胺的活化液中浸渍30分钟，由此将羧基活化(N-羟基琥珀酰亚胺基的导入)，得到固体支撑体。在所得的固体支撑体上点样22mer的Cy3标记低聚DNA(5 μ M)，并在80°C的烤箱中加热1小时后，用2XSSC/0. 2% SDS在室温下清洗15分钟以及在70°C下清洗5分钟，水洗后，进行离心干燥(1500rpmXl分钟)，由此，将荧光标记DNA在固体支撑体上固定化。用 CXD照像机(X20)拍摄点形状(图2)。另外，用FLA-8000(富士胶片株式会社)测定荧光强度。将结果示于以下的表。表3
权利要求
1.一种用于将核酸固定化的固体支撑体，其是具有基材、静电吸引形成于基材上的核酸的静电层、及形成于静电层上的羧基的基板，是将由基板表面的X射线光电子分光分析 (XPS)得到的Cls光谱中的(COO峰值强度)/(c-c峰值强度)比为0. 10 0. 20的基板的羧基进行活性酯化而形成。
2.如权利要求1所述的固体支撑体，其具有由羧基的活性酯化而形成的N-羟基琥珀酰亚胺基。
3.如权利要求1或2所述的固体支撑体，其中，静电层是通过将基材在氨气气氛下进行等离子处理而形成的。
4.如权利要求1 3中任一项所述的固体支撑体，其中，在基材的表面具有碳层，在所述碳层上形成静电层。
5.一种用于将核酸固定化的固体支撑体，其由通过将基材用含氨基化合物进行处理而形成静电吸引核酸的静电层，在静电层上接触10 70g/l的浓度的多元羧酸溶液而导入羧基，活化羧基而形成活性酯基而得到。
6.如权利要求5所述的固体支撑体，其中，活性酯基为N-羟基琥珀酰亚胺基。
7.如权利要求5或6所述的固体支撑体，其中，多元羧酸为聚丙烯酸。
8.如权利要求5 7中任一项所述的固体支撑体，通过将基材在氨气气氛下进行等离子处理而形成静电层。
9.一种核酸固定化固体支撑体，其在权利要求1 8中任一项所述的固体支撑体上固定化核酸而形成。
10.一种用于将核酸固定化的固体支撑体的制造方法，所述方法包含以下工序通过将基材用含氨基化合物进行处理而形成静电吸引核酸的静电层的工序；及在静电层上接触10 70g/l的浓度的多元羧酸溶液而导入羧基的工序；以及活化羧基而形成活性酯基的工序。
11.如权利要求10所述的方法，其中，活性酯基为N-羟基琥珀酰亚胺基。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中，多元羧酸为聚丙烯酸。
13.如权利要求10 12中任一项所述的方法，通过将基材在氨气气氛下进行等离子处理而形成静电层。
全文摘要
本发明提供一种固体支撑体，其用于在将核酸向固体支撑体上点样时，使核酸的固定化能力提高，并且保持均匀的点形状。一种用于将核酸固定化的固体支撑体，其是具有基材、静电吸引形成于基材上的核酸的静电层及形成于静电层上的羧基的基板，是将基板的羧基进行活性酯化而形成的，其中，由基板表面的X射线光电子分光分析(XPS)得到的C1s光谱中的(COO峰值强度)/(C-C峰值强度)比为0.10～0.20。
文档编号G01N33/543GK102482717SQ20108004002
公开日2012年5月30日 申请日期2010年9月9日 优先权日2009年9月10日
发明者山野博文 申请人:东洋钢钣株式会社