一种检测lbp基因标签单核甘酸多态性位点的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学领域，具体涉及检测LBP基因标签单核甘酸多态性位点的方法及试剂盒，该方法包括步骤：1）设计特异性扩增引物和测序引物；2）用特异性扩增引物对待测标本的DNA进行PCR扩增；3）用焦磷酸测序法进行测序。本发明的方法及试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测LBP基因标签SNP基因型，能够满足临床检验实际工作的需要，利于LBP基因标签SNP检测预测疾病的发生、发展风险。
【专利说明】—种检测LBP基因标签单核甘酸多态性位点的方法及试剂
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【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，具体涉及适用于PCR扩增结合焦磷酸测序技术检测LBP基因标签单核甘酸多态性位点的方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]1986年Tobias首次从兔血清中分离、纯化出脂多糖结合蛋白(Lipopolysaccharide binding protein, LBP)，LBP 属于 I 型急性期反应蛋白，人 LBP 蛋白由481个氨基酸组成，并且有分泌性蛋白典型的25个氨基酸组成的信号肽。LBP蛋白相对分子质量为60ku，蛋白质部分是由一条50ku的单链多肽组成，其血浆浓度为2~7mg/L，在LPS诱导急性反应后，血浆LBP浓度可明显提高。LBP主要在肝脏合成，有研究表明，肺、肠、肾、脾等肝外组织也合成LBP，其中肺是肝外组织LBP mRNA表达量最多的器官。在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者的支气管肺泡灌洗液中，LBP浓度是正常人的64倍。LBP不仅是一种血浆蛋白，还可作为ー种跨膜蛋白。这种膜结合LBP本身可嵌入单核细胞的胞膜中，同时促进脂多糖(LPS)嵌入其中，抗LBP单克隆抗体并不抑制LBP的嵌入，但是可抑制LPS的嵌入及LPS诱导的TNF- a的产生，因此膜结合LBP和LPS的嵌入被认为是LBP介导LPS激活单核细胞的ー个重要步骤。
[0003]单核甘酸多态性(SNP)是指染色体上单个核苷酸变异引起的群体中DNA序列多态性，具有密度高、遗传稳定、易于自动化分析等特点，被认为是继限制性片段长度多态性、微卫星多态性之后的第三代遗传标记，可用于基因定位、多态性分析等方面，是研究疾病遗传易感性、疾病诊断、药物筛选等的常用指标。LBP基因标签单核甘酸多态性位点的检测与分型，对LBP基因在健康人群的遗传特点及与疾病发生、发展的遗传关联研究有重要意义。
[0004]关于SNP的检测方法，目前已发展了 20余种，如直接测序法、探针杂交法、飞行质谱分析法、限制性片段长度多态性分析法等，但因这些方法的费用、准确性和适用规模等方面的缺点，局限了基因多态性与疾病发生、发展和预后的遗传关联研究。而焦磷酸测序技术是新一代基于酶级联反应的DNA序列分析技木，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将DNA单链上的每ー个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和強度，达到实时测定DNA序列的目的。该技术具有其独特的优势，无需电泳、DNA片段无需荧光标记；具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量、灵敏度高等特点，符合临床大样本检测要求。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明的目的之ー在于提供一种检测LBP基因标签单核甘酸多态性位点的方法，其能够 简捷、直观、准确的对LBP标签SNP基因型进行检测和判读。
[0006]为实现上述目的，本发明的技术方案为:
[0007]检测LBP基因标签单核甘酸多态性位点的方法，包括以下步骤:[0008]I)特异性引物的设计:根据被证实的LBP基因标签单核甘酸多态性位点，设计特异性扩增引物和测序引物，其中，所述特异性扩增引物中的一条用生物素标记；2)PCR扩增:以待测标本的DNA为模板，用步骤I)所述的特异性扩增引物进行PCR反应，得PCR扩增物；3)焦磷酸测序:将步骤2)所得PCR扩增物采用碱变性使其分开成单链，取其中被生物素标记的单链PCR扩增产物纯化后，与步骤I)所述测序引物进行杂交反应，并分析结果以判断所述待测标本的靶单核甘酸是否具备多态性。本技术方案的创新点主要在首次采用焦磷酸测序法检测LBP基因的单核甘酸多态性。
[0009]进一歩，所述LBP基因标签单核甘酸多态性位点包括:rsl780623、rsll536972和rs2232618中的ー个或多个。上述位点是通过如下方法获得的:利用HapMap (http://www.hapmap.0rg) SNP 数据库(HapMap Data Rel 28 Phase II+III, AuglO, on NCBI B36assembly, dbSNP bl26)下载LBP基因及其上下游IOkb范围内中国北京汉族人群(CHB)SNP数据:1)检索框输入基因名查看各基因在HapMap定位，并上下游各延伸10kb，2)“Reports&Analysis” 的选项中选择:Download SNP genotype data。3) “config” 中选择中国北京汉族人群(Chinese Han Bei jing，CHB)，获取中国北京汉族人群SOCS家族各基因及其延伸区域内所有SNP位点。[0010]进ー步，所述rsl780623位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，测序引物如SEQ ID NO:3所示；所述rsll536972位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，测序引物如SEQ ID NO:6所示；所述rs2232618位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，测序引物如SEQ ID NO:9所示。详见下表:
[0011]
【权利要求】
1.检测LBP基因标签单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)特异性引物的设计 根据被证实的LBP基因标签单核甘酸多态性位点，设计特异性扩增引物和测序引物，其中，所述特异性扩增引物中的一条用生物素标记； 2)PCR扩增 以待测标本的DNA为模板，用步骤I)所述的特异性扩增引物进行PCR反应，得PCR扩增物； 3)焦磷酸测序 将步骤2)所得PCR扩增物采用碱变性使其分开成单链，取其中被生物素标记的单链PCR扩增产物纯化后，与步骤I)所述测序引物进行杂交反应，并分析结果以判断所述待测标本的靶单核甘酸是否具备多态性。
2.根据权利要求1所述的检测LBP基因标签单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于:所述LBP基因标签单核甘酸多态性位点包括:rsl780623、rsl 1536972和rs2232618中的一个或多个。
3.根据权利要求2所述的检测LBP基因标签单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于:所述rsl780623位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，测序引物如SEQ ID NO:3所示；所述rsll536972位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示，测序引物如SEQ ID NO:6所示；所述rs2232618位点的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，下`游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，测序引物如SEQ ID NO:9 所示。
4.根据权利要求2所述的检测LBP基因标签单核甘酸多态性位点的方法，其特征在于:所述rsl780623位点、rsl 1536972位点和rs2232618位点组合进行三重PCR扩增。
5.用于检测LBP基因标签单核甘酸多态性位点的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括LBP基因标签单核甘酸多态性位点的特异性扩增引物，LBP基因标签单核甘酸多态性位点的焦磷酸测序引物，以及PCR反应液、PCR产物筛选液、焦磷酸测序反应液。
6.根据权利要求5所述的用于检测LBP基因标签单核甘酸多态性位点的试剂盒，其特征在于:所述特异性扩增引物如SEQ ID NO: 1-2所示，和/或如SEQ ID N0:4_5所示，和/或如SEQ ID NO:7-8所示。
7.根据权利要求5所述的用于检测LBP基因标签单核甘酸多态性位点的试剂盒，其特征在于:所述测序引物如SEQ ID NO: 3所示，和/或如SEQ ID NO:6所示，和/或如SEQ IDNO:9所示。
8.根据权利要求5所述的用于检测LBP基因标签单核甘酸多态性位点的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括标记所述扩增引物的生物素。
9.用于检测LBP基因标签单核甘酸多态性位点的特异性引物，其特征在于:所述特异性引物如SEQ ID NO: 1-2所示，和/或如SEQ ID NO:4_5所示，和/或如SEQ ID N0:7_8所/Jn o
【文档编号】C12N15/11GK103602753SQ201310659016
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】曾灵, 蒋建新, 张安强, 王海燕, 杜娟, 顾玮, 岳彩黎 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院