从新hcv株衍生的核酸和基因以及使用所述基因的复制子－复制细胞的制作方法

专利名称：从新hcv株衍生的核酸和基因以及使用所述基因的复制子－复制细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及从新的暴发性丙型肝炎病毒株衍生的核酸和基因、使用该基因的HCV复制子和复制子-复制细胞。
背景技术：
对于病毒研究和抗病毒药物的研究和开发，允许病毒有效扩增的实验体系绝对是必需的。另外，当具有通过使用培养细胞扩增病毒的体系或通过使用培养细胞评价病毒增殖的体系时，病毒研究和抗病毒药物的研究和开发显示出引人注目的进展。
丙型肝炎病毒(HCV)是属于黄病毒科、以单链(+)有义链RNA为基因组的病毒，并已知其导致丙型肝炎。近来的研究已揭示，可以根据基因型或血清型将丙型肝炎病毒分类为许多类型。根据Simmonds等人利用HCV株核苷酸序列所作的系统分析方法(该方法是目前HCV基因型分类的主流方法)，将HCV分成六个类型，即基因型1a、基因型1b、基因型2a、基因型2b、基因型3a和基因型3b，且这些类型的每一个进一步分为若干亚型(Simmonds，P.等人，Hepatorigy，(1994)10，第1321-1324页)。目前已经确定了许多HCV基因型的全长基因组核苷酸序列(Choo等人，Science，(1989)244，第359-362页；Kato等人，J.Med.Virol.，(1992)第334-339页；Okamoto，H等人，J.Gen.Virol.，(1992)73，第673-679页；Yoshioka等人，Hepatorogy，(1992)16，293-299)。
目前主要采用干扰素-α、干扰素-β和干扰素-α与嘌呤核苷衍生物三氮唑核苷(ribabirin)的组合治疗来治疗丙型肝炎。然而，即使是进行这些治疗后，在所有接受治疗的患者中也仅约60％观察到治疗效果，且停止治疗时，超过半数的有效果的患者疾病复发。已知干扰素的治疗效果与HCV基因型相关，并且据说其对基因型1b的效果低而对基因型2a的效果较高(Mori，S.等人，Biochem.Biophis.Res.Commun.，(1992)183，334-342)。
开发有效的丙型肝炎治疗药物或预防药物是巨大的挑战，其中丙型肝炎在工业国具有高发病率并最终导致严重结果，且目前对其尚无病因疗法。因此，迫切期待HCV特异性化学疗法或疫苗疗法的进展并开发抗HCV药物。作为开发抗HCV药物的目标，可设想抑制HCV复制或抑制HCV感染细胞。
由于直至最近难以在细胞培养体系中增殖HCV和用HCV感染培养的细胞，而且可以被HCV感染而且进行实验的动物仅限于黑猩猩，所以对于HCV复制机制和HCV感染机制的研究仍然困难。然而，近来已制得了衍生自HCV并具有自主复制能力的RNA这样的HCV亚基因组RNA复制子(JP专利公开(Kokai)No.2001-17187(2001)；Lomann等人，Science，(1999)285，110-113；Blight等人，Science，(2000)290，1972-1974；Friebe等人，(2001)75，12047-12057；Ikeda等人，J.Virol.，(2002)76(6)，2997-3006)，由此可以使用培养的细胞来分析HCV的复制机制。这些HCV亚基因组RNA复制子是这样的RNA复制子其中存在于HCV基因组RNA 5′非翻译区中HCV IRES下游的结构蛋白被新霉素抗性基因和连接在其下游的EMCV-IRES取代，其中所述HCV基因组RNA来自属于基因型1b、被称为Con 1的克隆。已经证实，通过将这些复制子RNA导入人肝癌Huh7细胞并在新霉素存在下进行培养，它们在Huh7细胞中自主复制。认为使用该RNA复制子系统的HCV复制评估体系将成为开发抗HCV药物的有力工具。
据报道，基因型不同的HCV中编码的病毒蛋白也不同，且可以想象，仅通过分析衍生自基因型1b HCV的亚基因组RNA复制子难以充分阐明HCV的复制机制。另外，因为干扰素的治疗效果依赖于HCV基因型，所以认为仅通过使用含有HCV基因型1b亚基因组RNA复制子的HCV复制体系开发对多种类型HCV发挥效果的抗HCV药物尤其困难。因此，认为应当通过制备许多基因型的HCV RNA复制子来进行关于HCV复制机制和抗HCV药物的研究。
目前，仅有若干克隆株系能够作为复制子在培养的细胞中复制。另外，从慢性肝炎克隆并经证实对黑猩猩有传染性的克隆并不必要能够作为复制子复制(Lomann等人，Science，(1999)285，110-113)。即，尚未发现可以以卓越的复制效率以及高概率产生HCV复制子的HCV株选择方法，而当建立起这样的HCV株选择方法时，HCV治疗药物的研究和开发有望得到巨大进展。
目前尚未对HCV开发出疫苗。对此的理由之一是不能以体内大量存在的形式稳定地产生能够作为疫苗的HCV相关蛋白。由于在上述HCV复制子细胞中表达HCV相关蛋白(JP专利公开(Kokai)No.2001-17187(2001))，所以预期可以使用该HCV复制子细胞。然而，有必要使用能够大量培养用于疫苗工业生产的细胞。从该角度看，目前建立的唯一的HCV RNA复制子-复制细胞Huh7细胞似乎不适于疫苗生产。对于适于疫苗生产的细胞，可以考虑能够在悬浮培养体系中以非常巨大的量培养的细胞，例如HeLa细胞。此外，由于HCV的序列依赖上述基因型而不同，所以需要为每个基因型生产疫苗。换言之，需要使用适于疫苗生产的细胞产生多个基因型的HCVRNA复制子细胞。另一方面，因为对HCV感染的易感性尚未得到证实，所以也认为Huh7细胞不适于建立使HCV能够自主感染并复制的细胞培养体系。由此，认为使用其它肝癌细胞建立使HCV自主感染并复制的细胞培养体系是必需的。
而且，可能通过比较HCV RNA复制子在多种细胞中复制机制的差异而鉴定对于HCV复制所必需的细胞因子，这有望导致发现抗HCV治疗药物的新靶。

发明内容
本发明目的是提供具有卓越的高概率复制效率的HCV复制子RNA以及能连续大量产生HCV蛋白的HCV复制子细胞。
作为旨在解决上述问题的勤奋研究的结果，通过发现可以使用从暴发性丙型肝炎患者HCV株JFH2.1或JFH2.2衍生的复制子获得具有卓越的高概率复制效率的复制子-复制细胞，本发明人完成了本发明。
即，本发明提供由多核苷酸(a)、(b)或(c)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示核苷酸序列的多核苷酸；(b)含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示核苷酸序列的多核苷酸；及(c)在严格条件下与由同上述(a)或(b)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码HCV蛋白的多核苷酸，
前提是，如果该核酸为DNA，那么序列表中的核苷酸符号“u”应当以“t”取代。
本发明也提供下列核酸(1)至(6)作为上述核酸的实例。
(1)由多核苷酸(a)或(b)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在严格条件下与由同上述(a)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码HCV蛋白中NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白的多核苷酸，(2)由多核苷酸(a)或(b)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO3所示核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在严格条件下与由同上述(a)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码HCV基因5′非翻译区的多核苷酸，(3)由多核苷酸(a)或(b)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO4所示核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在严格条件下与由同上述(a)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码HCV基因3′非翻译区的多核苷酸，(4)由多核苷酸(a)或(b)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在严格条件下与由同上述(a)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码HCV蛋白中NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白的多核苷酸，(5)由多核苷酸(a)或(b)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO5所示核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在严格条件下与由同上述(a)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码HCV基因5′非翻译区的多核苷酸，(6)由多核苷酸(a)或(b)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO6所示核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在严格条件下与由同上述(a)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码HCV基因3′非翻译区的多核苷酸，前提是，如果在上述(1)至(6)任一项中核酸为DNA，那么序列表中的核苷酸符号“u”应当以“t”取代。
本发明也提供由上述核酸组成的基因以及由该基因编码的多肽。
本发明也提供由RNA(a)或(b)组成的复制子RNA(a)含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示核苷酸序列的RNA(b)含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示核苷酸序列的RNA另外，复制子RNA可以另外含有IRES序列和选择标记基因或报告基因。
本发明也提供由RNA(a)或(b)组成的复制子RNA(a)含有SEQ ID NO7或SEQ ID NO8所示核苷酸序列的RNA(b)在严格条件下与由同上述(a)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的RNA杂交并具有自主复制能力的RNA本发明也提供通过将复制子RNA导入合适细胞而制备复制子-复制细胞的方法以及由该方法制备的复制子-复制细胞。用于复制子-复制细胞的细胞包括人肝衍生细胞、人子宫颈衍生细胞或人胚肾衍生细胞，更具体为Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞或293细胞。
本发明也提供筛选刺激或抑制丙型肝炎病毒复制的物质的方法，该方法包括在测试物质的存在下培养复制子-复制细胞，并在产生的培养物中检测复制子RNA的复制。
本发明也提供提高丙型肝炎病毒复制子RNA的复制效率的方法，该方法包括至少实施一次如下步骤，在所述步骤中从复制子-复制细胞获得复制的复制子RNA，且将得到的复制的复制子RNA导入其它细胞以制备新的复制子-复制细胞。在该方法中，期望复制效率为导入复制子-复制细胞中的复制子RNA的复制效率的至少两倍。
本发明也提供产生具有更高复制效率的丙型肝炎病毒复制子RNA的方法，该方法包括至少实施一次如下步骤，在所述步骤中从复制子-复制细胞获得复制的复制子RNA，且将得到的复制的复制子RNA导入不同于复制子-复制细胞的细胞以制备新的复制子-复制细胞，并从最终得到的复制子-复制细胞获得复制的复制子RNA。
另外，本发明也提供产生具有更高复制效率的丙型肝炎病毒复制子RNA的方法，该方法包括检测由上述方法产生的具有更高复制效率的复制子RNA与最初导入复制子-复制细胞中的复制子RNA之间的核苷酸或氨基酸突变，及将检测到的核苷酸或氨基酸突变引入旨在提高复制效率的复制子RNA中。
当使用本发明的新HCV RNA基因时，可以获得具有卓越的高概率复制效率的复制子RNA和复制子-复制细胞。可以将这些复制子-复制细胞用于培养体系以连续产生从HCV衍生的RNA和HCV蛋白。另外，也可以将这些复制子-复制细胞用于检测体系以筛选多种对HCV复制或HCV蛋白翻译发挥作用的物质。
附图简述

图1是显示质粒DNA pJFH-2.1和pJFH-2.2(上面行)和质粒DNA pSGREP-JFH2.1和pSGREP-JFH2.2(下面行)结构的图解；及图2是显示以rSGREP-JFH2.1或rSGREP-JFH2.2转染的细胞的集落形成的图像。
本说明书含有日本专利申请No.2003-329082说明书中描述的内容，本申请的优先权基于所述日本专利申请No.2003-329082。
实施本发明的最佳方式本发明详述如下。
1.本发明的从HCV衍生的核酸、基因和复制子RNA丙型肝炎病毒(HCV)基因组是由约9600个核苷酸组成的(+)链单链RNA。该基因组RNA含有5′非翻译区(也称为5′NTR或5′UTR)、由结构区和非结构区组成的翻译区和3′非翻译区(也称为3′NTR或3′UTR)。结构区中编码HCV结构蛋白，且非结构区中编码多个非结构蛋白。
HCV的这些结构蛋白(核心、E1和E2)和非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)以连续的多蛋白从翻译区翻译，然后经过蛋白酶有限蛋白酶解产生为游离形式。在这些结构蛋白和非结构蛋白(即HCV病毒蛋白)中，核心是核心蛋白，E1和E2是包膜蛋白，而非结构蛋白是参与病毒自身复制的蛋白。已知NS2具有金属蛋白酶活性，而NS3具有丝氨酸蛋白酶活性(N末端侧三分之一处)和解旋酶活性(C-末端侧三分之二处)。此外，NS4A是NS3蛋白酶活性的辅因子，且已报道NS5B具有依赖于RNA的RNA聚合酶活性。
本发明人使用HCV基因组构建了具有卓越的高概率复制效率、并且能够在细胞(例如Huh7细胞)中自主复制的RNA，其中HCV基因组并非基于HCV的常用基因型分类而是基于从暴发性肝炎患者分离HCV的准则进行选择的。
在本说明书中，将具有自主复制能力、并且通过改变天然HCV病毒基因组而构建的RNA称为“复制子RNA”或“RNA复制子”。
在本说明书中，“基因”指核酸中“负责参与生命活动的特异性功能或信息的核酸”，且包括RNA和DNA两者。另外，核酸或基因可以是单链的(cDNA、cRNA等)或双链的，且是天然存在或人工合成的。此外，其可以经过部分修改或可以是衍生物。尽管序列表中的核苷酸序列为了方便以RNA显示，但当涉及的基因是DNA时，核苷酸符号“U”应当由“T”取代。
在本发明中，“暴发性肝炎”指在症状发作后8周内表现出II期或更晚期脑病、且凝血酶原时间不高于40％的肝炎，并且分类为在10天内发展为脑病的急性形式和此后发展为脑病的亚急性形式。“来源于暴发性肝炎患者的丙型肝炎病毒”指从表现这种“暴发性肝炎”症状的患者分离的HCV。在本发明中，“来源于暴发性肝炎患者的丙型肝炎病毒”或“暴发性株HCV”不仅包括具有天然来源的HCV基因组RNA的病毒，而且包括具有其中向天然来源的HCV基因组序列添加人工修饰的基因组RNA的病毒。HCV暴发性株的特定实例包括病毒例如JFH-1株(JP专利公开(Kokai)No.2002-171978(2002))、JFH-2.1株和JFH-2.2株。
在本申请的说明书中，应当基于编码JFH-2.1和JFH-2.2株完整基因组区域的全长基因组RNA或含有其部分基因组RNA(JFH-2.1和JFH-2.2克隆)的核苷酸序列(分别为SEQ ID NOS1至6)的多核苷酸确定“5′非翻译区(5′NTR或5′UTR)”、“编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”、“编码核心蛋白的序列(核心区或C区)”、“编码E1蛋白的序列(E1区)”、“编码E2蛋白的序列(E2区)”、“编码N2蛋白的序列(NS2区)”、“编码NS3蛋白的序列(NS3区)”、“编码NS4A蛋白的序列(NS4A区)”、“编码NS4B蛋白的序列(NS4B区)”、“编码NS5A蛋白的序列(NS5A区)”、“编码NS5B蛋白的序列(NS5B区)”和“3′非翻译区(3′NTR或3′UTR)”、以及其它特定区域或位点，其中JFH-2.1和JFH-2.2株是来源于暴发性丙型肝炎患者的丙型肝炎病毒。
具体关于JFH-2.1克隆而言，当将特定HCV的RNA序列与SEQID NO1、3和4所示核苷酸序列进行比对时，由SEQ ID NO3所示的核苷酸序列是该RNA的“5′非翻译区”，由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列是“编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”，其中第1至1893位核苷酸序列是“编码NS3蛋白的序列”，第1894至2055位核苷酸序列是“编码NS4A蛋白的序列”，第2056至2838位核苷酸序列是“编码NS4B蛋白的序列”，第2839至4236位核苷酸序列是“编码NS5A蛋白的序列”，第4273至6012位核苷酸序列是“编码NS5B蛋白的序列”，且由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列是“3′非翻译区”。
关于JFH-2.2克隆，当将特定HCV的RNA序列与SEQ ID NO2、5和6所示核苷酸序列进行比对时，由SEQ ID NO5所示的核苷酸序列是该RNA的“5′非翻译区”，由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列是“编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”，其中第1至1893位核苷酸序列是“编码NS3蛋白的序列”，第1894至2055位核苷酸序列是“编码NS4A蛋白的序列”，第2056至2838位核苷酸序列是“编码NS4B蛋白的序列”，第2839至4236位核苷酸序列是“编码NS5A蛋白的序列”，第4273至6012位核苷酸序列是“编码NS5B蛋白的序列”，且由SEQ ID NO6所示的核苷酸序列是“3′非翻译区”。
关于根据本发明的基因，除了含有上述SEQ ID NOS1至6所示核苷酸序列的多核苷酸，在严格条件下与该基因杂交的多核苷酸也包含在本发明的基因中，只要这些多核苷酸编码上述所需蛋白。在此，严格条件是这样的条件在6X SSC(1X浓度的SSC溶液组合物由150mmol/l氯化钠和15mmol/l柠檬酸钠组成)存在下于60摄氏度进行杂交，并然后于68摄氏度用含有0.1％SDS的1X SSC洗涤。关于杂交方法，可以使用集落杂交方法、蚀斑杂交方法、DNA印迹杂交方法等，且可以根据例如Molecular Cloning，A laboratory manual，20001，编者Sambrook，J.和Russell，DW.Cold Spring HarborLaboratory Press中所述实施这些方法。
在本发明的核酸或基因中，其序列中可能存在缺口、添加、缺失、取代等，只要这些序列编码上述所需蛋白。具体而言，在SEQ IDNOS1至6所示核苷酸序列中，即使当这些核苷酸序列是由具有一个或多个核苷酸(即1至50、优选1至30、更优选1至10、更优选1至6、最优选一个至若干(2至5)个核苷酸)缺失、取代或添加的核苷酸序列组成的多核苷酸时，只要它们编码所需蛋白，换言之，只要含有SEQ ID NO1或2所示核苷酸序列的多核苷酸是编码HCV蛋白中NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白的多核苷酸，含有SEQID NO3或5所示核苷酸序列的多核苷酸是编码HCV基因5′非翻译区的多核苷酸，且含有SEQ ID NO4或6所示核苷酸序列的多核苷酸是编码HCV基因3′非翻译区的多核苷酸，那么那些多核苷酸就包含于本发明的核酸或基因中(有时以“含有核苷酸序列的核苷酸序列”表示“含有核苷酸序列的多核苷酸”)。
另外，上述“特定HCV”不限于JFH-2.1株和JFH-2.2株，但是包括其衍生物病毒株。
本发明HCV复制子RNA的一个实施方案是由核苷酸序列组成的复制子RNA，其中所述核苷酸序列至少含有存在于从暴发性肝炎来源的丙型肝炎病毒基因组RNA上的5′非翻译区，编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列和3′非翻译区。该复制子可以另外含有一个IRES序列，并且可以在其中另外含有一个选择标记基因或报告基因。此外，该复制子RNA可以含有编码除了NS3、NS4A、NS4B、NS5A或NS5B蛋白之外的病毒蛋白、存在于JFH2.1和JFH2.2之外的丙型肝炎病毒基因组RNA上的序列。
本发明HCV复制子RNA的另一示例性实施方案是包含多核苷酸的复制子RNA，所述多核苷酸含有具有SEQ ID NO3所示核苷酸序列的5′非翻译区，至少一个选择标记基因或报告基因，至少一个IRES序列，SEQ ID NO1所示HCV基因组RNA上编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列，和具有SEQ IDNO4所示核苷酸序列的3′非翻译区，或含有具有SEQ ID NO5所示核苷酸序列的5′非翻译区，至少一个选择标记基因和/或报告基因，至少一个IRES序列，SEQ ID NO2所示HCV基因组RNA上编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列，和具有SEQ ID NO6所示核苷酸序列的3′非翻译区。
本发明的复制子RNA优选在5′最远侧具有SEQ ID NO3或5所示HCV基因组RNA上的5′非翻译区并在3′最远侧具有SEQ IDNO4或6所示HCV基因组RNA上的3′非翻译区。选择标记基因或报告基因可以连接在IRES序列上游，可以连接在“编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”的上游或下游，或可以插入“编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”中。
本发明的复制子RNA更优选具有SEQ ID NO3或5所示HCV基因组RNA上的5′非翻译区，在5′非翻译区下游依次具有选择标记基因或报告基因、IRES序列和“编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”，并另外在3′最远侧具有源自暴发性肝炎患者的HCV基因组RNA上的3′非翻译区。
本发明HCV复制子RNA的另一示例性实施方案是由具有SEQID NO7或8所示核苷酸序列的RNA组成的复制子RNA。另外，也包括在严格条件下与SEQ ID NO7或8所示核苷酸序列组成的基因杂交的核酸。此外，在SEQ ID NO7或8所示核苷酸序列中，缺失、取代或添加一个或多个核苷酸(即1至50，优选1至30，更优选1至10，更优选1至6，最优选一个至若干(2至5)个核苷酸)的核苷酸序列、并具有自主复制能力的复制子RNA也作为示例性实施方案包含在本发明范围内。本发明中“具有自主复制能力”指在将该复制子RNA导入细胞时，该复制子RNA能够在细胞中复制其自身全长复制子RNA。尽管无意限制，但可以通过例如将复制子RNA转染进Huh7细胞、培养Huh7细胞、从所得培养物中的细胞提取RNA、使用能够特异性检测转染的复制子RNA的探针进行RNA印迹杂交、并检测该复制子RNA的存在而证实所述自主复制能力。可以根据本说明书实施例中所述的测量集落形成能力、确定HCV蛋白表达、检测复制子RNA等的描述来实施证实自主复制能力的特定程序。
本发明的复制子RNA可以包括包含期望在用所述复制子RNA转染的细胞内表达的任何外源基因的RNA。外源基因可以连接在5′非翻译区下游、或连接在选择标记基因或报告基因的上游或下游、或连接在“编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”的上游或下游、或可以插入“编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”中。当含有外源基因的复制子RNA在转染的细胞中翻译时，它能够表达由该外源基因编码的蛋白。因此，当在基因治疗等情况下以在细胞内产生特定基因产物为目标时，也可以期望使用含有外源基因的复制子RNA。
在本发明中，“选择标记基因”意指能够为细胞提供选择性的基因，由此仅选择出表达该基因的细胞。选择标记基因的一般实例包括抗生素抗性基因。在本发明中，优选的选择标记基因的实例包括新霉素抗性基因、胸苷激酶基因、卡那霉素抗性基因、吡啶硫胺素抗性基因、腺苷酰转移酶基因、Zeocin抗性基因和嘌呤霉素抗性基因等，其中优选新霉素抗性基因和胸苷激酶基因，且更优选新霉素抗性基因。应当指出本发明中选择标记基因不限于此。
此外在本发明中，“报告基因”意指编码作为该基因表达指示物的基因产物的标记基因。报告基因的一般实例包括，催化发光反应或呈色反应的酶的结构基因。本发明中优选的报告基因的实例包括源自转座子Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因、源自大肠杆菌(E.coli)的β葡糖醛酸糖苷酶或β半乳糖苷酶基因、萤光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、源自水母的水母发光蛋白基因和分泌型胎盘碱性磷酸酶(SEAP)基因等。应当指出本发明中报告基因不限于此。
复制子RNA中可以包含上述选择标记基因和报告基因中之一，或包含其二者。
在本发明中，“IRES序列”意指允许核糖体在RNA内部结合而引发翻译的内部核糖体结合位点。尽管不限于下列，但本发明中IRES序列的优选实例包括EMCV IRES(脑心肌炎病毒内部核糖体结合位点)、FMDV IRES、HCV IRES等，其中更优选EMCV IRES和HCVIRES，且最优选EMCV IRES。
本发明的复制子RNA可以另外包含核酶。插入核酶以使位于复制子RNA 5′侧的选择标记基因、报告基因或外源基因与IRES序列和位于前者3′侧的“编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”连接，从而因核酶的自切割活性通过切割使其二者分离。
在本发明的复制子RNA中，在正确的读框中将上述选择标记基因、报告基因、来源于暴发性肝炎患者的丙型肝炎病毒基因组RNA上编码病毒蛋白的序列、外源基因等连接，从而从复制子RNA翻译。在这些序列中，编码蛋白的序列也可以通过蛋白酶切割位点等彼此单独连接，从而各个蛋白在作为融合蛋白表达之后由蛋白酶分离，其中融合蛋白被融合为从源自暴发性肝炎患者的丙型肝炎病毒的“编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的序列”翻译而来的多蛋白。
2.制备本发明的复制子RNA可以使用本领域技术人员已知的任何基因工程技术制备本发明HCV复制子RNA。尽管无意加以限制，但可以通过例如下列方法制备HCV复制子RNA。
首先，通过常规方法将对应于NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白(SEQ ID NO1或2)和3′非翻译区(SEQID NO4或6)的RNA的DNA插入克隆载体中而制备DNA克隆。另一方面，将5′非翻译区(SEQ ID NO3或5)插入RNA启动子下游以制备DNA克隆。在此，“对应于RNA的DNA”意指由其中以T(胸腺嘧啶)取代RNA核苷酸序列中U(尿嘧啶)的核苷酸序列组成的DNA。所述RNA启动子优选为质粒克隆中所含的RNA启动子。尽管无意加以限制，但优选的RNA启动子包括T7RNA启动子、SP6RNA启动子和SP3RNA启动子，且尤其期望T7RNA启动子。
接着，对于构建的5′非翻译区DNA克隆，将选择标记基因或报告基因插入例如5′非翻译区下游，且将IRES序列插入其下游。另外，将具有SEQ ID NO1或2所示核苷酸序列的DNA和具有SEQ IDNO4或6所示核苷酸序列的DNA以此顺序连接到IRES序列下游。
然后，使用上述构建的DNA克隆为模板，通过RNA聚合酶合成RNA。可以根据标准方法从5′非翻译区和IRES序列引发RNA合成。当模板DNA是质粒克隆时，则用限制酶将上述连接在RNA启动子下游的DNA区从质粒克隆切除，且也可以使用该DNA片段为模板合成RNA。此外，合成的RNA的3′末端期望与病毒基因组RNA的3′非翻译区一致，且期望未添加或缺失其它序列。由此合成的RNA即为本发明的复制子RNA。
3.制备用本发明HCV复制子RNA转染的复制子-复制细胞可以通过将如上所述制得的复制子RNA导入允许复制子RNA复制的细胞而获得连续复制复制子RNA的细胞。在本说明书中，将连续扩增复制子RNA的细胞称作“复制子-复制细胞”。
尽管可以使用任何细胞作为用复制子RNA转染的细胞，只要所述细胞可以传代培养，所述细胞优选为真核细胞，更优选为人肝衍生的细胞、人子宫颈衍生的细胞或人胚肾衍生的细胞，以及更优选Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞或293细胞。对于这些细胞，可以使用可商购或从细胞库获得的细胞，或者可以使用从任何细胞(例如，癌细胞或干细胞)建立的细胞系。
对于上述细胞，当旨在疫苗生产情况下大量生产HCV蛋白时，期望使用可以大量培养的细胞。由此角度看，期望除Huh7以外的细胞。
可以用本领域技术人员已知的任何技术将复制子RNA导入细胞。这些导入技术包括例如电穿孔、基因枪法、脂质转染法、磷酸钙法、微注射法、DEAE琼脂糖凝胶法等，并尤其优选电穿孔法。
关于复制子RNA，可以将靶复制子RNA单独或在与其它核酸的混合物中导入细胞中。当需要改变复制子RNA的量而保持导入的RNA量恒定时，可以将靶复制子RNA与从待转染细胞提取的总细胞RNA的混合物用于转染细胞。用于导入细胞的复制子RNA的量可以依赖所使用的导入方法而确定，且优选使用1皮克至100微克范围内、更优选10皮克至10微克范围内的量。
当使用包含选择标记基因或报告基因的复制子RNA导入细胞时，可以利用选择标记基因或报告基因的表达来选择用复制子RNA转染并且连续复制该复制子RNA的细胞。具体而言，例如，可以在能够通过选择标记基因或报告基因的表达而进行选择的培养基中培养这些用复制子RNA处理以导入细胞内的细胞。
作为实例，当复制子RNA中含有新霉素抗性基因作为选择标记基因时，将用复制子RNA处理以导入细胞内的细胞接种在培养皿中，培养16至24小时，然后向培养皿中添加浓度为0.05毫克/毫升至3.0毫克/毫升的G418(新霉素)。此后，继续培养，同时每周更换两次培养液。从接种时间起培养优选10天至40天、更优选14天至28天后，通过用结晶紫将存活细胞染色，可以选择用复制子RNA转染并且连续复制复制子RNA的细胞作为集落。
可以通过常规方法从形成的集落克隆细胞。在本说明书中将由此获得的、连续复制靶复制子RNA的细胞克隆称作“复制子-复制细胞克隆”。
关于所建立的细胞克隆，需要通过检测在细胞克隆中从转染的复制子RNA复制的复制子RNA、确定转染的复制子RNA中选择标记基因或报告基因向宿主基因组DNA中整合的存在或不存在、并证实HCV蛋白的表达，以证实靶复制子RNA确实被连续复制。
可以通过本领域技术人员已知的任何RNA检测方法检测细胞克隆中从转染的复制子RNA复制的复制子RNA(在本说明书下文中方便地称作“复制的复制子RNA”)，且例如，可以使用对转染的复制子RNA特异的DNA片段为探针，对提取自细胞克隆的总RNA实施RNA印迹杂交法来检测复制子RNA。
尽管无意加以限制，但可以通过如下方法确定转染的复制子RNA中选择标记基因或报告基因向宿主基因组DNA中的整合，例如，对提取自细胞克隆的宿主基因组DNA进行PCR以扩增至少一部分选择标记基因或报告基因、并确定扩增产物的存在或不存在。尽管认为其中检测到扩增产物的细胞克隆已经在宿主基因组中导入了选择标记基因或报告基因，但存在复制子RNA本身可能没有在细胞内连续复制的可能性。在这种情况下，可以通过如下所示证实HCV蛋白表达的实验确定是否连续复制复制子RNA。
可以通过如下方法证实HCV蛋白的表达，例如，使针对应当从转染的复制子RNA表达的HCV蛋白的抗体与提取自细胞克隆的蛋白反应。可以通过本领域技术人员已知的任何蛋白检测方法实施该方法，且具体而言，可以通过例如将提取自细胞克隆的蛋白样品印迹到硝化纤维素膜上，使抗HCV蛋白抗体(例如，抗NS3特异性抗体或收集自丙型肝炎患者的抗血清)与该蛋白样品反应，并进一步检测抗HCV蛋白抗体而实施。当在提取自细胞克隆的蛋白中检测到HCV蛋白时，则可以认为该细胞克隆通过连续复制衍生自HCV的复制子RNA而表达HCV蛋白。
如上所述，可以获得经过证实连续复制靶复制子RNA的细胞克隆(复制子-复制细胞克隆)。此外，在本发明中，可以通过本领域技术人员已知的任何一种方法从所述复制子-复制细胞获得复制子RNA，例如，通过提取RNA并通过电泳等从RNA提取物中分离复制子RNA。本发明还提供了产生复制子RNA的方法。此外，本发明的复制子-复制细胞可期望用于产生HCV蛋白。本领域技术任何人员可以根据常规方法从复制子-复制细胞产生HCV蛋白。具体而言，例如，培养复制子-复制细胞、使用常规方法从所得培养物(包括培养的细胞和培养基)获得蛋白。
此外，当本发明的复制子-复制细胞连续复制含有外源基因的复制子RNA时，可以通过使用复制子-复制细胞表达蛋白而获得外源基因编码的蛋白。具体而言，例如，培养复制子-复制细胞、通过常规方法从所得培养物(包括培养的细胞和培养基)提取蛋白，且另外，可以通过使用针对靶蛋白的抗体等检测从提取的蛋白中选择性获得的由外源基因编码的蛋白。
4.向本发明的HCV复制子RNA中导入提高复制效率的突变在本发明复制子-复制细胞中通过复制产生的复制子RNA(复制的复制子RNA)中相当频繁地发生提高复制效率的突变。这样的突变可能是适应性突变。
利用这一事实，在本发明中，可以将提高复制效率的突变以高频率导入本发明的复制子RNA中。
具体而言，至少一次、优选1至10次、更优选1至5次、以及更优选1至2次重复实施如下方法，在所述方法中通过提取等从第一复制子-复制细胞(优选用本发明复制子RNA转染的复制子-复制细胞)获得第一复制的复制子RNA、之后将第一复制的复制子RNA另外再次导入不同细胞中以制备第二复制子-复制细胞，由此可以将提高复制效率的突变以高频率导入复制子RNA中。
尽管可以使用任何细胞作为用复制的复制子RNA再转染的细胞，但细胞优选为源自与用复制子RNA最初转染的细胞相同的生物物种的细胞，更优选源自与用复制子RNA最初转染的细胞相同的生物物种的相同组织的细胞，且更优选与用复制子RNA最初转染的细胞的相同细胞系的细胞。
因此在本发明中，可以使用上述方法产生其中导入了提高复制效率的突变的复制子RNA。即，至少一次、优选1至10次、更优选1至5次、以及更优选1至2次重复实施如下方法，在所述方法中通过提取等从第一复制子-复制细胞(优选用本发明复制子RNA转染的复制子-复制细胞)获得第一复制的复制子RNA、之后将第一复制的复制子RNA另外再次导入不同细胞中以制备第二复制子-复制细胞，且随后，通过提取等从重复方法结束时获得的最终复制子-复制细胞中获得复制的复制子RNA，由此产生提高复制效率的复制子RNA。
本发明中，通过上述方法，复制子RNA的复制效率可以提高至少2倍，优选10至100倍，且更优选100至10000倍。
关于通过这类方法产生的具有提高的复制效率的复制子RNA，期望使用已知方法确定复制子RNA的核苷酸序列，在所述方法中通过用反转录PCR获得cDNA，然后将其进行核苷酸序列确定等。此外，通过将确定的核苷酸序列或由该核苷酸序列编码的氨基酸序列与最初导入细胞中的复制子RNA的核苷酸序列比较，可以鉴定适应性突变。对于提高复制效率的适应性突变，尤其期望导致由复制子RNA编码的病毒蛋白中氨基酸突变的非同义取代。
本发明还提供一种方法，在该方法中，通过常规方法将如上鉴定的适应性突变导入复制子RNA，产生复制效率提高的丙型肝炎病毒复制子RNA。
如上所述产生的具有更高复制效率的复制子RNA可用于产生大量复制子RNA。
可以根据本领域技术人员已知的方法确定本发明的复制子RNA的复制效率，例如通过以下方法。
例如，分别用0.0001、0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3和1.0微克的复制子RNA转染Huh7细胞，并以类似于上述试验程序的方式用G418选择培养21天，然后测量集落形成数(集落数)。通过比较导入的RNA的量与集落形成数，确定导入的复制子RNA量的范围，在此范围内，集落形成呈剂量依赖性增加，并将该范围内的集落形成数除以导入的RNA量得到的值定义为每微克的集落形成率。该计算方程式如下所示。集落形成率[(集落形成单位；CFU)/微克]＝集落形成数[片]/导入的RNA量[微克]。
将由此计算出的集落形成率定义为表示转染的复制子RNA的复制效率的值。即，集落形成率越高，复制子RNA的复制效率越高。
此外，可以通过集落形成能力表示复制子RNA的复制效率，其中集落形成能力由每个形成的集落所转染的复制子RNA的拷贝数显示。即，可以根据以下计算方程式计算集落形成能力。集落形成能力＝转染的复制子RNA拷贝数[拷贝]/集落形成数[片]。
5.本发明的其它实施方案本发明的复制子RNA-复制细胞还可用作，例如，筛选刺激或抑制丙型肝炎病毒复制的物质的测试系统。具体而言，例如，在测试物质存在下培养复制子复制细胞，检测所得培养物中复制子RNA的复制，并考虑测试物质是否刺激或抑制复制子RNA的复制，由此可能筛选出刺激或抑制丙型肝炎病毒复制的物质。在这种情况下，可通过如下方法检测所得培养物中复制子RNA的复制在提取自复制子RNA-复制细胞的RNA中检测复制子RNA的量或存在或不存在复制子RNA、或在培养物或存在于培养物中的复制子RNA-复制细胞中的蛋白中检测所含HCV蛋白的量或存在或不存在HCV蛋白。
这样的测试系统可用于生产或评估丙型肝炎病毒感染的治疗剂或诊断剂。具体而言，可以列举以下实例。
(1)筛选抑制HCV增殖的物质抑制HCV增殖的物质包括例如对HCV增殖直接或间接发挥作用的有机化合物、或通过与HCV基因组中的靶序列或其互补链杂交而对HCV增殖或HCV蛋白翻译直接或间接发挥作用的反义寡核苷酸等。
(2)评价在细胞培养物中具有抗病毒作用的多种物质多种物质包括从使用合理药物设计或高通量筛选等获得的物质(例如分离和纯化的酶)等。
(3)鉴定治疗HCV感染患者的新攻击靶本发明的复制子-复制细胞可以用于鉴定例如在HCV病毒增殖中发挥重要作用的宿主细胞蛋白。
(4)评价HCV病毒获得对药物等抗性的潜能并鉴定涉及该抗性的突变
(5)产生可作为抗原用于开发、生产和评估丙型肝炎病毒感染的诊断剂或治疗剂的病毒蛋白根据以下实施例和附图，对本发明进行更具体的解释。
复制子RNA的复制1.构建表达载体从含有病毒株全长基因组cDNA的JFH-2.1和JFH-2.2克隆获得对应于从暴发性肝炎患者分离的丙型肝炎病毒JFH-2.1株和JFH-2.2株病毒基因组完整区域的DNA，并将T7RNA启动子序列的合成DNA附着到各克隆的5′末端，然后插入质粒(pUC19质粒)中。在下文中将由此构建的质粒DNA分别称为pJFH-2.1和pJFH-2.2。应当指出上述JFH-2.1和JFH-2.2克隆是根据公开的报道(Lehmann等人，Science，(1999))制备的。
由此构建的质粒DNA pJFH-2.1和pJFH-2.2的结构显示于图1上面行。“T7”表示T7RNA启动子，而“G”表示插入到pJFH-2.1和pJFH-2.2 5′末端上游和T7RNA启动子序列3′末端下游的dGTP。“5′NTR”至“3′NTR”范围代表对应于丙型肝炎病毒完整基因组区域的DNA。
接下来，用新霉素抗性基因(neo；也称作新霉素磷酸转移酶基因)和EMCV-IRES(脑心肌炎病毒内部核糖体结合位点)取代质粒DNA pJFH-2.1和pJFH-2.2的部分结构区和非结构区，以分别构建出质粒DNA pSGREP-JFH2.1和pSGREP-JFH2.2(图1下面行)。根据已公开的报道(Lohmann等人，Science，(1999))实施该构建程序。具体而言，用限制酶Age I和Cla I切割质粒pJFH2.1和pJFH2.2；通过PCR扩增将源自pJFH2.1和pJFH2.2每一个的5′NTR至核心区延伸的序列和源自表达载体pRSV5NEO的新霉素抗性基因连接到切割位点；通过PCR扩增将由限制酶Agl I和Pme I切割的片段与EMCV IRES向NS3区延伸的序列连接；并插入和连接由限制酶Pme I和Cla I切割的片段。
2.制备复制子RNA为制备用于合成复制子RNA的模板DNA，用限制酶Xba I分别切割如上所述构建的表达载体pSGREP-JFH2.1和pSGREP-JFH2.2。然后，将10至20μg这些Xba I切割片段分别于30摄氏度与20U绿豆核酸酶温育30分钟(反应溶液总体积50μl)用于进一步处理。绿豆核酸酶是催化双链DNA中的单链部分选择性降解的酶。一般，当使用Xba I切割的片段为模板合成RNA时，会合成在3’末端另外附加CUGA四个核苷酸的复制子RNA，其中CUGA四个核苷酸是Xba I识别序列的一部分。因此，在本实施例中，通过用绿豆核酸酶处理Xba I切割的片段，从Xba I切割的片段中去除CUGA四个核苷酸。然后，在用绿豆核酸酶处理后，根据常规方法通过蛋白去除处理从含有Xba I切割的片段的溶液纯化已经除去CUGA四个核苷酸的Xba I切割的片段，并将该纯化的片段用作模板DNA。
接着，由此模板DNA体外合成RNA。对于RNA合成，使用可从Ambion，Inc.获得的MEGA script。于37摄氏度在20μl含有0.5至1.0微克模板DNA的反应溶液中反应3小时至16小时。
合成RNA之后，向反应溶液中加入DNA酶(2U)，并于37摄氏度反应15分钟，然后用酸性苯酚提取RNA以去除模板DNA。将由此从上述源自pSGREP-JFH2.1和pSGREP-JFH2.2的模板DNA合成的RNA(复制子RNA)分别命名为rSGREP-JFH2.1和rSGREP-JFH2.2。这些复制子RNA的核苷酸序列，rSGREP-JFH2.1示于SEQ ID NO7和图1，rSGREP-JFH2.2示于SEQ ID NO8和图1。
建立复制子-复制细胞克隆对于实施例1中制备的各个合成的复制子RNA rSGREP-JFH2.1和rSGREP-JFH2.2，将0.01ng至10μg的复制子RNA与提取自Huh7细胞的总细胞RNA混合，以调整总RNA的量为10μg。然后通过电穿孔将混合RNA导入Huh7细胞。将经过电穿孔处理的Huh7细胞接种于培养皿中，并培养16小时至24小时，随后向皿中添加各种浓度的G418(新霉素)。其后继续培养同时每周更换两次培养基。从接种时间培养21天后，用结晶紫对存活细胞染色。结果如图2所示证实集落形成。
对用rSGREP-JFH2.1和rSGREP-JFH2.2转染、并显示集落形成的细胞，培养21天后从培养皿进一步克隆存活细胞集落并继续培养。通过所述集落的克隆，可以确立多个克隆的细胞系。
本说明书中引用的所有印刷出版物、专利和专利申请都在本说明书中引用作为参考。
工业适用性可以通过使用本发明HCV株JFH2.1或JFH2.2衍生的基因产生具有卓越的高概率复制效率的HCV复制子RNA，其中HCV株源自暴发性丙型肝炎患者。用该复制子RNA转染的复制子-复制细胞可以用作培养体系以连续产生HCV衍生的RNA和HCV蛋白。另外，复制子-复制细胞可以用作测试系统以筛选多种对HCV复制和/或HCV蛋白翻译发挥作用的物质。
无文本序列表SEQ ID NO7人工序列描述JFH2.1复制子RNASEQ ID NO8人工序列描述JFH2.2复制子RNA
序列表<110>Tokyo Metropolitan Organization for Medical ResearchToray Industries INC.
<120>从新HCV株衍生的核酸和基因以及使用所述基因的复制子-复制细胞<130>PH-2254-PCT<140>
<141>
<150>JP 2003-329082<151>2003-09-19<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>6264<212>RNA<213>丙型肝炎病毒<220>
<223>发明人Wakita，Takaji发明人Kato，Takanobu发明人Date，Tomoko<400>1accauggcgc cuaucacugc uuaugcccag cagacacgag gccuauuggg cgccauagug 60gugagcauga cgggccguga caagacagaa caggccgggg agauccaggu ccucuccaca 120gucacucaaa ccuuccucgg gacuaccauc ucaggagucu uguggaccgu cuaccacggg 180gcuggcaaca agacccuagc cggcucgcgg ggcccgguca cacagaugua cuccagcgcc 240gagggagacu ugguagggug gcccaguccu cccgggacua aauccaugga gccgugcacg 300ugcggagcgg ucgaccugua ccuggucacg cggaacgcug acgucauccc ggcucggaga 360cgcggggaca agcggggagc guugcucucc ccgagaccuc ucucaacucu gaaggggucu 420ucggggggac cggugcucug ccccaggggc cacguugucg ggaucuuccg ggcagccaua 480ugcucgcggg gcguggccaa guccauagau uucauccccg uugaggcaau ugacaucguc 540acgcgcuccc ccaccuuuac ugacaacagc acgccaccgg cugugcccca gaccuaucag 600guuggauacu ugcacgcccc gacuggcagc gggaagagca ccaaaguccc ugucgcauau 660gccgcccagg gguauaaggu gcuagugcuc aaucccucgg uggccgccac cuugggguuu 720ggggcguacu uggccaaggc gcacggcauc aauccuaaca uuaggacugg agucaggacu 780
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<223>人工序列描述JFH2.1复制子RNA
<400>7acccgccccu aauaggggcg acacuccgcc augaaucacu ccccugugag gaacuacugu 60cuucacgcag aaagcgucua gccauggcgu uaguaugagu gucguacagc cuccaggccc 120cccccucccg ggagagccau aguggucugc ggaaccggug aguacaccgg aauugccggg 180aagacugggu ccuuucuugg auaaacccac ucuaugcccg gccauuuggg cgugcccccg 240caagacugcu agccgaguag cguuggguug cgaaaggccu ugugguacug ccugauaggg 300ugcuugcgag ugccccggga ggucucguag accgugcauc augagcacaa aucccaaacc 360ucaaagaaaa accaacagaa acaccaaccg ucgcccaaug auugaacaag auggauugca 420cgcagguucu ccggccgcuu ggguggagag gcuauucggc uaugacuggg cacaacagac 480aaucggcugc ucugaugccg ccguguuccg gcugucagcg caggggcgcc cgguucuuuu 540ugucaagacc gaccuguccg gugcccugaa ugaacugcag gacgaggcag cgcggcuauc 600guggcuggcc acgacgggcg uuccuugcgc agcugugcuc gacguuguca cugaagcggg 660aagggacugg cugcuauugg gcgaagugcc ggggcaggau cuccugucau cucaccuugc 720uccugccgag aaaguaucca ucauggcuga ugcaaugcgg cggcugcaua cgcuugaucc 780ggcuaccugc ccauucgacc accaagcgaa acaucgcauc gagcgagcac guacucggau 840ggaagccggu cuugucgauc aggaugaucu ggacgaagag caucaggggc ucgcgccagc 900cgaacuguuc gccaggcuca aggcgcgcau gcccgacggc gaggaucucg ucgugaccca 960uggcgaugcc ugcuugccga auaucauggu ggaaaauggc cgcuuuucug gauucaucga 1020cuguggccgg cugggugugg cggaccgcua ucaggacaua gcguuggcua cccgugauau 1080ugcugaagag cuuggcggcg aaugggcuga ccgcuuccuc gugcuuuacg guaucgccgc 1140ucccgauucg cagcgcaucg ccuucuaucg ccuucuugac gaguucuucu gaguuuaaac 1200ccucucccuc cccccccccu aacguuacug gccgaagccg cuuggaauaa ggccggugug 1260cguuugucua uauguuauuu uccaccauau ugccgucuuu uggcaaugug agggcccgga 1320aaccuggccc ugucuucuug acgagcauuc cuaggggucu uuccccucuc gccaaaggaa 1380ugcaaggucu guugaauguc gugaaggaag caguuccucu ggaagcuucu ugaagacaaa 1440caacgucugu agcgacccuu ugcaggcagc ggaacccccc accuggcgac aggugccucu 1500gcggccaaaa gccacgugua uaagauacac cugcaaaggc ggcacaaccc cagugccacg 1560uugugaguug gauaguugug gaaagaguca aauggcucuc cucaagcgua uucaacaagg 1620ggcugaagga ugcccagaag guaccccauu guaugggauc ugaucugggg ccucggugca 1680caugcuuuac auguguuuag ucgagguuaa aaaaacgucu aggccccccg aaccacgggg 1740acgugguuuu ccuuugaaaa acacgaugau accauggcgc cuaucacugc uuaugcccag 1800cagacacgag gccuauuggg cgccauagug gugagcauga cgggccguga caagacagaa 1860caggccgggg agauccaggu ccucuccaca gucacucaaa ccuuccucgg gacuaccauc 1920ucaggagucu uguggaccgu cuaccacggg gcuggcaaca agacccuagc cggcucgcgg 1980ggcccgguca cacagaugua cuccagcgcc gagggagacu ugguagggug gcccaguccu 2040cccgggacua aauccaugga gccgugcacg ugcggagcgg ucgaccugua ccuggucacg 2100cggaacgcug acgucauccc ggcucggaga cgcggggaca agcggggagc guugcucucc 2160ccgagaccuc ucucaacucu gaaggggucu ucggggggac cggugcucug ccccaggggc 2220cacguugucg ggaucuuccg ggcagccaua ugcucgcggg gcguggccaa guccauagau 2280uucauccccg uugaggcaau ugacaucguc acgcgcuccc ccaccuuuac ugacaacagc 2340acgccaccgg cugugcccca gaccuaucag guuggauacu ugcacgcccc gacuggcagc 2400gggaagagca ccaaaguccc ugucgcauau gccgcccagg gguauaaggu gcuagugcuc 2460aaucccucgg uggccgccac cuugggguuu ggggcguacu uggccaaggc gcacggcauc 2520
aauccuaaca uuaggacugg agucaggacu gugacgaccg gggaggcuau uacguauucc 2580acguauggca aguuucucgc ugaugggggc ugcgcaggcg gcgccuauga caucaucaua 2640ugcgaugagu gccaugccac ggaugcuacc acccuucucg gcaucggaac aguucuugac 2700caagcagagu cagcuggggu caggcuaacu gugcuggcca cggcuacgcc ucccggauca 2760auaacaaccc cucaccccaa cauagaggag guagcucucg gacaggaggg ugagaucccc 2820uucuauggga gagcgauccc ccuggcccac aucaagggag ggaggcaccu gaucuucugc 2880cacucgaaga aaaaguguga cgagcucgcg gcggcccucc gggccauggg cuugaacgcu 2940guggcauacu acagaggguu ggacgucucc auaauaccag cucaaggaga cguggugguu 3000gucgccacug acgcccucau gacaggguac acuggagacu uugacuccgu gauugacugc 3060aacguagcgg uuacucaagu cguggacuuc agcuuggacc ccaccuucac cauauccaca 3120caaaccgucc cccaagacgc cgucucacgc agccagcgcc gggggcgcac gggcagaggg 3180agacugggca uuuacaggua cguuuccacu ggugagcgag cuucgggaau guuugacagc 3240guaacgcucu gcgagugcua cgaugcaggg gcugcauggu augaucucac accagcggaa 3300accaccguca ggcuuagggc guauuucaac acgcccggcc ugcccgugug ccaagaccac 3360cucgaguuuu gggaggcagu uuucaccggc cucacacaca uagaugccca cuaccuuucc 3420caaacaaagc aagcggggga gaauuucgca uaccugacag ccuaucaggc cacagugugu 3480gccagagcca aagccccucc cccgucuugg gacgucaugu ggaagugccu gacucgacuc 3540aaacccacgc ucgugggccc cacaccucuc cuguaccgcc uggguucagu uaccaacgau 3600gucaccuuca cacacccugu gacaaaguac aucgcuacuu gcaugcaagc ugaccucgag 3660gucaugacca gcacgugggu ccuagccggg ggaguccugg cugccaucgc cgcguacugc 3720uuggcgacug gguguguuuc caucaucggc cguuugcacg ucaaccagcg aaccgucguu 3780gcaccugaca aggagguccu cuaugaggcu uuugacgaga uggaggagug ugcuuccaga 3840gcggcccuca uugaggaggc gcaacggaua gccgagaugc ugaagucuaa gauccaaggc 3900uuauugcagc aggcuuccaa gcaggcccag gacauacaac caaccgugca ggcuucaugg 3960cccaaggugg agcaauucug ggccaaacac auguggaacu ucauuagcgg cauccaauau 4020cuugcgggac ugucaacgcu gccagggaac cccgcugugg ccucuaugau ggcauucagu 4080gccgccauca ccaguccgcu gucgacuagc accaccaucc uucucaacau caugggaggc 4140uggcuggcgu cucaaauugc gccacccgca ggggccacag gcuucguggu caguggccug 4200gugggggcug ccauaggcag cguaggcuug gguaaggugc ugguggacau cuuggcaggg 4260uacggugcgg gcauuucggg ggcucucguc gcauucaaga ucaugucugg cgagaagccc 4320uccauggagg augucaucaa ccugcugccc ggaauccugu ccccgggcgc ccugguggug 4380ggggucauuu gcgcggccau ucugcgccgu caugugggac cgggggaagg ugcgguccaa 4440uggaugaaua ggcuuauugc cuuugcuucc agaggaaacc acgucgcccc cacccacuau 4500gugacggagu cagaugcguc gcagcgcgug acccaacuac uuggcucucu caccauaacu 4560agccugcuua gaaggcucca caauuggauu acugaggacu gccccacccc augcaauggc 4620ucauggcucc gcgaugugug ggacugggug ugcaccaucc ugacugacuu uaaaaacugg 4680cugaccucca aguuguuccc aaagcugccc ggccuccccu ucaucucuug ccaaaagggg 4740uauaggggcg acugggccgg cacgggcauc auggucacgc ggugcccuug uggcgccaac 4800auuucuggca auguccgcuu cggcucuaug agaaucacag ggccuaagac cugcaugaac 4860accuggcagg ggacuuuccc uaucaacugc uacacggagg gccaaugcau gccgagaccu 4920gcgccaaacu uuaagaccgc caucuggagg guggcggccu cagaguacgc ggaggugacg 4980cggcacgggu cguacucuua cauaacaggg cugaccgcug acaaucugaa gguucccugc 5040caaauaccau cuccagaguu cuuuuccugg guagacggag uacagaucca cagguuugcu 5100cccacuccaa agccguucuu ucgggaugag gucucguuca gcguggggcu caacucauuu 5160
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<223>人工序列描述JFH2.2复制子RNA<400>8acccgcccca aaggggcgac acccgccaga acacccccgg aggaacacgc cacgcagaaa 60gcgcagccag gcgagagagg cgacagcccc aggccccccc ccccgggaga gccaagggcg 120cggaaccggg agacaccgga agccgggaag acgggcccgg aaaacccacc agcccggcca 180gggcggcccc cgcaagacgc agccgagagc gggggcgaaa ggccgggacg ccgaaggggc 240gcgaggcccc gggaggccga gaccggcaca gagcacaaac ccaaacccaa agaaaaacca 300acagaaacac caaccgcgcc caagagaaca agaggagcac gcaggcccgg ccgcggggga 360gaggcacggc agacgggcac aacagacaac ggcgccgagc cgccggccgg cgcagcgcag 420gggcgcccgg cgcaagaccg accgccgggc ccgaagaacg caggacgagg cagcgcggca 480cgggcggcca cgacgggcgc cgcgcagcgg ccgacggcac gaagcgggaa gggacggcgc 540agggcgaagg ccggggcagg acccgcacca ccgcccgccg agaaagacca caggcgagca 600agcggcggcg caacgcgacc ggcaccgccc acgaccacca agcgaaacac gcacgagcga 660gcacgaccgg aggaagccgg cgcgacagga gacggacgaa gagcacaggg gccgcgccag 720ccgaacgcgc caggccaagg cgcgcagccc gacggcgagg accgcggacc caggcgagcc 780gcgccgaaac aggggaaaag gccgccggac acgacgggcc ggcggggggc ggaccgcaca 840ggacaagcgg gcacccggaa gcgaagagcg gcggcgaagg gcgaccgccc cggcacggac 900gccgccccga cgcagcgcac gcccacgccc gacgagccga gaaacccccc cccccccccc 960caacgacggc cgaagccgcg gaaaaggccg gggcggcaag accaccaagc cgcggcaagg 1020agggcccgga aaccggcccg ccgacgagca ccaggggccc ccccgccaaa ggaagcaagg 1080cggaagcgga aggaagcagc ccggaagccg aagacaaaca acgcgagcga cccgcaggca 1140gcggaacccc ccaccggcga cagggcccgc ggccaaaagc cacggaaaga acaccgcaaa 1200ggcggcacaa ccccaggcca cgggagggaa ggggaaagag caaaggcccc caagcgacaa 1260caaggggcga aggagcccag aaggacccca gagggacgac ggggcccggg cacagcacag 1320gagcgaggaa aaaaacgcag gccccccgaa ccacggggac gggccgaaaa acacgagaac 1380aggcgccaca cgcagcccag cagacacgag gccagggcgc caaggggagc agacgggccg 1440gacaagacag aacaggccgg ggagaccagg cccccacagc accaaacccc cgggacacca 1500ccaggagcgg gaccgcacca cggggcggca acaagaccca gccggccgcg gggcccggca 1560cacagagacc cagcgccgag ggagacggag ggggcccagc ccccgggaca aaccaggagc 1620cggcacggcg gagcggcgac cgaccggcac gcggaacgcg acgcacccgg ccggagacgc 1680ggggacaagc ggggagcggc cccccgagac ccccgaccga aggggcccag ggggaccggg 1740
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1.由多核苷酸(a)、(b)或(c)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示核苷酸序列的多核苷酸；(b)含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示核苷酸序列的多核苷酸；及(c)在严格条件下与由同所述(a)或(b)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码HCV蛋白的多核苷酸，前提是，如果该核酸为DNA，那么序列表中的核苷酸符号“u”应当以“t”取代。
2.由以下多核苷酸(a)或(b)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO1所代表核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在严格条件下与由同所述(a)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码HCV蛋白中NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白的多核苷酸，前提是，如果该核酸为DNA，那么序列表中的核苷酸符号“u”应当以“t”取代。
3.由多核苷酸(a)或(b)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO3所代表核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在严格条件下与由同所述(a)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码HCV基因5′非翻译区的多核苷酸，前提是，如果该核酸为DNA，那么序列表中的核苷酸符号“u”应当以“t”取代。
4.由多核苷酸(a)或(b)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO4所代表核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在严格条件下与由同所述(a)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码HCV基因3′非翻译区的多核苷酸，前提是，如果该核酸为DNA，那么序列表中的核苷酸符号“u”应当以“t”取代。
5.由多核苷酸(a)或(b)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO2所代表核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在严格条件下与由同所述(a)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码HCV蛋白中NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白的多核苷酸，前提是，如果该核酸为DNA，那么序列表中的核苷酸符号“u”应当以“t”取代。
6.由多核苷酸(a)或(b)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO5所代表核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在严格条件下与由同所述(a)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码HCV基因5′非翻译区的多核苷酸，前提是，如果该核酸为DNA，那么序列表中的核苷酸符号“u”应当以“t”取代。
7.由多核苷酸(a)或(b)组成的核酸(a)含有SEQ ID NO6所代表核苷酸序列的多核苷酸；及(b)在严格条件下与由同所述(a)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交并编码HCV基因3′非翻译区的多核苷酸，前提是，如果该核酸为DNA，那么序列表中的核苷酸符号“u”应当以“t”取代。
8.由根据权利要求1至7中任一项的核酸组成的基因。
9.由根据权利要求8的基因编码的多肽。
10.含有RNA(a)或(b)的复制子RNA(a)含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示核苷酸序列的RNA；及(b)含有SEQ ID NO2、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示核苷酸序列的RNA。
11.根据权利要求10的复制子RNA，另外含有IRES序列。
12.根据权利要求11的复制子RNA，另外含有选择标记基因或报告基因。
13.由RNA(a)或(b)组成的复制子RNA(a)含有SEQ ID NO7或SEQ ID NO8所示核苷酸序列的RNA；及(b)在严格条件下与由同所述(a)核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的RNA杂交并具有自主复制能力的RNA。
14.通过将权利要求10至13中任一项的复制子RNA导入细胞而制备复制子-复制细胞的方法。
15.通过将权利要求10至13中任一项的复制子RNA导入细胞而制备的复制子-复制细胞。
16.根据权利要求15的复制子-复制细胞，其中所述细胞是人肝衍生细胞、人子宫颈衍生细胞或人胚肾衍生细胞。
17.根据权利要求15或16的复制子-复制细胞，其中所述细胞是Huh7细胞、HepG2细胞、IMY-N9细胞、HeLa细胞或293细胞。
18.筛选刺激或抑制丙型肝炎病毒复制的物质的方法，其包括在测试物质的存在下培养权利要求15至17中任一项的复制子-复制细胞，并在所得培养物中检测复制子RNA的复制。
19.提高丙型肝炎病毒复制子RNA的复制效率的方法，其包括至少实施一次如下步骤，在所述步骤中从权利要求15至17中任一项的复制子-复制细胞获得复制的复制子RNA，并将由此得到的复制的复制子RNA导入其它细胞以制备新的复制子-复制细胞。
20.权利要求19的方法，其中复制效率是导入复制子-复制细胞中的复制子RNA的复制效率的至少两倍。
21.产生具有更高复制效率的丙型肝炎病毒复制子RNA的方法，其包括至少实施一次如下步骤，在所述步骤中从根据权利要求15至17中任一项的复制子-复制细胞获得复制的复制子RNA，且将由此得到的复制的复制子RNA导入不同于复制子-复制细胞的细胞以制备新的复制子-复制细胞，并从最终得到的复制子-复制细胞获得复制的复制子RNA。
22.产生具有更高复制效率的丙型肝炎病毒复制子RNA的方法，其包括检测由权利要求21的方法产生的具有更高复制效率的复制子RNA与最初导入复制子-复制细胞中的复制子RNA之间的核苷酸或氨基酸突变，并将检测到的核苷酸或氨基酸突变引入旨在提高复制效率的复制子RNA中。
全文摘要
从新的暴发性丙型肝炎病毒株来源的基因、使用该基因获得的具有高复制效率的HCV复制子RNA、以及用该复制子RNA转染的HCV复制子－复制细胞。通过使用如上所述的HCV复制子RNA和HCV复制子－复制细胞，可以连续大量产生HCV蛋白。
文档编号G01N33/50GK1882690SQ20048003392
公开日2006年12月20日 申请日期2004年9月16日 优先权日2003年9月19日
发明者胁田隆字, 加藤孝宣, 伊达朋子, 宫本道子 申请人:财团法人东京都医学研究机构, 东丽株式会社