专利名称：：用于结构基因的细胞周期调节表达的核酸构建体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种核酸构建体，该核酸构建体包含至少一种激活物序列、至少一种启动子组件(该组件包含结合E2F家族的蛋白质和CDF-1家族的蛋白质的核苷酸序列)以及至少一种结构基因。在细胞周期调节抑制中暗含的一个因子是E2F，该因子能通过与口袋蛋白质相互作用形成DNA-结合抑制蛋白复合物，如pRb(Weintraub等，自然，358，259(1992)；Helin和Harlow，细胞生物学，3，43(1993)；Zamanian和LaThangue，分子生物细胞学，4，389(1993))。E2F是由E2F与DP多基因家族的成员组成的异二聚物转录因子(Nevins，科学，258，424(1992)；Müller，遗传学趋势，11，173(1995)；LaThangue，学报，24，54(1996))。另一个属于E2F基因家族的转录因子是如E2F-5(WO96/25494)。在细胞周期期间通过pRb家族的口袋蛋白质调节通过E2F的转录活化。E2F在G0和早期G1被抑制，但是在细胞周期过程中，DP/E2F部分和有关的口袋蛋白质由G1特异性细胞周期蛋白依赖性激酶过磷酸化，导致抑制性三元复合物的解离(DeCaprio等，美国科学院学报，89，1795(1992)；Fagan等，细胞，78，799(1994)；Hatakeyama等，基因发展，8，1759(1994)；Weinberg，细胞，81，323(1995))。该解离产生转录活性的“游离E2F”并导致E2F-调节的基因的活化。因此，例如，包含编码E2F调节物和/或E1A调节物的核酸的载体已经用于转染分化的诱导DNA合成的神经元(WO95/16774)。在通过经E2FBSs的转录抑制控制的启动子中有E2F-1、orc-1和B-myb(Lam和Watson，EMBO杂志，12，2705(1993)；Hsiao等，基因发展，8424，1526(1994)；Johnson等，基因发展，8424，1514(1994)；Ohtani等，分子细胞生物学，16，6977(1996))。然而，E2F的功能不是专一活化的。这首先显示了鼠B-myb基因(Lam和Watson，EMBO杂志，12，2705(1993)；Lam等，EMBO杂志，13，871(1994)；Lam等，基因，160，277(1995)，Zwicker等，科学271，1595(1996))。在B-myb启动子的E2F结合位点(E2FBS)的突变导致了选择性地在G0中急剧提高的活性以及随后的细胞周期调节作用的丧失。在本文中的其它例子是E2F、p107、组蛋白H2A和orcl启动子，其中所说的E2FBSs的突变也除去了抑制与细胞周期调节(Hsiao等，基因发展，8424，1526(1994)；Johnson等，基因发展，8424，1514(1994)；Zhu等，分子细胞生物学，15，3552(1995)；Ohtani等，分子细胞生物学，16，6977(1996)；Oswald等，分子细胞生物学，16，1889(1996))。对由E2FBSs抑制的几个基因的鉴定暗示，E2F-介导的转录抑制是细胞周期调节的转录的常见机制。然而，B-myb基因抑制的机制与所有为E2F的作用提出的模型不同，因为它需要直接定位在E2FBS的下游的第二个元件(Bennet等，致癌基因，13，1073(1996)；Zwicker等，科学，271，1595(1996))。此外，B-mybE2FBS在细胞中的存在是细胞周期调节性的，并仅在抑制阶段期间看见(Zwicker等，科学，271，1595(1996))。这些观察十分类似于用其它启动子进行的观察，如cdc25C、cdc2和细胞周期蛋白A，它们是周期性地通过两个合作元件即E2FBS样的CDE和邻近的CHR抑制(Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995))。细胞周期调节的转录的机制通过在细胞周期的后期阶段表达的基因的分析发现。当通过体内足迹和突变分析研究cdc25C启动子(它在后期S/G2中被正调节)时，确定了新的抑制剂元件，“细胞周期依赖性元件”(CDE)(Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995))。CDE在G0-G1中占据，当cdc25C表达时，它的占据就在G2中失去。CDE介导的抑制在调节其它启动子中起作用，并通过功能性的CDEs的存在在细胞周期蛋白A和cdc2启动子(它们在后期G1/S被抑制)中显示(Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995))。这些研究也导致与CDE邻接的其它元件的发现，这在三个启动子中是相同的。该元件被称为“细胞周期基因同源区”(CHR)(Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995))。CDE或CHR在cdc25C，cdc2或细胞周期蛋白A启动子中的突变很大程度上除去了在G2期的抑制。这些功能性的数据通过G0-G1特异性蛋白质在基因组足迹中结合到CDE和CHR上的显示支持。有趣的是，当结合到CHR发生于小沟中时，CDE与DNA的大沟接触(Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995))。在WO96/06943中已经要求了CDE-CHR的核苷酸序列及其用于诊断、筛选以及基因治疗的权利。CHR在启动子的抑制中与CDE合作的发现与在B-myb启动子中邻近E2FBS的CHR样序列的鉴定促进了B-myb抑制机制的详尽研究。这些研究显示CHR样区对于抑制是不可缺少的，并与E2FBS一道作为共抑制元件(Bennett等，致癌基因，13，1073(1996))。该区被称为Bmyb-CHR(Bennett等，致癌基因，13，1073(1996))或DRS(Bennett等，致癌基因，13，1073(1996))。此外，基因组足迹清楚地显示在中G1中失去E2F位点占据平行于B-myb的去阻遏(Zwicker等，科学，271，1595(1996))。这些观察显示E2F-CHR位点调节基因在晚G1中引起的转录，其方式类似于CDE-CHR位点在S或G2导致基因的去阻遏。另外，这些研究结果表明抑制E2F位点通过邻接的CHR协阻遏物元件的缺乏不同于活化E2F位点。在细胞周期的不同阶段，E2F与CDE介导的抑制共同作用依赖于启动子特异性的CHR元件(Liu，N.等，核酸研究，24，2905，15(1996))。CDE与E2FBS核心序列相同，如在B-myb启动子中的那些序列(GGCGG)(Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995))，但是仍然不了解什么决定了E2FBS与CDE的差异。此外，到目前为止还没有确定CDE或CDE-CHR的结合活性，CDE结合因子与转录因子的E2F家族的关系不清楚。两抑制剂组件抑制定位在E2FBS-Bmyb-CHR或CDE-CHR上游的活化序列。在早期(G0至中G1期)，Bmyb-CHR元件抑制了上游活化序列，CDE-CHR直到细胞周期的后期(G0至S期)才抑制。这个发现导致了下述基因的构建，这些基因包含非细胞特异性的、细胞特异性的、病毒特异性的和/或代谢特异性的激活物序列、控制激活物序列活化的细胞周期特异性启动子组件(如CDE-CHR或E2FBS-Bmyb-CHR)以及编码治疗蛋白质的结构基因。这样的基因构建体被要求用于各种各样的疾病的基因治疗(参见，例如，WO96/06943；D196.05274.2；D196.17851.7；WO96/06940；WO96/06938；WO96/06941；WO96/06939)。本发明的一个目的是发现具有不同的细胞周期依赖性基因表达的新的核酸构建体。令人惊奇地发现参与B-myb的抑制的因子与CDE-CHR调节的启动子是不同的。通过E2F复合物与CHR结合因子缀合显示出抑制B-myb基因，而cdc25C启动子受到在本发明中确定的、称为CDE-CHR结合因子-1(CDF-1)的新的活性抑制。其后，分析了在几个细胞周期调节的基因中CDF-1与抑制元件的相互作用。采用体内和体外DMS足迹法、启动子荧光素酶构建体的EMSA和功能测定，有可能确定下列的CDF-1活性(a)CDF-1在cdc25C启动子中以协同方式与CDE和CHR相互作用，这与在细胞中看到的CDE的CHR依赖性占据相符合。(b)CDF-1与在CDE(大沟)中的G残基和在CHR(小沟)中的A残基相互作用。该保护模式与在体内足迹法中发现的相同(Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995))。(c)CDF-1结合到包含突变的CDE或CHR基元的序列上与在细胞周期调节的抑制中这样的突变的元件的功能精确相关。(d)CDF-1以类似的效率结合到所有已知的CDE-CHR调节的启动子，即cdc25C、cdc2和细胞周期蛋白A上，但仅与B-myb微弱结合。(e)可以显示出CDF-1以相似的高效率结合到包含cdc25C、cdc2和细胞周期蛋白A基因的启动子的CDE-CHR上，同时与B-myb启动子E2FBS-CHR组件的相互作用比较弱。(f)E2F不能经由cdc25CCDE-CHR元件介导抑制，反之亦然，CDF-1不能经由E2FBS-Bmyb-CHR介导抑制。CDF-1蛋白质可通过高盐提取法从HeLa悬浮培养物的核提取物中分离并在CDE-CHR序列基元的存在下通过亲和色谱纯化。因此，本发明的第一实施方案涉及可由下列步骤获得的CDF-1蛋白质(a)从HeLa细胞制备核提取物，和(b)在包含CDE-CHR序列基元的寡核苷酸的存在下，特别是在包含序列GGCTGGCGGAAGGTTTGAAT的基元存在下，和特别是在包含序列GGCTGGCGGAAGGTTTGAATGGCTGGCGGAAGGTTTGAAT的基元存在下，通过亲和色谱纯化步骤(a)的提取物。在特别优选的实施方案中，把包含CDE-CHR序列基元的寡核苷酸与琼脂糖，例如，通过链霉抗生物素蛋白偶联。通常，步骤(a)的核提取物通过HeLa细胞的高盐提取法(具体地说通过如下的高盐提取，例如按照Dignam，J.D.(1983)，核酸研究，11，1475-1489)制备。CDF-1蛋白质可以通过逐步增加的盐浓度(例如通过增加至1M的KCl盐浓度)从色谱柱洗脱。CDF-1蛋白质用于CDF-1的抑制剂或刺激剂的鉴别特别有用，特别是CDF-1的抑制功能的鉴别。CDF-1分离与功能定性的另一个结果是E2F/DP和CDF-1的结合与抑制功能所必须的核苷酸的鉴别。通常，结合依赖于CDE与CHR的完整形式的存在。CDE的共有序列可以定义为G/CGC/TGG/C(在cdc25C中的GGCGG；Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995))，cdc25C的CHR序列可定义为序列TTTGAA。与该区中的核苷酸相对比，CDE和CHR之间的核苷酸(AAGG，参见表1、2)和CHR下游的核苷酸(TGG，参见表1、2)可以改变而对抑制功能没有可检测到的作用。类似的结合位点特异性相互作用模式可用部分纯化的CDF-1观察到。在B-myb的E2FBS和cdc25C的CDE中的核苷酸(对在E2F和CDF-1结合之间的区别起作用)是与E2FBS/CDE核心(GGCGG)直接邻近的核苷酸。这样，两个核苷酸上游(在B-myb中的CT)和一个核苷酸下游(在B-myb中的G)一般造成E2F结合，但是不造成CDF-1结合。基于这些发现，可能测定突变型B-myb启动子的功能，该启动子具有很强地减少的E2F结合，但具有正常的CDF-1相互作用，并可能显示该构建体的抑制被削弱。这些数据显示与E2F的相互作用一般是必须的，并显示出CDF-1的结合不足以赋与任何在B-myb启动子上的细胞周期调节。这种状态非常不同于CDE-CHR抑制的cdc25C启动子。在这种情况下，没有发现对E2F的结合，与CDF-1强烈的相互作用一般依赖于CHR。这样，E2F结合位点大于(即至少9个核苷酸)5-核苷酸CDE(Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995))，但是不包括CHR，而CDF-1结合位点是由5-核苷酸CDE和邻接6-核苷酸CHR组成。因此，可能创造这样的启动子，该启动子具有与E2F和CDF-1以高效率相互作用的能力，方法是通过把Bmyb-CHR改变成cdc25CCHR(B-C4，参见表2)或通过把cdc25CCDE侧翼核苷酸改变成其B-myb对应物(参见表2，C-B1，2)。令人感兴趣的是，这些启动子显示出在细胞周期期间相对于去阻遏的定时的新特性，其中在早中S-期，可以观察到半最大活性比B-myb迟，但比cdc25C早。这些观察显示出E2F和CDF-1的不同结合是由于调节的定时。与此观察相一致的是发现显示出优选和强烈的CDF-1结合的B-myb启动子突变型(参见表2，B-C-1、3、4)显示出cdc25C样的表达动力学。因此，本发明的另一个实施方案是核酸构建体，该核酸构建体包含a)至少一种激活物序列，b)至少一种嵌合启动子组件，该组件包含结合E2F家族的蛋白质和CDF-1家族的蛋白质的核苷酸序列；和c)至少一种结构基因，其中所说的嵌合启动子组件引起细胞周期中基因表达的正调节，它比B-myb启动子迟，但比cdc25C启动子早。在一个优选的实施方案中，激活物序列定位在嵌合启动子组件的上游。已经发现突变成ACTTGGCGGGAGATTTGAAT(SEQIDNO1)的B-myb基因的E2FBS-Bmyb-CHR启动子组件(突变的位置下划线)ACTTGGCGGGAGATAGGAAA(Zwicker等，科学，2711595(1996))包含高度亲和性的E2F以及CDF-1结合位点。在体内(在细胞内)E2F和CDF-1与核苷酸序列的结合局限在G0与G1期，并且在S、G2和M期检测不到，在细胞周期的G0和G1期，核苷酸SEQIDNO1能够强烈地抑制激活物序列(定位在SEQIDNO1的上游)的活性以活化结构基因的转录(定位在SEQIDNO1的下游)。同样地发现突变成GCTTGGCGGGAGGTTTGAAT(SEQIDNO2)的cdc25C基因的CDE-CHR启动子组件(突变的位置下划线)GGCTGGCGGAAGGTTTGAAT(EMBO杂志，14，4514(1995))包含高度亲和性的CDF-1以及E2F结合位点。在体内(在细胞内)CDF-1和E2F与核苷酸序列的结合局限在G0与G1期，并且在S、G和M期检测不到，在细胞周期的G0和G1期，核苷酸SEQIDNO2能够强烈地抑制激活物序列的活性(定位在SEQIDNO2的上游)以活化结构基因的转录(定位在SEQIDNO2的下游)。因此，本发明的一个优选的实施方案涉及具有嵌合启动子组件的核酸构建体，该组件包含至少一种核苷酸序列，该核苷酸序列选自由ACTTGGCGGGAGATTTGAAT(SEQIDNO1)和ACTTGGCGGGAGGTTTGAAT(SEQIDNO2)组成的组。通常，启动子组件与激活物序列相互作用，所说的相互作用影响结构基因的表达。激活物通常通过基础转录的非特异的、细胞特异性的、病毒特异性的和/或代谢特异性的活化起作用。结构基因通常以细胞周期特异性的、细胞特异性的和细胞周期依赖性的、病毒特异性的和细胞周期依赖性的和/或代谢特异性的和细胞周期依赖性的方式表达。按照本发明的核酸构建体优选地由DNA组成。本文所用的术语“核酸构建体”是指能在靶细胞中转录的人工核酸结构。这样的构建体可以插入到载体中。可以利用非病毒载体(如质粒载体)或病毒载体。这种载体和按照本发明的核酸构建体的插入技术是技术人员所知道的。按照本发明的核酸构建体不以本发明描述的排列方式天然存在。换句话说，核酸构建体的结构基因不天然地与激活物序列和嵌合启动子组件组合。本发明的另一个实施方案涉及包含本发明的核酸构建体或载体的细胞。按照本发明的核酸构建体使结构基因经历细胞周期特异性表达或细胞和细胞周期特异性表达、或病毒和细胞周期特异性或代谢和细胞周期特异性表达成为可能。在一个优选的实施方案中，结构基因是编码病理活性物质的基因。在另一个优选的实施方案中，结构基因编码把药物非活性前体裂解成活性药物(“前体药物”裂解成药物)的酶。这样的药物前体裂解成药物的例子由Sedlacek等，Contrib.toOncol.43，KargerVerlag(1992)；Hay等，未来药物，21，917(1996)描述。“激活物序列”(指这样的核苷酸序列，该核苷酸序列是基因的一部分，所谓的转录因子调节蛋白能够与其结合)作为结合的结果活化定位在下游的结构基因的转录。被称作“下游”序列的区是定位在转录方向的区域，而安排在相反方向的序列被称作“上游”序列。在本发明的一个实施方案中，激活物序列可以是非特异的、细胞特异性的或病毒特异的或代谢特异性的。用于本说明书的“细胞特异性的”是指激活物序列选自编码这样的蛋白质的基因，该蛋白质在给定的细胞中特异性地表达；“病毒特异性的”是指激活物序列选自病毒基因；“代谢特异的”是指激活物序列选自编码这样的蛋白质的基因，该蛋白质在所限定的代谢条件下特异性表达。这样，在另一个优选的实施方案中，激活物序列选自在下列细胞中活化转录的启动子或增强子的组内皮细胞、浆膜细胞、平滑肌细胞、肌肉细胞、滑膜细胞、生血细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、白血病细胞、肿瘤细胞或角化细胞、神经胶质细胞，或选自病毒HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV、CMV、SV40或HIV的启动子或增强子序列。细胞特异性的、病毒特异性的和代谢特异性的激活物序列的例子在WO96/06940；WO96/06938；WO96/06941和WO96/05994中描述。激活物序列可以是启动子或增强子。按照本发明的嵌合启动子组件包含E2F家族以及CDF-1家族的蛋白质的结合位点。这样的启动子组件的例子是SEQIDNO1和SEQIDNO2。在本发明的一个优选的实施方案中，这种嵌合启动子组件定位在活化序列的下游。在本发明的另一个优选的实施方案中，启动子组件可以按照在D196.17851.7中的描述的技术与激活物序列结合。在本专利申请中，描述了结合几个启动子的几个例子。一个例子是激活物响应的启动子单位。它由两个不同的激活物亚单位A和B组成。A和B的表达产物融合在一起并通过其形成活化激活物响应的启动子的转录因子。激活物亚单位A和B的表达处于A的启动子和B的启动子的控制之下。这些启动子可以相同或不同。在本发明的另一个优选的实施方案中，嵌合启动子组件可以与从一系列启动子中选择的第二启动子结合，这些启动子包括强烈的非特异性的可活化的启动子(如RNA聚合酶III的启动子、RNA聚合酶II的启动子、CMV启动子和增强子和/或SV40启动子)；或病毒启动子和/或激活物序列(如HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV和/或HIV的激活物序列)；或代谢可活化的启动子或增强子序列(例如，可由缺氧诱导的启动子或增强子)；或另一个细胞周期特异性启动子(例如cdc25C基因、细胞周期蛋白A基因、cdc2基因、B-myb基因、DHFR-基因或F2F-1基因的启动子)；或四环素可活化的启动子(例如，与相应的抑制剂相结合的四环素操纵子)；或细胞特异性可活化启动子；这些启动子包括这样的基因的上游活化序列，该基因编码主要或专一在所选择的细胞类型中表达的蛋白质。本发明的核酸构建体可用于遗传工程；具体地说用于基因治疗。在基因治疗中，把旨在于身体中表达的基因引入身体。这些基因表达的调节对于基因治疗的治疗效果来说是重要的。因此，本发明也涉及可用于基因治疗的核酸构建体。基因治疗的技术对熟练技术人员是熟知的。例如，WO93/24640和WO95/11984公开了用于在体内基因治疗中用非病毒或病毒载体技术的方法和组合物。在另一个例子中，WO95/06743公开了这样的方法，通过该方法把治疗核酸构建体引入患者的分离的呼吸道上皮细胞(通过以包含构建体的病毒(AAV)载体转化)。然后把转化的细胞施用于患者。此外，FR2735789公开了包含重组腺病毒的药物组合物。本领域技术人员同样熟知用于各种非病毒载体的技术，该非病毒载体可用作用于本发明的构建体的载体，并在体外运用于细胞或体内注射或运用于患者。在一个优选的实施方案中，核酸构建体可用于至少一个结构基因的细胞特异性的和细胞周期调节的表达。在另一个优选的实施方案中，核酸构建体可用于至少一个结构基因的病毒特异性的和细胞周期调节的表达。在另一个优选的实施方案中，核酸构建体可用于至少一个结构基因的代谢特异性的和细胞周期调节的表达。按照本发明的核酸构建体或细胞优选地用于治疗病症，该病症的特征在于细胞增殖或与细胞增殖有关。这样的处理包含，例如把所说的核酸构建体引入靶细胞。病症(其特征在于细胞增殖或与细胞增殖有关)的例子是肿瘤疾病、白血病、心血管疾病、炎症反应、自身免疫反应、变态反应、关节炎、牛皮癣、移植器官的即将发生的排斥、CNS破坏、传染病、血液凝固病症和慢性病毒感染。这样的病症可通过全身或局部施用本发明的构建体或细胞来治疗。这样的构建体在各增殖的细胞群体中的表达受细胞特异性的、代谢特异性的或病毒特异性的激活物序列以及细胞周期特异性启动子组件控制。本发明的构建体的表达产物可直接或间接地抑制细胞增殖或杀死增殖细胞。借助于构建体的结构，它可以在细胞增殖阶段期间表达。为了治疗其它病症，选择在本发明的核酸构建体或细胞中的活化序列和活性物质的结构基因取决于利用目的。通常，结构基因编码这样的物质，该物质选自由细胞因子、生长因子、细胞因子受体、生长因子受体、具有抗增殖作用的蛋白质、具有编程性细胞死亡作用的蛋白质、具有细胞抑制作用的蛋白质、具有细胞毒性作用的蛋白质、具有炎性作用的蛋白质、具有抗炎作用的蛋白质、具有免疫抑制作用的蛋白质、抗体、抗体片段、血管形成抑制剂、凝固因子、纤维蛋白溶解化合物以及抗凝剂、血液蛋白质、病毒抗原、细菌抗原和肿瘤抗原和配体(如生长因子、细胞因子或抗体)和一种上述提及的物质之间的融合蛋白组成的组。在这一点上，本发明包含下列构建体和治疗方法。1.通过抑制内皮细胞增殖的肿瘤和慢性炎症的治疗肿瘤与慢性炎症的特征在于通过增殖内皮细胞形成新的血管。在一个实施方案中，这样的增殖的内皮细胞是要通过本发明的构建体转导的靶细胞以表达蛋白质，该蛋白质直接或间接抑制内皮细胞的增殖和/或杀死增殖内皮细胞和邻近的肿瘤细胞。1.1.在内皮细胞中活化的激活物序列在一个实施方案中，在内皮细胞中活化的激活物序列包括那些基因调节的序列和基因的启动子元件，这些基因编码在特别是内皮细胞中可检测的蛋白质。这些内皮细胞特异性蛋白质以及它们的基因的启动子序列的例子在WO96/06940中描述。这些启动子包括编码下列物质的基因的启动子或激活物序列脑特异性内皮葡萄糖-1转运蛋白、Endoglin、VEGF受体-1(flt-1)、VEGF受体-2(flk-1，KDR)、tie-1或tie-2、B61受体(Eck-受体)、B61、内皮素(例如内皮素B或内皮素-1)、内皮素受体(具体地说是内皮素B受体)、甘露糖-6-磷酸受体、vonWillebrand因子、IL-1α、IL-1β、IL-1受体、血管细胞粘着分子(VCAM-1)、合成的激活物序列，例如包含和/或5’-TTATCT-3’结合转录因子GATA-2的合成激活物序列。1.2.在与活化的内皮细胞邻近的细胞中活化的激活物序列当内皮细胞增殖时，邻近的细胞因为“紧接头”可接近得自血液的大分子。这些功能和解剖学的相互关系是指在活化的内皮细胞附近的细胞是用于本发明的靶细胞。在邻近的细胞中活化的激活物序列的例子在WO96/06940中描述。那些激活物序列或启动子包括编码VEGF的基因的启动子或激活物序列。VEGF基因的基因调节序列是5’侧翼区或3’侧翼区或c-Src基因或v-Src基因。其它例子是类固醇激素受体和它们的启动子元件(Truss和Beato，Enocrin.Rev.14，459(1993))，具体地说是鼠哺乳动物肿瘤病毒启动子。1.3.抗肿瘤或抗炎活性物质的结构基因“抗炎”物质可以具有一种或多种下列特征内皮细胞增殖的抑制、血管形成的抑制、血栓形成的抑制、细胞抑制或细胞毒性性质、引起编程性细胞死亡的能力或把药物前体转化成为具有细胞毒性、细胞抑制或抗炎特性的活性药物的能力。用于本申请的“抗肿瘤”物质可以具有前面的一种或多种性质。此外，“抗肿瘤”物质可以是引起炎症的物质。这些物质和它们的基因的例子在WO96/06940、WO96/06941和D19617851.7中描述。编码这些物质的基因是例如细胞增殖的抑制剂的结构基因，例如成视网膜细胞瘤蛋白质(pRb＝p110)和有关的p107与p130蛋白质、p53蛋白质、p21(WAF-1)蛋白质、p16蛋白质、其它cdk-抑制因子、GADD45蛋白质或bak蛋白质的基因。成视网膜细胞瘤蛋白质(pRb＝p110)和有关的p107与p130蛋白质通过磷酸化灭活；优选的是这些细胞周期抑制剂的这类基因，这些基因包含表达的蛋白质的灭活位点的突变，但不损害这些抑制剂的功能。其它例子是血栓形成诱导因子和/或血管形成抑制剂的结构基因，例如血纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、PAI-2、PAI-3、血管抑制素(angiostatin)、干扰素(如IFNα、IFNβ、IFNγ)、血小板因子-4、IL-12、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、白血病抑制因子(LIF)或组织因子(TF)和其活性片段的基因。进一步的例子是细胞抑制或细胞毒性蛋白质的结构基因，例如，编码穿孔素、粒酶、IL-2、IL-4、IL-12、干扰素(例如IFNα、IFNβ、IFNγ)、TNF、TNFα、TNFβ、制瘤素M、鞘磷脂酶或爪蟾抗菌肽和爪蟾抗菌肽衍生物的基因。1.4.细胞抑制或细胞毒性抗体、抗体片段和融合蛋白(抗原结合抗体或抗体片段和细胞抑制、细胞毒性或炎症蛋白质或酶之间)的结构基因。细胞抑制或细胞毒性抗体包括这样的抗体，该抗体针对在内皮细胞或肿瘤或白血病细胞上的膜结构。这样的抗体由，例如，Sedlacek等，Contrib.toOncol.32，KargerVerlag，München(1988)和Contrib.toOncol.43，KargerVerlag，München(1992)描述。其它例子为对下列物质有特异性的抗体SialylLewis、被T-淋巴细胞识别的在肿瘤上的肽、致癌基因表达的蛋白质、神经节苷脂(例如GD3、GD2、GM、9-0-乙酰基GD3、岩藻糖基GM1)、血型抗原及其前体、在多形上皮细胞粘蛋白上的抗原、在热休克蛋白上的抗原或CD13、CD15、CD33、CAMAL、CD5、CD1c、CD23、膜免疫球蛋白的独特型与同种型上的抗原、CD33、M38、IL-2受体、T-细胞受体、CALLA、CD19或非Hodgkin淋巴肿瘤。1.5靶细胞结合配体和细胞抑制或细胞毒性蛋白质或酶之间的融合蛋白的结构基因。这样的配体包括所有结合到内皮细胞的细胞膜上的蛋白质，例如，生长因子或生长因子的片段，如PDGF、bFGF、VEGF、TGFβ。此外，这样的配体包括结合到活化的和/或增殖的内皮细胞的粘着分子，例如Slex、LFA-1、MAC-1、LECAM-1、VLA4或玻连蛋白。此外，这样的配体包括结合到肿瘤或白血病细胞的细胞膜或膜受体上的化合物，例如，生长因子或生长因子片段。这样的生长因子已经由Cross等，细胞64，271(1991)，Aulitzky等，药物，48，667(1994)，Moore，临床癌症研究，1，3(1995)，VanKooten等，Leuk.Lymph.12，27(1993))描述。1.6炎症诱导剂的结构基因炎症诱导剂的结构基因包括，如RANTES(MCP-2)、单核细胞趋化及活化因子(MCAF)、IL-8、巨噬细胞炎症蛋白质-1(MIP-1，-β)、嗜中性白细胞活化蛋白质-2(NAP-2)、IL-3、IL-5、人白血病抑制因子(LIF)、L-7、IL-11、IL-13、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、眼镜蛇毒因子(CVF)或功能对应于人补体因子C3b的CVF序列、人补体因子C3或C3b序列、功能和结构上类似于CVF的人补体因子C3的裂解产物或活化补体或引起炎症的细菌蛋白质，例如，鼠伤寒沙门氏菌的孔蛋白、金黄色葡萄球菌的“凝集”因子、革兰氏阴性细菌的调节蛋白、军团菌属或流感嗜血菌B型或克雷伯氏菌属的“主要外膜蛋白”或链球菌G组的M-分子。1.7把前药转化为药物的酶的结构基因例如把药物前体转化或裂解成活性的细胞抑制剂的酶的结构基因包括，例如，这样的酶，如单纯疱疹病毒胸苷激酶、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶、细菌硝基还原酶、细菌β-葡糖苷酸酶、黑麦β-葡糖苷酸酶、人β-葡糖苷酸酶、人羧肽酶(CB)，例如，肥大细胞的CB-A、胰的CB-B、细菌羧肽酶、细菌β-内酰胺酶、细菌胞嘧啶脱氨酶、磷酸酶(例如人碱性磷酸酶、人酸性前列腺磷酸酶、5型酸性磷酸酶)、氧化酶(例如人赖氨酰氧化酶、人酸性D-氨基氧化酶)、过氧化物酶(例如人gluthation过氧化物酶、人嗜酸细胞过氧化物酶、人甲状腺过氧化物酶)或半乳糖苷酶。2.用于治疗血细胞产生缺乏的活性物质2.1生血细胞激活物序列的选择用于生血细胞的激活物序列可以是基因调节序列或基因元件(该基因编码在生血细胞中强烈或有选择地表达的蛋白质)。这种类型的基因调节的序列包括细胞因子或其受体的基因的启动子序列，其在未成熟的生血细胞中或邻近的细胞(如骨髓的基质细胞)中的表达先于随后作用于生血细胞的细胞因子并作为活性物质被需要。这种类型的作用于未成熟的生血细胞的细胞因子是，例如，如干细胞因子、IL-1、IL-3、IL-6、GM-CSF或血小板生成素或这些细胞因子的受体。这样的细胞因子的参考在WO96/06941中给出。这些激活物序列包括下列物质的基因的启动子序列，这些物质例如，干细胞因子受体、干细胞因子、IL-1α、IL-1受体、IL-3、IL-3受体((α-亚单位)、IL-3受体(β-亚单位)、IL-6、IL-6受体、GM-CSF、GM-CSF受体(α-链)、干扰素调节因子1(IRF-1)、促红细胞生成素或促红细胞生成素受体。在另一个实施方案中，激活物序列可以是代谢特异性的。代谢(即通过缺氧)可活化的激活物序列的例子由Semeza等，PNAS88，5680(1991)以及McBurney等，核酸研究，19，5755(1991)描述。2.2.生血细胞活性物质的结构基因的选择“生血细胞活性物质”一般是指作用于血细胞的增殖和/或分化的蛋白质。这样的物质的基因的例子在WO96/06941中列出。这些包括贫血治疗(例如红细胞生成素)的结构基因、白细胞减少治疗(例如G-CSF、GM-CSF)的结构基因、血小板减少治疗(例如IL-3、白血病抑制因子(LIF)、IL-11或血小板生成素)的结构基因。3.用于自身免疫疾病、变态反应、炎症治疗并防止器官排斥的活性物质3.1.激活物序列的选择可以利用的激活物序列是在巨噬细胞或淋巴细胞中强烈活化基因的启动子序列，或编码在巨噬细胞和/或淋巴细胞中的免疫应答期间广泛产生的蛋白质基因的启动子序列。编码这样的蛋白质的基因的启动子序列的例子在WO96/06941中描述。这些蛋白质包括IL-1受体、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-2受体、IL-3、IL-3受体(α-亚单位)、IL-3受体(β-亚单位)、IL-4、IL-4受体、IL-5、IL-6、干扰素调节因子1(IRF-1)、IFN应答的启动子、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IFN、GM-CSF、GM-CSF受体(α-链)、IL-13、LIF、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)受体、I型和II型巨噬细胞清除剂受体、MAC-1(白细胞功能抗原)、LFA-1α(白细胞功能抗原)或p150，95(白细胞功能抗原)。3.2.活性物质基因的选择用于这个目的的活性物质可以是下列物质的DNA序列细胞因子、趋化因子、生长因子或其抑制剂之一、细胞因子或生长因子受体的胞外部分、抗体、抗体片段、酶抑制剂或酶。对活性物质的选择取决于要处理的基本病症和选择的启动子序列。适于治疗自身免疫疾病、变态反应、炎症或用于防止器官排斥的结构基因的选择的例子在WO96/06941中给出。这些例子包括，例如变态反应的治疗的结构基因，例如，编码IFNβ、IFNγ、IL-10、特异地抗IL-4、可溶性IL-4受体、IL-12或TGFβ的抗体或抗体片段。防止移植的器官排斥的结构基因，例如编码IL-10、TGFβ、可溶性IL-1受体、可溶性IL-2受体、IL-1受体拮抗物、可溶性IL-6受体、免疫抑制性抗体或包含这些抗体的VH和VL片段的片段或通过接头缀合的VH-和VL片段。抗体对T-细胞受体或其CD3复合物、对CD4或CD8、对IL-2受体、IL-1受体或IL-4受体或对粘着分子CD2、LFA-1、CD28或CD40是特异性的。用于治疗抗体介导的自身免疫疾病的结构基因，例如，编码TGFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-12、可溶性IL-4受体、可溶性IL-6受体或免疫抑制抗体或其包含VH与VL的片段。用于治疗细胞介导的自身免疫疾病的结构基因，例如，编码IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、TNFα、IL-4、TNFβ或免疫抑制抗体或其包含VH与VL的片段。编码细胞增殖抑制剂、细胞抑制或细胞毒性蛋白质或酶(用于把药物前体转化或活化成细胞抑制剂)或融合蛋白的结构基因与肿瘤治疗的结构基因相同。4.用于关节炎治疗的活性物质4.1用于关节炎的激活物序列选择激活物序列一般指这样的启动子或增强子序列，以此形成转录因子或在例如滑膜细胞和炎症细胞中主动地相互作用。为了本发明的目的，优选的启动子序列包括基因调节的序列和元件形成基因(该基因编码特别在滑膜细胞和炎症细胞中表达的蛋白质)。这样的蛋白质的例子在WO96/06941中概述。这些蛋白质包括，例如MMP-1(间质胶原酶)、MMP-3(溶基质素/transin)或组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)(例如TIMP-1、TIMP-2或TIMP-3)。4.2.关节炎的活性物质的结构基因的选择用于这个目的的活性物质一般是指一种DNA序列，其表达的蛋白质直接或间接地抑制炎症(例如在关节中)和/或促进在关节中如软骨和/或结缔组织中胞外基质的重建。这样的蛋白质的例子在WO96/06941中给出。这些蛋白质包括，例如IL-1受体拮抗物、可溶性IL-1受体、IL-6、可溶性TNF受体、IL-4、IL-10、胰岛素样生长因子、TGFβ、超氧化物歧化酶或TIMP(例如TIMP-1、TIMP-2或TIMP-3)。5.抗感染物质通常，活性物质可以以两种根本不同的形式制备对于病毒感染和寄生物入侵的治疗或对于由于病毒、细菌或寄生物的传染病的预防。疫苗一般用于传染病的预防。然而，由常规手段制备有效疫苗的可能性受到限制。这样，发展了DNA疫苗的技术。然而，这些DNA疫苗引起了安全和副作用的问题(Fynan等，Int.J.Immunopharm.17，79(1995)；Donnelly等，免疫学2，20(1994))。下列用于传染病预防的构建体由于它们的细胞特异性和细胞周期调节(这种调节提供了这些物质的高度安全性)可与现有技术物质区分5.1激活物序列的选择5.1.1传染病的治疗可以选择用于治疗传染病的激活物序列包含得自细胞基因的启动子序列(其活性特别因细菌或寄生物感染而改变)，或选择的启动子序列是来自病毒(这些病毒转化被其感染的细胞并刺激增殖)的序列。这些病毒包括，例如，HBV、HCV、HSV、HPV、HIV、EBV和HTLV。关于那些激活物序列的例子在WO96/06941中描述。5.1.2传染病的预防可以选择用于预防传染病的激活物序列包含一般地在内皮细胞、肌肉细胞、淋巴细胞或巨噬细胞中强烈活化的启动子序列，或属于编码一般地在内皮细胞、肌肉细胞、淋巴细胞或巨噬细胞中高度表达的蛋白质的细胞基因的启动子序列。关于这些活化序列的例子在前面和后面的章节中给出。5.2活性物质结构基因的选择5.2.1传染病的治疗可以选择的活性物质是蛋白质的DNA，这种蛋白质具有细胞抑制、细胞毒性、抗细菌或抗病毒的作用或可以是把无活性的前体转化成细胞抑制、细胞毒性、抗细菌或抗病毒的药物的酶。细胞毒性或细胞抑制蛋白质和细胞因子和生长因子的例子在WO96/06941中描述。这些物质包括，例如抗病毒的活性细胞因子和生长因子，例如，IFNα、IFNβ、IFNγ、TNFβ、TNFα、IL-1或TGFβ。其它例子是灭活特定的病毒的抗体或其含VH和VL的片段或其通过接头缀合的VH和VL片段。抗病毒抗体的例子为对HBV、HCV、HSV、HPV、HIV、EBV、HTLV、柯萨奇病毒或汉坦病毒特异性的抗体。进一步的例子是rev.结合蛋白质，例如，RBP9-27、RBP1-8U、RBP1-8D或RBP1-8的假基因。这些物质还包括例如核酶，该核酶催化细胞周期控制蛋白质的基因的mRNA或抗细菌蛋白质的各自的病毒或结构基因的mRNA，所述抗细菌蛋白例如中和细菌毒素或调理细菌的抗体，例如对脑膜炎双球菌C或B、大肠杆菌、疏螺旋体属、假单胞菌属、幽门螺杆菌或金黄色葡萄球菌特异的抗体。抗体或抗体片段是例证性的抗细菌或抗病毒的蛋白质。如上所述，对于某些物质，需要把前体酶促转化成活性形式。在这样的情况下，抗细菌、抗病毒、细胞毒性或抗寄生物物质在按照本发明的构建体已经施用之后添加。转化这样的药物前体的酶和这样的酶的基因的例子在WO96/06940和WO96/06941和前述章节中描述。5.2.2传染病的预防在一个实施方案中，活性物质可以为对病原体特异的抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，活性物质可以是蛋白质，该蛋白质由病原体形成并通过免疫应答(即通过抗体结合和/或细胞毒性淋巴细胞)导致中和和/或杀死病原体。这种类型的中和抗原已经用作免疫抗原(参见Ellis的回顾，Adv.Exp.Med.Biol.327，263(1992))。编码这样的蛋白质的DNA序列用来制备按照本发明的构建体。这些基因的例子在WO96/06941中描述，例如，编码下列物质的基因流感A病毒抗原、HIV抗原、狂犬病毒抗原、HSV(单纯疤疹病毒)抗原、RSV(呼吸道合胞体病毒)抗原、副流感病毒抗原、轮状病毒抗原、VZV(水痘带状疱疹病毒)抗原、CMV(巨细胞病毒)抗原、麻疹病毒抗原、HPV(人乳头肿瘤病毒)抗原、HBV(肝炎B病毒)抗原、HCV(肝炎C病毒)抗原、HDV(肝炎D病毒)抗原、HEV(肝炎E病毒)抗原、HAV(肝炎A病毒)抗原、霍乱弧菌抗原、布氏疏螺旋体抗原、幽门螺杆菌抗原、疟疾抗原或抗独特型抗体或其抗体结合片段，其互补决定区是传染性有机体的中和抗原的蛋白质或糖类结构的拷贝。6.用于白血病和肿瘤治疗的活性物质6.1.用于白血病和肿瘤的激活物序列的选择所提供的激活物序列可以是启动子或增强子序列，以此形成转录因子或在白血病细胞或肿瘤细胞相互作用中有活性。然而，本发明所用的优选的激活物序列包括基因调节的序列和基因元件，这些基因编码特别在肿瘤细胞或白血病细胞中形成的蛋白质。例子在WO96/06941中引用，例如，编码c-myc、HSP-70、bcl-1/细胞周期蛋白D-1、bcl-2、IL-6、IL-10，NFα、TNFβ、HOX-11、BCR-Abl、E2A-PBX-1、PML-RATA(前髓细胞白血病-视黄酸受体)、c-myc、N-CAM-蛋白质，肝炎生长因子受体、L-丝束蛋白或多形上皮粘蛋白(PEM)的基因的启动子。6.2.用于白血病和肿瘤细胞的活性物质的结构基因的选择用于这个目的的活性物质一般是指这样的蛋白质，该蛋白质抑制细胞的增殖，特别的也抑制肿瘤细胞或白血病细胞的增殖。这些细胞增殖抑制剂包括，例如，已经描述过的编码抑制性的、细胞抑制、编程性细胞死亡和细胞毒性蛋白质以及用于裂解药物前体的酶的DNA序列。细胞增殖抑制剂还指DNA序列，它表达直接或间接地对白血病或肿瘤有细胞抑制或细胞毒性作用的蛋白质。这样的蛋白质已经在前面的章节中描述。编码这样的蛋白质的DNA序列可以用来制备按照本发明的构建体。细胞增殖抑制剂一般还指编码这样的蛋白质或肽的DNA序列，该蛋白质或肽诱发对肿瘤有细胞毒性或细胞抑制作用的体液或细胞免疫应答。这样的蛋白质或肽包括，例如，肿瘤疫苗的结构基因。此处包括在肿瘤细胞上的抗原。例如，这样的抗原由Sedlacek等，Contrib.toOncol.32，KargerVerlag，Munchen(1988)和Contrib.toOncol.43，KargerVerlag，Munchen(1992)回顾。其它例子是抗原或编码SialylLewis、肿瘤细胞上的肽(可由T细胞识别)、致癌基因表达的蛋白质的基因、血型抗原及其前体、多形上皮粘蛋白的抗原或热激蛋白的抗原。7.用于在血管阻塞中抑制平滑肌细胞增殖的活性物质7.1.用于平滑肌细胞的激活物序列的选择在一个实施方案中，激活物序列可以是基因调节的序列或基因元件，这些基因编码特别在平滑肌细胞中形成的蛋白质。编码这样的蛋白质的基因的启动子的例子在WO96/06938和WO96/06940中描述。这些包括原肌球蛋白、α-肌动蛋白、α-肌球蛋白，PDGF受体、FGF受体、MRF-4、磷酸果糖激酶A、肌钙蛋白C、肌细胞生成素、内皮素A受体、结蛋白、VEGF或人工启动子。进而，Helix-Loop-Helix(HLH)家族的因子(MyoD、Myf-5、肌浆蛋白MRF4)和Zinkfinger蛋白质GATA-4被描述成肌肉特异性转录激活物。HLH蛋白质以及GATA-4不仅在肌肉特异性基因启动子上而且在异源角度上显示出肌肉特异性转录，例如，在人工启动子上。这样的人工启动子例如5’-AGCAGGTGTTGGGAGGC-3’(SEQIDNO.3)的多个拷贝(例如，4×)或5’-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG-3’(SEQIDNO4)的多个拷贝。7.2.平滑肌细胞活性物质的结构基因的选择用于这个目的的活性物质一般指这样的蛋白质，该蛋白质抑制平滑肌细胞的增殖。这些增殖抑制剂的例子在前面的章中已经描述。8.抑制或活化凝固的活性物质8.1.抑制或活化凝固的激活物序列的选择用于这个目的的激活物序列一般可以是基因调节的序列或基因元件，这些基因编码可在平滑肌细胞中、活化的内皮细胞中、活化的巨噬细胞中或活化的淋巴细胞中检测到的蛋白质。8.1.1平滑肌细胞在平滑肌细胞中的基因的启动子序列的例子已经在WO96/06938中和前面的章中论及。8.1.2.活化的内皮细胞或与活化的内皮细胞邻近的细胞特别在活化的内皮细胞中形成的蛋白质的例子已经在WO96/06938和WO96/06940和前面的章中描述。8.1.3.活化的巨噬细胞和/或活化的淋巴细胞用于这个目的的激活物序列一般是指启动子序列，该启动子序列得自编码巨噬细胞和/或淋巴细胞免疫应答期间大量形成的蛋白质的基因。例子已经在WO96/06941和WO96/06938和前面的章中描述。8.2.用于抑制或活化凝固或调节心血管系统的活性物质的结构基因的选择在一个实施方案中，用于这个目的的活性物质可以是直接或间接抑制血小板聚集或凝固因子或刺激纤维蛋白溶解作用的蛋白质。这样，这种类型的活性物质被称作抗凝剂。所使用的抗凝剂是，例如下列物质的基因血纤维蛋白溶酶原激活物(PA)、例如组织PA(tPA)或尿激酶样PA(uPA)或tPA和uPA的杂合体或蛋白质C、抗凝血酶III、C-1S抑制剂、α1抗胰蛋白酶、组织因子途径抑制剂(TFPI)或水蛭素。在另一个实施方案中，用于该目的的活性物质也可以是促进血液凝固的蛋白质。这样的蛋白质的例子是，例如，血浆蛋白质，如因子VIII、因子IX、vonWillebrand因子、FXIII、PAI-1或PAI-2。在第三个实施方案中，用于这个目的的活性物质也可以是通过诱导血管形成或降低血压调节心血管系统的蛋白质。编码这样的蛋白质的基因的例子是血管形成因子，例如，VEGF或FGF或降低血压的肽，例如，激肽释放酶或内皮细胞“氧化氮合酶”。在另一个实施方案中，用于这个目的的活性物质可以是编码血液蛋白质的基因。这样的血液蛋白质的例子是清蛋白、C1-灭活剂、血清胆碱酯酶、运铁蛋白或1-抗胰蛋白酶。9.用于保护以免CNS破坏的活性物质9.1用于保护以免CNS破坏的活性物质的激活物序列9.1.1在内皮细胞中活化的激活物序列在一个实施方案中，这种类型的激活物可以包括对内皮细胞特异的蛋白质的基因的启动子序列。这些启动子序列的例子在WO96/06939中列出，并已经在前面的章中描述。9.1.2在神经胶质细胞中活化的激活物序列一个优选的激活物序列是启动子或增强子序列，以此形成转录因子或在神经胶质细胞的相互作用中有特定程度的活性。这些激活物序列的例子在WO96/06939中列出。这些包括编码下列物质的基因的启动子施旺细胞特异性蛋白质periaxin、谷氨酰胺合成酶、神经胶质细胞特异性蛋白质(神经胶质原纤维酸性蛋白＝GFAP)、神经胶质细胞蛋白质S1OOb、IL-6(CNTF)、5-HT-受体、TNFα、IL-10、胰岛素样生长因子受体I和II或VEGF。9.2.神经特异性因子的结构基因的选择用于本发明的目的的“神经特异性因子”可以是编码神经元生长因子或TNFα抑制剂的DNA序列。这些基因的例子在WO96/06939中列出。这些包括编码下列物质的基因FGF、神经生长因子(NGF)、脑衍生的神经营养性因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)、睫状神经营养性因子(CNTF)、TGFβ、可溶性TNF受体、IL-10、IL-10抑制素(inhibites)、可溶性的IL-1受体、IL-1受体I、IL-1受体II、IL-1受体拮抗物或可溶性IL-6受体。按照本发明的构建体优选地施用或注射进破坏的组织、破坏的神经区域或脊髓或脑以转导内皮细胞或神经胶质细胞以表达治疗蛋白质。10.治疗用途作为例子，在上面提到的部分中描述的构建体可以施用给需要治疗疾病的患者，这些疾病，例如，肿瘤、白血病、炎症、其特征在于过度内皮细胞增殖的病症、血液细胞的缺乏产生、自身免疫性疾病、变态反应、移植器官的即将发生的排斥、关节炎、感染、凝固病症以及CNS破坏。对于施用，可以把描述的构建体按照技术人员熟知的技术插入到质粒载体或病毒载体中。载体可以局部运用于患者或注射进心血管系统(胸膜内、腹膜内、脑脊髓内、膀胱内、气管内、胃肠内)或注射进不同的组织或器官之一。万一构建体的结构基因编码把无毒的、无效的药物前体裂解或转化成药物的酶，该药物前体在注射本发明的构建体后运用于患者。本发明可借助于下列实施例与说明性的表详尽地解释，但是不限制本发明的范围。表的描述表1cdc25CCHR的结构-功能分析。分析cdc25C启动子构建体(基于C290；Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995))在CHR区的突变在NIH3T3细胞中的细胞周期调节。位置-16至-12代表以前定义的CDE(Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995))。瞬时荧光素酶测定的结果表达为RLUs的比(观察为生长细胞相对于静止细胞的活性)。在表中所显示的结果总结了利用至少两种独立的质粒DNA制剂的4个独立实验的数据。值代表平均值；在所有情况下标准差不高于±1,5。在每个实验中包括了SV40报道质粒以使诱导因子标准化(SV40报道基因典型地给出生长细胞高于静止细胞1.5倍的值)。表1突变构建体.</tables>表2B-mybE2FBS-CHR组件和cdc25CCDE-CHR基元之间的特异性核苷酸交换对细胞周期调节与E2F和CDF-1复合物的DNA结合的作用。B-myb和cdc25C抑制组件在顶端显示。序列相互不同的五个位置指定为1-5区。下面指出的每个突变体携带在B-myb(上段)或cdc25C(下段)启动子背景下的两个启动子之间的特异性交换。“B”和“C”表明特定的突变型是在1-5区中包含cdc25C(C)还是B-myb(B)核苷酸(例如，B-C1是在第1区中包含cdc25C核苷酸的B-myb序列)。细胞周期调节首先通过比较野生型和突变型构建体在静止NIH3T3细胞中的活性来测量。指定“抑制”的列总结了这种分析的结果。(+比突变型野生型＜2；-比突变型野生型＞3。然后分析功能启动子构建体在血清刺激的NIH3T3细胞中细胞周期调节的定时并测定半最大活性的时间。空心箭头表明清楚地不同于B-myb和cdc25C野生型启动子的动力学。CDF-1和E2F结合数据由EMSA以野生型和突变的B-mybE2FBS-CHR探针和野生型和突变的cdc25CCDE-CHR探针并利用HeLa细胞核提取物或部分纯化的CDF-1获得。为了显示特异的核苷酸改变对细胞周期调节的从B-myb和cdc25C启动子的转录的定时上的作用，用指定的构建体瞬时转染NIH3T3细胞，在G0通过除去血清使其同步并通过添加10％FCS来刺激。数据基于12个不同的实验(除了C-B1，2基于4个实验外)。对于每个构建体为了有利于比较半最大表达值，将在20小时的数据规格化为100。表2</tables>实施例1.材料和方法1.1.细胞培养、DNA转染和荧光素酶测定在用10％胎牛血清、青霉素和链霉素补充的Dulbecco-Vogt改进的Eagle培养基(DMEM)中培养NIH3T3细胞。将HeLa细胞培养在添加5％新生小牛血清的DMEM中。NIH3T3细胞用DEAE葡聚糖技术转染(Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995))。为了在G0同步化，在转染后将细胞在无血清的培养基中保持2天12小时，用10％FCS再刺激。利用SV40启动子驱动的报道基因构建体测定荧光素酶活性和使结果标准化按公开的方法进行(Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995))。1.2.序列分析和荧光素酶构建体cdc25C和B-myb启动子驱动的荧光素酶构建体由Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995)和Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995)描述。突变用PCR策略如前描述引入(Good和Nazar，核酸研究，20，4934(1992)；Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995))。通过利用双脱氧核苷酸链终止法使用测序酶(USB)或Tth聚合酶(Pharmacia)的DNA测序法检验了所有PCR-扩增的片段。1.3.EMSA电泳迁移率变动分析(EMSA)如所述完成(Zwicker等，科学271，1595(1996))。当使用部分纯化的CDF-1时，在缺少脱氧胆酸钠和NP-40的情况下实行EMSA。利用下列的双链探针-cdc25C-wt5’-ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGAATGGTCAA(SEQIDNO.5)(CDE黑体；CHR斜体)。在位置-19、-16、-13、-12和-11位置(表1)分别如描述那样突变了T1、T4、T7(也称作cdc25C-mCDE)、A8和C9(Zwicker等，核酸研究，23，3822，(1995))。-cdc25C-10/-75’-ACTGGGCTGGCGGActtgTTGAATGGTCAA(SEQIDNO.6)-cdc25C-6/-3(也称作cdc25C-mCHR)5’-ACTGGGCTGGCGGAAGGTggtcATGGTCAA(SEQIDNO.7)-cdc25C-1/+25’-ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGAAggtTCAA(SEQIDNO.8)-cdc25C-25’-ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGAcTGGTCAA(SEQIDNO.9).所有其它的寡核苷酸的序列(包括B-myb)在其它地方描述(Zwicker等，科学271，1595(1996))或在表2中指出。随机寡核苷酸包含一种无关的序列(Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995))。利用了下列的抗体E2F-1(SantaCruzSC-251X)、E2F-2(SantaCruzSC-632X)、E2F-3(SantoCruzSC-879X)、E2F-4(SantaCruzSC-512X)、E2F-5(SantaCruzSC-999X)、DP-1(从N.LaThangue获得)、DP-2(SantaCruzSC-830X)。1.4.CDF-1的部分纯化核提取物在蛋白酶抑制剂亮抑蛋白酶肽(50ng/ml)、胃蛋白酶抑制剂A(5μg/ml)和抑蛋白酶肽(80ng/m.)的存在下在高盐提取缓冲液中从HeLa悬浮培养物制备(Dignam等，核酸研究，11，1475(1983))。把包含两个串联cdc25CCDE-CHR基元的生物素化的寡核苷酸偶连到链霉抗生物素蛋白琼脂糖上并用于利用与EMSA相同的条件(见上，除了用鲑精DNA代替聚(dAdT)作为非特异性竞争剂)的亲和色谱法(Kadonaga和Tjian，PNAS83，5889(1986))。洗脱通过逐步增加KCl的浓度至1M进行。1.5.体外DMS足迹法编码链cdc25C寡核苷酸的体外DMS足迹法如所描述的进行(Zwicker等，科学271，1595(1196))。1.6.稳定的转染子的基因组足迹法为了稳定的细胞系的产生，将野生型cdc25C荧光素酶构建体C290和CHR突变的C290mCHR5/6(TTTGAA突变成TagGAA)插入pAGLu载体(这种载体包含基质附着区(SAR))并通过电穿孔法引入NIH3T3细胞。将稳定转染的克隆在G418选择下分离并分析在静止细胞和生长细胞中荧光素酶表达。扩张具有期望的表达方式的克隆并如所描述的(Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995))通过基因组足迹法分析(Pfeifer等，科学246，810(1989))，所不同的是第一引物(P1)对荧光素酶基因5’-GTAACACAAAGGAATTCAAGC(SEQIDNO10)是特异性的。2.结果2.1CDF-1的鉴定2.1.1cdc25CCHR的鉴定前不久CDE的共有序列被定义为G/CGC/TGG/C(在cdc25C中的GGCGG)(Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995))。然而，对于CHR，这样的信息目前还没有。为了描绘CHR的边界并鉴别关键的核苷酸位置，许多突变被引入到cdc25C启动子的CHR中，这些突变型构建体的功能通过测量其在NIH3T3细胞中(在G0中同步)的抑制来分析。在表1中的数据清楚地显示CHR从-7扩展至-2，在这个区中的所有核苷酸位置是必须的。相反地，CDE和CHR之间的核苷酸位置(-11至-8；AAGG)与CHR下游的核苷酸(≥1；TGG...)能改变而对抑制剂功能无可检测到的作用。这样cdc25CCHR可定义作序列TTTGAA。2.1.2.体内CDE占据依赖于完整的CHR以前的数据清楚地显示在不同的启动子中的CDE和CHR以协同的方式起作用，因为在任何元件的突变在G0会破坏抑制(Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995))。这可以指相互作用的因子协同结合到两个元件上。这个问题通过携带cdc25C启动子构建体(在CHR中具有灭活的突变(cdc25C-mCHR5/6TTTGAA改变成TagGAA))的稳定转染的NIH3T3细胞系的基因组足迹法澄清。期望的保护方式可在稳定表达野生型cdc25C启动子构建体的对照系中观察到。相反地，携带具有CHR突变的cdc25C启动子的细胞系没有在CDE和突变的CHR区中显示任何保护，同时用于NF-Y的两个组成性上游结合位点的占据(Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995))在突变型启动子中没有改变。这样，必然得到这样的结论CDE占据依赖于完整的CHR，这表明在细胞之内的协同结合。这样的结论得到下列观察结果支持在cdc25C启动子中的CDE和CHR之间的5bp或10bp的插入除去了抑制。2.1.3.CDF-1的鉴别HeLa细胞的核提取物的电泳迁移率变动分析(EMSA)导致活性的鉴别，这种活性以协同方式和cdc25C启动子的CDE和CHR相互作用。此外，这种活性结合到突变型抑制剂元件强烈地与这些元件的功能特性相关。表现出类似野生型的抑制功能的突变型(在-19中T代替G；在-11中C代替A或-1/+2的缺失)显示出在结合测定中和野生型序列相同的竞争(自身竞争)能力。相反地，导致在G0细胞中减少的或削弱的抑制的在CDE(在-16中T代替G；在-13中T代替G或在-12中A代替G)或CHR(-10/-1的缺失，-6/-3的缺失或在-2中C代替A)中的其它突变型显示了竞争结合能力的缩小。观察的协同结合与通过结构-功能分析建立的相互关系一起与CDE-CHR结合因子的期望的特性一致。这种活性称为CDF-1。2.1.4CDF-1接触在大沟中的CDE以及在小沟中的CHR为了获得在体内CDF-1是与抑制剂单元相互作用的活性的其它证据，CDF-1与DNA的相互作用由体外甲基化保护足迹法分析。先前显示体内CDE在大沟中接触，同时CHR在小沟中占据(Zwikker等，EMBO杂志，14.4514(1995))。通过上链的体外足迹法获得了十分类似的结果。在CDE中的四个G-残基被特异性地保护(这表明大沟接触(N-7))，在CHR中的两个A-残基也特异性地被保护(这表明小沟接触(N-3))。体外CDF-1和CDE-CHR之间的相互作用的方式这样充分地与细胞内所作的观察协调。2.1.5.CDF-1与包含CDE-CHR组件的多个启动子的相互作用以前的研究显示功能性CDE-CHR组件存在于不同的启动子中，包括cdc25C、cdc2以及细胞周期蛋白A(Zwicker等，EMBO杂志，14，4514(1995))。此外，结合位点的类似的配置在B-myb启动子中发现，其中具有与cdc25CCDE相同的核心序列的E2F位点紧接着定位在类似CHR元件的上游(Bennett等，致癌基因13，1073(1996)；Zwicker等，科学271，1595(1996))。因此，研究上面鉴定的CDF-1活性是否与这些启动子中抑制剂位点相互作用具有明显的吸引力。可以发现两个包含CDE-CHR的启动子(即cdc2和细胞周期蛋白A)作为cdc25C启动子以类似的效能结合CDF-1活性。在所有的三种情况下，结合依赖于结合到CDE和CHR两者的协同结合，因为在任何一个位点的突变(参见材料和方法)削弱与cdc25C探针的竞争。虽然一些竞争可在更高的竞争剂浓度观察到，以相同比率的探针∶竞争剂(1∶20)通过B-myb启动子E2FBS-CHR组件的竞争不明显。CDF-1活性显示出与所有三种包含CDE-CHR的启动子的特异性和强烈的相互作用的事实提供了本研究中鉴定的活性相关性的其它证明。2.1.6.CDF-1不包含已知的E2F家族成员鉴于CDE和E2FBS的相似性，寻求研究上述鉴定的CDF-CHR活性是否包含已知的E2F或DP家族成员。为此，在针对特异的DP和E2F蛋白质的抗体的存在下进行EMSA。所有这些抗体在不同的组合中显示出诱导超转变(supershifts)或消灭E2F/DP的结合。然而，可以清楚地显示没有一种所利用的抗体影响CDF1-DNA复合物的形成，这表明CDF-1不包含任何已知的E2F或DP家族成员。2.2.确定优选的E2F或CDF-1或E2F和CDF-1结合的核苷酸的鉴别核苷酸序列结合E2F和CDF-1的鉴别由于下列事实而复杂化DP/E2F和CDF-1复合物在EMSA中显示出十分类似的电泳迁移率。因此，利用20bpcdc25CCDE-CHR序列通过DNA-亲和色谱法分级分离HeLa核提取物(详见材料和方法)。这种方法产生部分纯化的CDF-1，它与在粗提取物中的CDF-1显示出十分类似的结合特性并给出CDF-1从E2F结合活性中的完全分离。为了分析E2F复合物，把cdc25CCDE-CHR竞争寡核苷酸包括在结合反应中以阻止放射性标记的CDF-1复合物的形成。为了确定DP/E2F与CDF-1的结合位点，把特异的核苷酸在B-myb和cdc25C启动子之间五个特异区之间交换，其中在该区中抑制组件相互不同(在表2的顶端指示为1-5)。首先试验相应的序列的E2F结合(即在HeLa核提取物中DP1/E2F-1、-3和-4的结合)与和部分纯化的CDF-1的相互作用。该研究产生了两个清晰的结果。1.位于CDF或E2FBS的核心的侧翼的核苷酸(1和2区)在E2F结合中起着十分重要的作用。相对地，相同的残基不明显地影响CDF-1的结合。当在第1区中的核苷酸(在B-myb中的CT)影响DP1/E2F-4(表2中的B-C1)的最大结合，在第2区的G-残基对与所有E2F复合物的相互作用来说至关紧要(在表2中的B-C，2和B-C2)。与这个结论一致，B-myb第1和2区(而不仅是第1区)的导入使cdc25CCDE具有以高效率与DP1/E2F-1、-3和-4复合物相互作用的能力(表2中的C-B1，2)。相对地，在E2FBS核心或CDE周围的这些核苷酸变化没有一个影响CDF-1的结合(在表2中的B-C1和B-C1，2；B-C和C-B1和C-B1，2)。2.转变对CDF-1结合来说是真实的当不影响E2F结合时，CHR的结构对CDF-1结合有巨大影响，并在这点上第4区是至关紧要的。这样，在cdc25C和B-myb之间的这个区中的两个寡核苷酸的交换导致CDF-1结合到B-myb启动子的强烈的增加(表2中的B-C4)，而同时转变交换破坏了CDF-1结合到cdc25C启动子(表2中的C-B4)。相对地，在第4区中的CHR改变不影响E2F复合物的结合。由于形式上它是可能的Bmyb-CHR超出了cdc25CCHR确定的边界，在这些位置(表中的3和5区)中两个启动子不同，不能排除的是由于不完全的Bmyb-CHR，C-B4没有与CDF-1相互作用。因此，在3和5区中发现的B-myb核苷酸也引入cdc25C序列(除了在第4区中的改突外)(表2中的C-B3，4、C-B3，4，5和C-B4，5)。然而，这些其它的改变仅能使CDF-1结合恢复到边际程度，这确认Bmyb-CHR和cdc25C-CHR序列对于相互作用的蛋白质不等同。最后分析以上所观察的E2F和CDF-复合物与B-myb和cdc25C的不同相互作用如何影响细胞周期调节的转录抑制和调节的定时。把试验E2F和CDF-1结合的相同序列引入B-myb和cdc25C启动子荧光素酶构建体，并且在血清刺激的NIH3T3细胞(已在G0同步化)中试验活性。在表2中的数据显示在类似野生型CDF-1结合存在下，E2F结合到B-myb启动子的取消会削弱在G0中的抑制(参见B-C1，2)。这个观察强烈地表明E2F而非CDF-1复合物引起B-myb基因细胞周期调节的转录，这与CDF-1对B-myb启动子比较低的亲和力是一致的。相对地，可以发现cdc25CCDE的突变(取消CDF-1结合)也削弱细胞周期调节。同样地，以B-myb取代cdc25C除去CDF-1结合以及在G0的抑制(在表2中的C-B4；C-B3，4和D-B3，4，5)。在B-myb启动子背景(B-C4)中携带cdc25CCHR的转变构建体显示出中间细胞周期动力学，即，转录的去阻遏相对于野生型B-myb延迟3小时。2.3.用于按照本发明的基因治疗的基因构建体构建及应用的实施例选择的基因构建体有下列DNA组分(按下游方向列出，从5’至3’)SV40的启动子/早期增强子区(核苷酸48至5191；Tooze(ed.)，DNA肿瘤病毒(冷泉港，纽约，纽约，冷泉港实验室；Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995))，结合至SEQIDNO1上，后者结合至序列GCCACC上(Kodak，细胞生物学杂志，108，229(1989))，后者结合至免疫球蛋白的信号肽的cDNA上(核苷酸序列≤63至≥107；Riechmann等，自然，332，323(1998))，后者结合至β-葡糖苷酸酶的cDNA上(核苷酸序列≤93至≥1982；Oshima等，PNASUSA84，665(1987))。将基因构建体克隆进pUC18/19质粒载体中。基因构建体的不同组分的联接经由适合的位点制造，该位点通过PCR扩增保存在每个组分的末端。此外，利用对选择的限制位点特异的连接酶。这些连接酶有市售并为本领域技术人员所知道。按照由Lucibello等(EMBO杂志，14，132(1995))描述的方法用上述的质粒转染培养的人脐带内皮细胞(HuVEC)。由HuVECs产生的β-葡糖苷酸酶的量通过利用4-甲基鏾形酮基(methylumbelliferyl)-β-葡糖苷酸作为底物测量。为了试验细胞周期特异的特异性，将内皮细胞在G0/G1通过甲硫氨酸缺乏48小时同步化。细胞的DNA含量在用Hoechst33258染色后通过FACS分析测量(Lucibello等，EMBO杂志，14，132(1995))。获得了下列结果1.相对于未转染的HuVECs，转染的HuVECs分泌多得多的β-葡糖苷酸酶。2.增殖的HuVECs(DNA＞2S)比在G0/G1中同步化的HuVECs分泌明显更多的β-葡糖苷酸酶。3.因此，SEQIDNO1导致在用上述的基因构建体转染的HuVECs中β-葡糖苷酸酶的细胞周期特异性表达。序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名HoechstAktiengesellschaft(B)街道-(C)城市Frankfurt(D)州-(E)国家Deutschland(F)邮政编码(ZIP)65926(G)电话069-305-3005(H)电信069-35-7175(I)电传41234700(ii)发明题目用于结构基因的细胞周期调节表达的核酸构建体(iii)序列数14(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBMPC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件WordPerfect5.1furMS-DOS(2)关于SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词启动子(B)位置1..20(xi)序列描述SEQIDNO1ACTTGGCGGGAGATTTGAAT20(2)关于SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词启动子(B)位置1..20(xi)序列描述SEQIDNO2GCTTGGCGGGAGGTTTGAAT20(2)关于SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词启动子(B)位置1..17(xi)序列描述SEQIDNO3AGCAGGTGTTGGGAGGC17(2)关于SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词启动子(B)位置1..41(xi)序列描述SEQIDNO4GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG41(2)关于SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词启动子(B)位置1..30(xi)序列描述SEQIDNO5ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGAATGGTCAA30(2)关于SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词启动子(B)位置1..30(xi)序列描述SEQIDNO6ACTGGGCTGGCGGACTTGTTGAATGGTCAA30(2)关于SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词启动子(B)位置1..30(xi)序列描述SEQIDNO7ACTGGGCTGGCGGAAGGTGGTCATGGTCAA30(2)关于SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词启动子(B)位置1..30(xi)序列描述SEQIDNO8ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGAAGGTTCAA30(2)关于SEQIDNO9的信息(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词启动子(B)位置1..30(xi)序列描述SEQIDNO9ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGACTGGTCAA30(2)关于SEQIDNO10的信息(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词启动子(B)位置1..21(xi)序列描述SEQIDNO10GTAACACAAAGGAATTCAAGC21(2)关于SEQIDNO11的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词外显子(B)位置1..21(xi)序列描述SEQIDNO11GGCTGGCGGAAGGTTTGAAT20(2)关于SEQIDNO12的信息(i)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词启动子(B)位置1..21(xi)序列描述SEQIDNO12GGCTGGCGGAAGGTTTGAATGGCTGGCGGAAGGTTTGAAT40(2)关于SEQIDNO13的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词启动子(B)位置1..21(xi)序列描述SEQIDNO13ACTTGGCGGGAGATAGGAAA20(2)关于SEQIDNO14的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(ix)特征(A)名称/关键词启动子(B)位置1..21(xi)序列描述SEQIDNO14GGCTGGCGGAAGGTTTGAAT权利要求1.一种核酸构建体，该核酸构建体包含a)至少一种激活物序列；b)至少一种嵌合启动子组件，该组件包含结合E2F家族的蛋白质和CDF-1家族的蛋白质的核苷酸序列；c)至少一种结构基因，其中所说的嵌合启动子组件引起细胞周期中基因表达的正调节，它比B-myb启动子迟，但比cdc25C启动子早。2.如权利要求1所要求的核酸构建体，其中所说的激活物序列是所说的嵌合启动子组件的上游。3.如权利要求1或2所要求的核酸构建体，其中所说的嵌合启动子组件包含至少一种核苷酸序列，该核苷酸序列选自由ACTTGGCGGGA-GATTTGAAT(SEQIDNO1)和GCTTGGCGGGAGGTTTGAAT(SEQIDNO2)组成的组。4.如权利要求1-3中任一项所要求的核酸构建体，其中所说的嵌合启动子组件与所说的激活物序列相互作用，其中所说的相互作用影响所说的结构基因的表达。5.如权利要求1-4中任一项所要求的核酸构建体，其中所说的激活物序列是细胞特异性的、代谢特异性的或病毒特异性的。6.如权利要求5所要求的核酸构建体，其中所说的细胞特异性激活物序列在选自由下列细胞组成的组的细胞中活化内皮细胞、浆膜细胞、平滑肌细胞、肌肉细胞、滑膜细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、白血病细胞、肿瘤细胞、角化细胞和神经胶质细胞。7.如权利要求5所要求的核酸构建体，其中所说的病毒特异性激活物序列是启动子或增强子序列，该启动子或增强子序列来源于选自由HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV、CMV、SV40和HIV组成的组的病毒。8.如权利要求1至7中任一项所要求的核酸构建体，其中所说的结构基因编码一种酶或者在配体和转化或裂解药物前体产生药物的酶之间的一种融合蛋白。9.如权利要求6至12中任一项所要求的核酸构建体，其中所说的结构基因编码一种物质，该物质选自由下列物质组成的组细胞因子、生长因子、细胞因子受体、生长因子受体、具有抗增殖作用的蛋白质、具有编程性细胞死亡作用的蛋白质、具有细胞抑制作用的蛋白质、具有细胞毒性作用的蛋白质、具有炎性作用的蛋白质、具有抗炎作用的蛋白质、具有免疫抑制作用的蛋白质、抗体、抗体片段、血管生成抑制剂、凝固因子、纤维蛋白溶解化合物和抗凝剂、血液蛋白质、病毒抗原、细菌抗原和肿瘤抗原以及在配体和上述物质之一之间的融合蛋白。10.如权利要求8或9中所要求的核酸构建体，其中所说的配体选自由生长因子、细胞因子以及抗体组成的组。11.如权利要求1-10中任一项所要求的核酸构建体，其中所说的核酸是DNA。12.如权利要求1-11中任一项所要求的核酸构建体，其中所说的构建体在5’-3’方向包含下列组分结合到包含序列ACTTGGCGGGAGATTTGAAT(SEQIDNO1)的DNA片段上的SV40的启动子/早期增强子区的核苷酸48至5191，所说的含SEQIDNO1的DNA片段结合到编码免疫球蛋白的信号肽的核苷酸63至107上，而后者结合到β-葡糖苷酸酶的cDNA的核苷酸93至1982上。13.一种载体，该载体包含如权利要求1-12中任一项所要求的核酸构建体。14.在权利要求13中所要求的载体，其中所说的载体是非病毒载体。15.在权利要求13中所要求的载体，其中所说的载体是病毒载体。16.一种细胞，该细胞包含如权利要求1-12中任一项所要求的核酸构建体或如权利要求13-15中任一项所要求的载体。17.一种用于制备如权利要求1-12中任一项所要求的核酸构建体或如权利要求13-15中任一项所要求的载体的方法，其中分步连接所说的构建体的元件。18.如权利要求1-12中任一项所要求的核酸构建体或如权利要求13-15中任一项所要求的载体在制备药物上的用途，该药物用于治疗肿瘤疾病、白血病、心血管疾病、炎症反应、自身免疫疾病、变态反应、关节炎、牛皮癣病、移植器官的即将发生的排斥、CNS破坏、传染病、血液凝固病症和/或慢性病毒感染。19.可由下列步骤获得的CDF-1蛋白质(a)从HeLa细胞制备核提取物，和(b)通过在包含CDE-CHR序列基元的寡核苷酸存在下的亲和色谱法纯化步骤(a)的提取物。20.按照权利要求19的CDF-1蛋白质，其中所说的CDE-CHR序列基元包含序列GGCTGGCGGAAGGTTTGAAT。21.按照权利要求19的CDF-1蛋白质，其中所说的CDE-CHR序列基元包含序列GGCTGGCGGAAGGTTTGAATGGCTGGCGGAAGGTTTGAAT。22.按照权利要求19-21中任一项的CDF-1蛋白质，其中所说的寡核苷酸与琼脂糖偶联。23.按照权利要求19-22中任一项的CDF-1蛋白质，其中所说的核提取物通过HeLa细胞的盐提取制备。24.按照权利要求19-23中任一项的CDF-1蛋白质在鉴定CDF-1的抑制剂或刺激剂上的用途。全文摘要本发明涉及一种核酸构建体以及蛋白质CDF－1,所说的核酸构建体包含至少一种激活物序列、至少一种嵌合启动子组件(该组件包含结合E2F家族的蛋白质和CDF－1家族的蛋白质的核苷酸序列)、至少一种结构基因,其中所说的嵌合启动子组件引起细胎周期中基因表达的正调节,它比B－myb启动子迟,但比cdc25C启动子早。文档编号C12N15/09GK1197077SQ9810692公开日1998年10月28日申请日期1998年2月17日优先权日1997年2月18日发明者R·穆勒,N·刘,J·威克尔,H－H·塞德拉克申请人:赫彻斯特股份公司