反义核酸的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供能够高效地使人抗肌萎缩蛋白基因的第55、45、50以及44号外显子发生跳跃的药剂。本发明提供能够使人抗肌萎缩蛋白基因的第55、45、50以及44号外显子发生跳跃的寡聚物。
【专利说明】反义核酸
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种能够使人抗肌萎缩蛋白基因的第55、45、50以及44号外显子发生跳跃的反义寡聚物及含有该寡聚物的医药组合物。
【背景技术】
[0002]杜氏肌营养不良症(DMD)，是在出生男子中约3500人中就会有I人发病的频度最高的遗传性进行性肌萎缩症。该症，在乳幼儿期间显示出与正常人几乎没有变化的运动机能，但是，从4~5岁左右开始显现出肌力低下。然后，肌力低下进一步发展，到12岁左右变得不能歩行，到20多岁会成为由于心不全或呼吸器不全而至死亡的重症的疾病。现在，没有对于DMD的有效的治疗方法，在强烈寻求新的治疗药的开发。
[0003]对于 DMD，已知抗肌萎缩蛋白基因的变异是其原因。抗肌萎缩蛋白基因，存在于X染色体，并且是由220万碱基对的DNA构成的巨大的基因。从DNA转录至mRNA前驱体，进一步地,通过剪接(Splicing)除去内含子,合成结合有79个外显子的mRNA。从该mRNA翻译成3，685个的氨基酸，生成抗肌萎缩蛋白质。抗肌萎缩蛋白质，参与肌细胞的膜稳定性的维持，因此为了使肌细胞难以破坏，该抗肌萎缩蛋白质是必须的。DMD患者的抗肌萎缩蛋白基因产生变异，因此，在肌细胞中，几乎没有发现具有机能的抗肌萎缩蛋白质。因此，在DMD患者体内，不能维持肌细胞的构造，大量的钙离子流入肌细胞内。其结果，产生与炎症相似的反应，纤维化发生推进，肌细胞变得难以再生。
[0004]贝克型肌营养不良症(BMD)，其产生原因也是抗肌萎缩蛋白基因的变异，但是，其症状虽然也呈现出由于肌萎缩而引起的肌力低下，但是通常比DMD轻，肌力低下的进展也慢，在多数情况下，在成人期发病。DMD与BMD的临床症状的差异，被认为是在于，通过变异而在抗肌萎缩蛋白的mRNA向抗肌萎缩蛋白质翻译时的氨基酸的阅读框被破坏，或者是被维持(非专利文献I)。即，在DMD的情形，氨基酸阅读框具有不对齐变异，因此，几乎没有发现具有机能的抗肌萎缩蛋白质，但是在BMD的情形，虽然由于变异外显子的一部分发生缺失，但是氨基酸阅读框被维持，因此，产生了虽然不完全但是具有机能的抗肌萎缩蛋白质。
[0005]作为DMD的治疗方法，可期待外显子跳跃法。该方法，是通过改变剪接来修复抗肌萎缩蛋白的mRNA的氨基酸阅读框，诱导部分恢复机能的抗肌萎缩蛋白质的表达的方法(非专利文献2)。成为外显子跳跃的対象的氨基酸序列部分会发生缺失。因此，在该治疗中表达的抗肌萎缩蛋白质比正常蛋白质短，但是氨基酸阅读框被维持，因此，使肌细胞稳定化的机能被部分保持。因此，通过外显子跳跃，可以期待DMD显现出与更轻症的BMD相同的症状。外显子跳跃法，经过通过小鼠或狗进行的动物实验，已应用于对于人DMD患者的临床试验。
[0006]外显子跳跃，能够通过5’或3’剪接部位的任一者或两者、或以外显子的内部作为靶的反义核酸的结合进行诱导。外显子，仅在两者的剪接部位通过剪接体复合体识别的情形会包含在mRNA中。因此，通过使用反义核酸靶向剪接部位，能够诱导外显子跳跃。另外，为了使外显子被剪接机构识别，认为对外显子剪接增强子(ESE)的SR蛋白质的结合是需要的，在靶向ESE时，也能够诱导外显子的跳跃。[0007]抗肌萎缩蛋白基因的变异，根据DMD患者的不同而不同，因此，需要适用于基因变异的场所或种类的反义核酸。至今为止，西澳大利亚大学的Steve Wilton等制作了对于所有的79个的外显子进行诱导外显子跳跃的反义核酸(非专利文献3)、荷兰的AnnemiekeAartsma-Rus等制作了对于39种类的外显子进行诱导外显子跳跃的反义核酸(非专利文献4)。
[0008]全DMD患者的20%左右，认为通过跳跃第55、45、50以及44号外显子(以下，称为“外显子55”，“外显子45”，“外显子50”以及“外显子44”)，可进行治疗。近年来，对于以抗肌萎缩蛋白基因的外显子55、45、50以及44作为外显子跳跃的靶而进行的研究，有多个研究机构做出了报告(专利文献I~8)。但是，使外显子55、45、50以及44在患者细胞中高效地跳跃的技术，至今 尚未确立。
[0009]专利文献1:国际公开公报W02006/000057
[0010]专利文献2:国际公开公报W02004/048570
[0011]专利文献3:美国专利公开公报US2010/0168212
[0012]专利文献4:国际公开公报W02010/048586
[0013]专利文献5:国际公开公报W02004/083446
[0014]专利文献6:国际公开公报W02010/050801
[0015]专利文献7:国际公开公报W02009/139630
[0016]非专利文献I:Monaco A.P.et al.，Genomicsl988 ；2:p.90 — 95。
[0017]非专利文献2 =Matsuo Μ.，Brain Devl996 ; 18:p.167 — 172
[0018]非专利文献3:ffilton S.D.，et al.，Molecular Therapy2007:15:p.1288 — 96
[0019]非专利文献4:Annemieke Aartsma — Rus et al., (2002) NeuromuscularDisordersl2:S71 - S77
[0020]非专利文献5:Linda J.Popplewell et al., (2010)Neuromuscular Disorders,vol.20, n0.2, p.102 — 10
【发明内容】
[0021]在上述情形下，希望能够有一种能够强烈诱导抗肌萎缩蛋白基因的外显子55、45、50以及44跳跃的反义寡聚物及含有该寡聚物的肌营养不良治疗药物。
[0022]本发明人等，仔细研究抗肌萎缩蛋白基因的结构的结果发现，在抗肌萎缩蛋白基因的mRNA前驱体(以下,称为“pre — mRNA”)中，通过使用反义寡聚物对由外显子55的5’末端开始的第I~21号、第11~31号、第14~34号周边的核苷酸构成的序列进行靶向，能够高效率地诱导外显子55的跳跃。
[0023]另外，本发明人等发现，在抗肌萎缩蛋白基因pre — mRNA中，通过使用反义寡聚物对由外显子45的5’末端开始的第I~25号以及第6~30号周边的核苷酸构成的序列进行靶向，能够高效率地诱导外显子45的跳跃。
[0024]此外，本发明人等发现，在抗肌萎缩蛋白基因pre — mRNA中，通过使用反义寡聚物对由外显子50的5’末端开始的第107~127号周边的核苷酸构成的序列进行靶向，能够高效率地诱导外显子50的跳跃。
[0025]另外，本发明人等发现，在抗肌萎缩蛋白基因pre — mRNA中，通过使用反义寡聚物对由外显子44的5’末端开始的第11~32号以及第26~47号周边的核苷酸构成的序列进行靶向，能够高效率地诱导外显子44的跳跃。
[0026]本发明人等，根据该认识，完成了本发明。
[0027]即，本发明如下所示。
[0028][I] 一种反义寡聚物，其是能够使人抗肌萎缩蛋白基因的第55号外显子发生跳跃的反义寡聚物，其中，其是由与从人抗肌萎缩蛋白基因的第55号外显子的5’末端开始的第-2~19号、第-2~20号、第-2~21号、第-2~22号、第-2~23号、第-1~19号、第-1~20号、第-1~21号、第-1~22号、第-1~23号、第1~19号、第1~20号、第1~21号、第1~22号、第1~23号、第2~19号、第2~20号、第2~21号、第2~22号、第2~23号、第3~19号、第3~20号、第3~21号、第3~22号、第3~23号、第9~29号、第9~30号、第9~31号、第9~32号、第9~33号、第10~29号、第10~
30号、第10~31号、第10~32号、第10~33号、第11~29号、第11~30号、第11~31号、第11~32号、第11~33号、第12~29号、第12~30号、第12~31号、第12~32号、第12~33号、第13~29号、第13~30号、第13~31号、第13~32号、第13~33号、第12~34号、第12~35号、第12~36号、第13~34号、第13~35号、第13~36号、第14~32号、第14~33号、第14~34号、第14~35号、第14~36号、第15~
32号、第15~33号、第15~34号、第15~35号、第15~36号、第16~32号、第16~
33号、第16~34号、第16~35号或第16~36号的核苷酸构成的序列中的任一者互补的碱基序列构成。
[0029][2] 一种反义寡聚物，其是能够使人抗肌萎缩蛋白基因的第45号外显子发生跳跃的反义寡聚物，其中，其是由与从人抗肌萎缩蛋白基因的第45号外显子的5’末端开始的第-3~19号、第-3~20号、第-3~21号、第-3~22号、第-3~23号、第-2~19号、第-2~20号、第-2~21号、第-2~22号、第-2~23号、第-1~19号、第-1~20号、第-1~21号、第-1~22号、第-1~23号、第I~19号、第I~20号、第I~21号、第I~22号、第I~23号、第2~19号、第2~20号、第2~21号、第2~22号、第2~23号、第-2~24号、第-2~25号、第-2~26号、第-2~27号、第-1~24号、第-1~25号、第-1~26号、第-1~27号、第I~24号、第I~25号、第I~26号、第I~27号、第2~24号、第2~25号、第2~26号、第2~27号、第3~23号、第3~24号、第3~
25号、第3~26号、第3~27号、第4~28号、第4~29号、第4~30号、第4~31号、第4~32号、第5~28号、第5~29号、第5~30号、第5~31号、第5~32号、第6~
28号、第6~29号、第6~30号、第6~31号、第6~32号、第7~28号、第7~29号、第7~30号、第7~31号、第7~32号、第8~28号、第8~29号、第8~30号、第8~
31号或第8~32号的核苷酸构成的序列中的任一者互补的碱基序列构成。
[0030][3] 一种反义寡聚物，其是能够使人抗肌萎缩蛋白基因的第50号外显子发生跳跃的反义寡聚物，其中，其是由与从人抗肌萎缩蛋白基因的第50号外显子的5’末端开始的第105~125号、第105~126号、第105~127号、第105~128号、第105~129号、第106~125号、第106~126号、第106~127号、第106~128号、第106~129号、第107~125号、第107~126号、第107~127号、第107~128号、第107~129号、第108~125号、第108~126号、第108~127号、第108~128号、第108~129号、第109~125号、第109~126号、第109~127号、第109~128号或第109~129号的核苷酸构成的序列中的任一者互补的碱基序列构成。
[0031][4] 一种反义寡聚物，其是能够使人抗肌萎缩蛋白基因的第44号外显子发生跳跃的反义寡聚物，其中，其是由与从人抗肌萎缩蛋白基因的第44号外显子的5’末端开始的第9~30号、第9~31号、第9~32号、第9~33号、第9~34号、第10~30号、第10~
31号、第10~32号、第10~33号、第10~34号、第11~30号、第11~31号、第11~
32号、第11~33号、第11~34号、第12~30号、第12~31号、第12~32号、第12~
33号、第12~34号、第13~30号、第13~31号、第13~32号、第13~33号、第13~
34号、第24~45号、第24~46号、第24~47号、第24~48号、第24~49号、第25~45号、第25~46号、第25~47号、第25~48号、第25~49号、第26~45号、第26~46号、第26~47号、第26~48号、第26~49号、第27~45号、第27~46号、第27~47号、第27~48号、第27~49号、第28~45号、第28~46号、第28~47号、第28~48号、第28~49号、第29~45号、第29~46号、第29~47号、第29~48号或第29~49号的核苷酸构成的序列中的任一者互补的碱基序列构成。
[0032][5]如前述[1]所述的反义寡聚物，其中，其是由与从人抗肌萎缩蛋白基因的第55号外显子的5’末端开始的第1~21号、第11~31号或第14~34号的核苷酸构成的序列互补的碱基序列构成。
[0033][6]如前述[1]所述的反义寡聚物，其中，其是由序列号5的第170~190号、第160~180号或第157~177号的核苷酸构成的序列中的任一者的碱基序列构成。
[0034][7]如前述[2]所述的反义寡聚物，其中，其是由与从人抗肌萎缩蛋白基因的第45号外显子的5’末端开始的第-2~19号、第I~21号、第I~25号或第6~30号的核苷酸构成的序列互补的碱基序列构成。
[0035][8]如前述[2]所述的反义寡聚物，其中，其是由序列号6的第158~178号、第156~176号、第152~176号或第147~171号的核苷酸构成的序列中的任一者的碱基序列构成。
[0036][9]如前述[3]所述的反义寡聚物，其中，其是由与从人抗肌萎缩蛋白基因的第50号外显子的5’末端开始的第106~126号或第107~127号的核苷酸构成的序列互补的碱基序列构成。
[0037][10]如前述[3]所述的反义寡聚物，其中，其是由序列号7的第4~24号或第3~
23号的核苷酸构成的序列中的任一者的碱基序列构成。
[0038][11]如前述[4]所述的反义寡聚物，其中，其是由与从人抗肌萎缩蛋白基因的第44号外显子的5’末端开始的第11~32号、第25~45号、第26~46号、第26~47号或第27~47号的核苷酸构成的序列互补的碱基序列构成。
[0039][12]如前述[4]所述的反义寡聚物，其中，其是由序列号8的第117~138号、第104~124号、第103~123号、第102~123号或第102~122号的核苷酸构成的序列中的任一者的碱基序列构成。
[0040][13]如前述[I]~[12]中任一项所述的反义寡聚物，其中，其是寡核苷酸。
[0041][14]如前述[13]所述的反义寡聚物，其中，构成前述寡核苷酸的至少一个的核苷酸的糖部分和/或磷酸键部分被修饰。[0042][15]如前述[14]所述的反义寡聚物，其中，构成前述寡核苷酸的至少一个的核苷酸的糖部分是 2’ 位的一OH 基被从由 OR、R、R’ OR、SH、SR、NH2, NHR、NR2, N3, CN、F、Cl、Br、
及I构成的组中选出的任一者的基团取代的核糖。
[0043](上述R是表示烷基或者芳基,上述R’是表示亚烷基。)
[0044][16]如前述[14]或[15]所述的反义寡聚物，其中，构成前述寡核苷酸的至少一个的核苷酸的磷酸键部分是从由硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、酰胺磷酸酯(phosphoroamidate)键、及硼烧磷酸酯(boranophosphate)键构成的组中选出的任一者。
[0045][17]如前述[I]~[12]中任一项所述的反义寡聚物，其中，其是吗啉寡聚物。
[0046][18]如前述[17]所述的反义寡聚物，其中，其是二酰胺磷酸酯(phosphorodiamidate)吗啉寡聚物。
[0047][19]如前述[17]或[18]所述的反义寡聚物，其中，5’末端是下述化学式⑴~(3)中的任意的基团。
[0048]
【权利要求】
1.一种反义寡聚物，其是能够使人抗肌萎缩蛋白基因的第55号外显子发生跳跃的反义寡聚物，其中，其是由与从人抗肌萎缩蛋白基因的第55号外显子的5’末端开始的第14~34号、第-2~19号、第-2~20号、第-2~21号、第-2~22号、第-2~23号、第-1~19号、第-1~20号、第-1~21号、第-1~22号、第-1~23号、第I~19号、第I~20号、第I~21号、第I~22号、第I~23号、第2~19号、第2~20号、第2~21号、第2~22号、第2~23号、第3~19号、第3~20号、第3~21号、第3~22号、第3~23号、第9~29号、第9~30号、第9~31号、第9~32号、第9~33号、第10~29号、第10~30号、第10~31号、第10~32号、第10~33号、第11~29号、第11~30号、第11~31号、第11~32号、第11~33号、第12~29号、第12~30号、第12~31号、第12~32号、第12~33号、第13~29号、第13~30号、第13~31号、第13~32号、第13~33号、第12~34号、第12~35号、第12~36号、第13~34号、第13~35号、第13~36号、第14~32号、第14~33号、第14~35号、第14~36号、第15~32号、第15~33号、第15~34号、第15~35号、第15~36号、第16~32号、第16~33号、第16~34号、第16~35号或第16~36号的核苷酸构成的序列中的任一者互补的碱基序列构成。
2.一种反义寡聚物，其是能够使人抗肌萎缩蛋白基因的第45号外显子发生跳跃的反义寡聚物，其中，其是由与从人抗肌萎缩蛋白基因的第45号外显子的5’末端开始的第-3~19号、第-3~20号、第-3~21号、第-3~22号、第-3~23号、第-2~19号、第-2~20号、第-2~21号 、第-2~22号、第-2~23号、第-1~19号、第-1~20号、第-1~21号、第-1~22号、第-1~23号、第I~19号、第I~20号、第I~21号、第I~22号、第I~23号、第2~19号、第2~20号、第2~21号、第2~22号、第2~23号、第-2~24号、第-2~25号、第-2~26号、第-2~27号、第-1~24号、第-1~25号、第-1~26号、第-1~27号、第I~24号、第I~25号、第I~26号、第I~27号、第2~24号、第2~25号、第2~26号、第2~27号、第3~23号、第3~24号、第3~25号、第3~26号、第3~27号、第4~28号、第4~29号、第4~30号、第4~31号、第4~32号、第5~28号、第5~29号、第5~30号、第5~31号、第5~32号、第6~28号、第6~29号、第6~30号、第6~31号、第6~32号、第7~28号、第7~29号、第7~30号、第7~31号、第7~32号、第8~28号、第8~29号、第8~30号、第8~31号或第8~32号的核苷酸构成的序列中的任一者互补的碱基序列构成。
3.一种反义寡聚物，其是能够使人抗肌萎缩蛋白基因的第50号外显子发生跳跃的反义寡聚物，其中，其是由与从人抗肌萎缩蛋白基因的第50号外显子的5’末端开始的第105~125号、第105~126号、第105~127号、第105~128号、第105~129号、第106~125号、第106~126号、第106~127号、第106~128号、第106~129号、第107~125号、第107~126号、第107~127号、第107~128号、第107~129号、第108~125号、第108~126号、第108~127号、第108~128号、第108~129号、第109~125号、第109~126号、第109~127号、第109~128号或第109~129号的核苷酸构成的序列中的任一者互补的碱基序列构成。
4.一种反义寡聚物，其是能够使人抗肌萎缩蛋白基因的第44号外显子发生跳跃的反义寡聚物，其中，其是由与从人抗肌萎缩蛋白基因的第44号外显子的5’末端开始的第9~30号、第9~31号、第9~32号、第9~33号、第9~34号、第10~30号、第10~31号、第10~32号、第10~33号、第10~34号、第11~30号、第11~31号、第11~32号、第11~33号、第11~34号、第12~30号、第12~31号、第12~32号、第12~33号、第12~34号、第13~30号、第13~31号、第13~32号、第13~33号、第13~34号、第24~45号、第24~46号、第24~47号、第24~48号、第24~49号、第25~45号、第25~46号、第25~47号、第25~48号、第25~49号、第26~45号、第26~46号、第26~47号、第26~48号、第26~49号、第27~45号、第27~46号、第27~47号、第27~48号、第27~49号、第28~45号、第28~46号、第28~47号、第28~48号、第28~49号、第29~45号、第29~46号、第29~47号、第29~48号或第29~49号的核苷酸构成的序列中的任一者互补的碱基序列构成。
5.如权利要求1所述的反义寡聚物，其中，其是由与从人抗肌萎缩蛋白基因的第55号外显子的5’末端开始的第I~21号、第11~31号或第14~34号的核苷酸构成的序列互补的碱基序列构成。
6.如权利要求1所述的反义寡聚物，其中，其是由序列号5的第170~190号、第160~180号或第157~177号的核苷酸构成的序列中的任一者的碱基序列构成。
7.如权利要求2所述的反义寡聚物，其中，其是由与从人抗肌萎缩蛋白基因的第45号外显子的5’末端开始的第-2~19号、第I~21号、第I~25号或第6~30号的核苷酸构成的序列互补的碱基序列构成。
8.如权利要求 2所述的反义寡聚物，其中，其是由序列号6的第158~178号、第156~176号、第152~176号或第147~171号的核苷酸构成的序列中的任一者的碱基序列构成。
9.如权利要求3所述的反义寡聚物，其中，其是由与从人抗肌萎缩蛋白基因的第50号外显子的5’末端开始的第106~126号或第107~127号的核苷酸构成的序列互补的碱基序列构成。
10.如权利要求3所述的反义寡聚物，其中，其是由序列号7的第4~24号或第3~23号的核苷酸构成的序列中的任一者的碱基序列构成。
11.如权利要求4所述的反义寡聚物，其中，其是由与从人抗肌萎缩蛋白基因的第44号外显子的5’末端开始的第11~32号、第25~45号、第26~46号、第26~47号或第27~47号的核苷酸构成的序列互补的碱基序列构成。
12.如权利要求4所述的反义寡聚物，其中，其是由序列号8的第117~138号、第104~124号、第103~123号、第102~123号或第102~122号的核苷酸构成的序列中的任一者的碱基序列构成。
13.如权利要求1~12中任一项所述的反义寡聚物，其中，其是寡核苷酸。
14.如权利要求13所述的反义寡聚物，其中，构成前述寡核苷酸的至少一个的核苷酸的糖部分和/或磷酸键部分被修饰。
15.如权利要求14所述的反义寡聚物，其中，构成前述寡核苷酸的至少一个的核苷酸的糖部分是 2’ 位的一OH 基被从由 0R、R、R，OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、f0.、及 I构成的组中选出的任一者的基团取代的核糖， 并且，上述R是表示烷基或者芳基，上述R’是表示亚烷基。
16.如权利要求14或15所述的反义寡聚物，其中，构成前述寡核苷酸的至少一个的核苷酸的磷酸键部分是从由硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、酰胺磷酸酯键、及硼烷磷酸酯键构成的组中选出的任一者。
17.如权利要求1~12中任一项所述的反义寡聚物，其中，其是吗啉寡聚物。
18.如权利要求17所述的反义寡聚物，其中，其是二酰胺磷酸酯吗啉寡聚物。
19.如权利要求17或18所述的反义寡聚物，其中，5’末端是下述化学式(I)~(3)中的任意的基团，
20.一种肌营养不良治疗用医药组合物，其中，其是以权利要求1~19中任一项所述的反义寡聚物、该反义寡聚物的药学上可允许的盐或水和物作为有效成分。
【文档编号】C12N15/113GK104024414SQ201280064590
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2012年12月27日 优先权日:2011年12月28日
【发明者】渡边直树, 濑尾春奈, 武田伸一, 永田哲也 申请人:日本新药株式会社, 国立精神·神经医疗研究中心