专利名称：小核酸的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及干扰RNA(例如微小RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA))和其它短核酸分子的组合物及其检测和表征地方法。更加特别地，本发明涉及干扰RNA表达的检测和定量分析的改进的方法。本发明更进一步地提供了miRNA和siRNA的变异体和类型的检测。
背景技术：
微小RNA(miRNA)是一种新类型的非编码RNA，无脊椎动物和脊椎动物基因组中它们被编码为短的反向重复序列(Ambros，(2001)细胞(Cell)107，823-826；Moss(2002)当代生物学(Curr Biol)12，R138-R140)。miRNA是靶mRNA翻译和稳定性的调节子，尽管多数靶mRNA有待鉴定。miRNA通过结合于3′端非翻译区域(UTRs)中反义互补位点序列特异性地控制靶mRNA的翻译(Ambros，如前；Moss，如前；Lagos-Quintana等人，(2001)科学(Science)294，853-858；Lau等人，(2001)科学(Science)294，858-862；Lee等人，(2001)科学(Science)294，862-864)。
一些miRNA，例如let-7RNA、miR-1、miR-34、miR-60和miR-87，在无脊椎动物和脊椎动物之间是高度保守的，暗示它们可以识别推测保守功能的多重位点和/或多重靶(Lagos-Quintana等人，如前；Lau等人，如前；Lee等人，如前；Pasquinelli等人，(2000)自然(Nature)40886)。小暂时RNA(stRNA)lin-4和let-7代表了通过华丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的基因分析鉴定出来的miRNA的一个亚型(subclass)，它们是受发育调节的并且它们自己控制发育程序，例如神经再接(neuronal rewiring)的时间选择、Daucer幼虫的形成、阴户形成以及皮下细胞的终末分化。
miRNA一般是从60或70个核苷酸折返(foldback)RNA前体结构剪切来的，它们有时候在miRNA前体的表达开始时(Grishok等人，(2001)细胞(Cell)106，23-34；Hutvagner等人(2001)科学(Science)93，834-838；Ketting等人，(2001)基因发育(Genes Dev)15，2654-2659)或非常丰富的miRNA的表达过程中(Lagos-Quintana等人，如前；Lau等人，如前；Lee等人，如前)被检测到。通常，只有发夹前体分子的一条链被剪切并且蓄积，推测大概是因为它被相关蛋白质保护而免受RNA降解。这些推测的蛋白质可以介导翻译的抑制。miRNA前体处理反应需要Dicer RNAsein和Argonaute家族成员(Grishok等人，如前；Hutvagner等人，如前；Ketting等人，如前)。
除了它们对基因表达的影响外，这些通常在21-22个核苷酸范围内的小RNA，可以在治疗和药物发现领域内找到用途，例如作为药物靶或作为药剂。因而，在一些情形下，了解细胞中大约多少个每种miRNA存在是重要的。在一些情况下，更进一步地比较不同组织类型中或例如化学或物理干预的刺激剂应用之前和之后miRNA的水平是重要的。因为有关的siRNA和miRNA在细胞中可以以很低的量存在，期望既敏感又特异的检测方法。此外，对于某些应用，鉴定适合于高通量筛选的方法例如均相测定法、复合测定法或适合于高度平行自动化操作和有限制的温度变化的那些方法是有利的。
尽管miRNA在基因表达的调节中有很重要的作用，一直缺乏miRNA表达的检测和定量分析的有效技术。至今，用于miRNA定量分析的主要方法以凝胶电泳为基础。所述miRNA通过Northern印迹或通过放射性抗RNase双体(duplexes)的存在进行检测。Northern印迹和芯片杂交法具有相对低的分析敏感性(Krichevsky等人2003)，所以需要微克质量的RNA用于检测；此外，小RNA转移到过滤器能够引发定量分析重现性的问题，并且一般不可修正用于高通量。此外，基于RNase抗性的检测方法需要高放射性的探针。更进一步地，只是基于探针杂交的方法不会提供序列密切相关的同型物之间的足够的区别。替代的方法包括克隆所述miRNA，然后对所述插入体测序。虽然这个方法适合于分辨密切相关的miRNA种类之间单个碱基的差别，但是它耗时且耗力。
象miRNA一样，小干扰RNA(siRNA)是经由称为RNA干扰(RNAi)(Cullen，B.R.，自然免疫学(Nature Immunology)，3597-599(2002))的反应参与细胞防御的小RNA分子，例如抗病毒RNA。一类siRNA通过Dicer酶和RNA诱导的沉默复合物(RISC)蛋白质复合物的作用而产生，作为响应于细胞内双链RNA存在的所述RNAi的一部分(Khvorova，A.等人，细胞(cell)115209-216(2003))。另一类siRNA是合成的，包含通常有特征性的二核苷酸伸出端的21-23个核苷酸的短双体，经由转染或从引入载体的表达直接引入细胞(Elbashir，S.M.等人，欧洲分子生物学会杂志(EMBO J.)206877-6888(2001))(Paul，C.P.等人，自然生物技术(NatureBiotechnology)20505-508(2002)，美国专利申请公开号2003/01481519A1，为了所有的目的此处整体引用作为参考)。在一些情况下，siRNA似乎一直是明确的序列，使得它们在功能和组成上与miRNA相似(Elbashir，S.M.等人，如前)。所需要的是检测和定量分析miRNA和siRNA水平有效的并且精确的方法。
发明概述
本发明涉及小核酸(例如干扰RNA和其它短核酸分子)的组合物及其检测和表征的方法。更加特别地，本发明涉及干扰RNA表达的检测和定量分析的改进的方法。
例如，本发明提供了一种方法，包括为了产生一个检测结构，将至少一种核酸(例如含有不互补于干扰RNA的序列的那个核酸)杂交于干扰RNA靶，以及检测所述检测结构。在一些实施方案中，所述干扰RNA靶是miRNA。在其它的实施方案中，所述干扰RNA靶是siRNA。在一些实施方案中，所述siRNAs是双链。
在一些实施方案中，所述检测结构包含侵入性切割结构(invasivecleavage structure)。例如，在一些实施方案中，所述核酸包含为了形成联合miRNA的侵入性切割结构而配置(configured)的第一和第二寡核苷酸。在一些实施方案中，所述核酸包含为了形成联合所述miRNA的侵入性切割结构而配置的第一寡核苷酸。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述3′部分为了杂交于所述靶序列而配置，并且其中所述5′部分为了不杂交于所述靶序列而配置。在一些采用第二寡核苷酸的实施方案中，所述第二寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述5′部分为了杂交于所述靶序列而配置，并且其中所述3′部分为了不杂交于所述靶序列而配置。在一些实施方案中，所述检测步骤包括INVADER试验的使用。
在一些实施方案中，所述检测结构包含杂交于所述小RNA的环状寡核苷酸以产生环形检测结构。在一些实施方案中，所述检测步骤包含滚环复制试验。
在一些实施方案中，所述检测步骤包括检测试验的使用，包括但不限于测序试验、聚合酶链式反应试验、杂交试验、采用互补于突变的探针的杂交试验、微阵列试验、珠子阵列试验、引物延伸试验、酶错配切割试验、分支杂交试验、NASBA试验、分子信标试验、循环探针试验、连接酶链式反应试验、侵入性切割结构试验、ARMS试验以及夹心杂交试验。在一些优选的实施方案中，所述检测步骤在细胞裂解物中进行。
在一些实施方案中，本发明的方法包含检测第二核酸靶。在一些优选的实施方案中，所述第二核酸靶是RNA。在一些特别优选的实施方案中，所述第二核酸靶是U6 RNA或GADPH mRNA。
在一些实施方案中，用于形成检测结构的核酸包含具有充分互补于小RNA的一个或多个位点的模板，以便于允许所述RNA杂交于所述模板并且在延伸反应中被延伸。在一些实施方案中，所述延伸反应是聚合酶链式反应，其中一个或多个RNA被用作聚合酶链式反应中的引物。在一些这样的实施方案中，为了提供聚合酶链式反应的引物，单一类型的RNA结合于模板上的两个位置。在其它的实施方案中，两个或两个以上的RNA被用作引物。在这样的实施方案中，扩增产物的检测表示样品中所述的两个或多个RNA的存在(即miRNA复合试验(miRNA multiplex assay))。相似的方法可被用于连接酶链式反应，这里所述miRNA被用作连接的寡核苷酸。
在一些实施方案中，所述方法包含多种miRNA的检测。在一些这样的实施方案中，多种miRNA包含相同miRNA的多态性。在其它的实施方案中，多种miRNA包含不同的miRNA(例如Let-7、miR-1、miR-1d、miR-135、miR-15、miR-16、miR-124a或miR125b)。
本发明也提供了用于实施上面方法中任何一个的试剂盒。例如，在一些实施方案中，本发明提供了包含为了当杂交于RNA靶序列时形成检测结构而配置的核酸的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒为了检测miRNA而配置。在一些优选的实施方案中，所述试剂盒为了检测Let-7、miR-1、miR-135、miR-15、miR-16、miR1b、miR-124a或miR125b的miRNA而配置。在一些优选的实施方案中，所述试剂盒为了共检测第二RNA靶和miRNA靶而配置。
图1显示单个反应中检测两个不同等位基因(例如一个核苷酸的不同)的INVADER寡核苷酸、探针寡核苷酸和荧光共振能量转移(FRET)盒的示意图。
图2显示用于本发明一些实施方案中所用的示例性检测结构。
图3显示用于本发明一些实施方案中所用的第二示例性检测结构。
图4显示用于本发明一些实施方案中所用的第三示例性检测结构。
图5显示用于本发明的示例性寡核苷酸。所述靶miRNA的碱基为加下划线的小写。探针或INVADER寡核苷酸中的DNA残基是正常字体的。小写字体指出了2′-氧-甲基的残基。
图6显示let-7的温度最优化实验的结果。
图7显示let-7的温度最优化实验的结果。
图8显示let-7的检测限(LOD)实验的结果。
图9显示使用let-7 miRNA的交叉反应性实验的结果。
图10显示miR-1 LOD实验的结果。
图11显示使用let-7 miRNA的CLEAVASE酶IX和XII比较的结果。
图12显示来自各种微生物的U6 RNA序列的部分序列比对。
图13显示mir-135的温度最优化实验的结果。
图14显示mir-135 LOD实验的结果。
图15含有细胞裂解物中let-7的检测得到的平均计数的图形表示。
图16显示经过或者未经过RNAse A处理的细胞裂解物中miRNA和mRNA的结果。
图17显示比较包括了全长的对于截短的捕集寡核苷酸的作用之侵入性切割试验的结果。
图18显示使用图16中描述的试验设计的温度最优化实验的结果。
图19显示了使用10聚体探针和12聚体INVADER寡核苷酸设计的温度最优化实验的结果。
图20显示比较了两个替代性寡核苷酸设计的LOD实验的结果。
图21显示比较了将探针和INVADER寡核苷酸中一些或所有2′-氧-甲基残基取代为2′-脱氧残基的作用的结果。
图22显示检测miR-124a的侵入性切割试验的结果。
图23显示检测分离自20个不同组织类型的总RNA中五种不同miRNA种类的实验的结果。
图24显示测试改变的探针和寡核苷酸长度对miRNA检测的作用的实验结果。
图25显示为了siRNA检测示例性侵入性切割寡核苷酸设计。小写残基表示2′-O-甲基。
定义
为了方便对本发明的理解，许多术语和短语定义如下
如此处使用地，术语“miRNA”指的是微小RNA。如此处使用的，术语“miRNA靶序列”指的是待检测的miRNA(例如，在其它核酸的存在下)。在一些实施方案中，miRNA靶序列是miRNA的变异体。
如此处使用地，术语“RNA检测结构”指的是通过核酸(例如，寡核苷酸)杂交于RNA靶，例如miRNA或siRNA，而形成的结构。在一些实施方案中，所述核酸是单核酸(例如，有一个小区域(或一些区域)同源于所述miRNA的较大的核酸)。在其它的实施方案中，所述核酸包含两种核酸(例如，杂交于所述miRNA以形成发夹(例如，单或双发夹)结构的核酸)。在优选的实施方案中，miRNA检测结构是能够使用已知的核酸检测方法进行检测的，包括但不限于此处公开的那些结构。
在一些实施方案中，RNA检测结构在杂交步骤之后被更进一步地修饰。例如，在一些实施方案中，杂交于所述RNA的所述核酸提供了用于通过核酸聚合酶延伸所述RNA的模板。所述RNA杂交于所述核酸并且然后使用所述聚合酶进行延伸。在其它的实施方案中，所述核酸起额外的核酸与所述RNA杂交和连接的模板作用。
术语“siRNA”指的是短干扰RNA。在一些实施方案中，siRNA包含一个双体或双链区域，这里所述双链区域的每一个链大约18至25个核苷酸长；所述双链区域能短至16个并长至29个碱基对，这里所述长度由所述反义链决定。通常siRNA在每一个链的3′末端含有大约两个至四个非配对的核苷酸。siRNA似乎在非脊椎动物和在脊椎动物中起引发RNA干扰以及在植物中在转录后基因沉默过程中起引发序列特异性RNA降解的关键中间物的作用。至少siRNA的双体或双链区域的一条链基本上同源于或基本上互补于靶RNA分子。互补于靶RNA分子的链是“反义”链；同源于靶RNA分子的链是“有义”链并且也互补于所述siRNA反义链。所述双链区的一条链不需要是相对链的精确长度，因而，一条链可以具有比相对链至少少1个核苷酸，形成相对链中的“泡”或相对链至少一个未配对的碱基。所述双链区域的一个链不需要精确地互补于所述相对链；因而，所述链(优选地所述有义链)可具有至少一个错配碱基对。
siRNA也含有额外的序列；这样的序列的非限制性实例包括连接序列或环，它们将所述双体区域的两个链连接起来。siRNA的这个形式可以指的是“si样RNA”、“短发夹siRNA”，(这里所述的短指的是所述siRNA的双体区域)或“发夹siRNA”。siRNA中存在的额外序列的另外的非限制性实例包括茎和其它折叠结构。所述额外序列可以有或可以没有已知的功能；这样的功能之非限制性实例包括siRNA分子增加的稳定性，或者提供细胞目的(destination)信号。
如此处使用地，术语“研究对象”和“患者”指的是任何生物体，包括植物、微生物和动物(例如哺乳动物例如狗、猫、家畜和人)。
如此处使用地，术语“INVADER试验试剂”或“侵入性切割试验试剂”指的是检测靶序列的一个或多个试剂，所述试剂包含在靶序列存在下能够形成侵入性切割结构的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述INVADER试验试剂更进一步地包含检测侵入性切割结构(例如切割试剂)存在的试剂。在一些实施方案中，所述寡核苷酸包含第一和第二寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含互补于靶核酸第一区域的5′部分，所述5′部分互补于位于第一部分下游并且邻近第一部分的靶核酸的第二区域。在一些实施方案中，第二寡核苷酸的所述3′部分包含不互补于靶核酸的3′末端核苷酸。在优选的实施方案中，所述第二寡核苷酸的3′部分由不互补于靶核酸的单核苷酸组成。在一些实施方案中，第一和第二寡核苷酸互相共价偶联(例如通过连接子)。
在一些实施方案中，所述INVADER试验试剂更进一步地包含固相支持物。例如，在一些实施方案中，所述试验试剂的一个或多个寡核苷酸(例如第一和/或第二寡核苷酸，桥接的或非桥接的)附着于所述固相支持物。在一些实施方案中，所述INVADER试验试剂更进一步地包含缓冲溶液。在一些优选的实施方案中，所述缓冲溶液包含二价阳离子的来源(例如Mn2+和/或Mg2+离子)。共同构成INVADER试验试剂的单独成分(例如寡核苷酸、酶、缓冲液、靶核酸)被称为“INVADER试验试剂组分”。
在一些实施方案中，所述INVADER试验试剂更进一步地包含第三寡核苷酸，其互补于第一靶核酸第一部分上游的靶核酸第三部分。然而在其它的实施方案中，所述INVADER试验试剂更进一步地包含靶核酸。在一些实施方案中，所述INVADER试验试剂更进一步地包含第二靶核酸。然而在其它的实施方案中，所述INVADER试验试剂更进一步地包含第三寡核苷酸，其包含互补于第二靶核酸第一区域的5′部分。在一些具体实施方案中，第三寡核苷酸的3′部分共价联接于第二靶核酸。在其它具体实施方案中，第二靶核酸更进一步地包含5′部分，其中第二靶核酸的所述5′部分是第三寡核苷酸。在其它的实施方案中，所述INVADER试验试剂更进一步地包含ARRESTOR分子(例如ARRESTOR寡核苷酸)。
如Eis等人，自然生物工程(Nature Biotechnology)，19673-676(2001)中描述地，完全碱基配对于每个探针的靶特异性区域并且部分配对于其5′flap区域的2′氧-甲基化的ARRESTOR寡核苷酸的包括，隔离了未切割的探针并且阻止了次级反应中X-结构的形成(此处整体引用作为参考)。
在一些优选的实施方案中，所述INVADER试验试剂更进一步地包含检测核酸切割产物的试剂。在一些实施方案中，所述INVADER试验试剂中的一个或多个寡核苷酸包含标记物。在一些优选的实施方案中，所述第一寡核苷酸包含标记物。在其它优选的实施方案中，所述第三寡核苷酸包含标记物。在特别优选的实施方案中，所述试剂包含用产生荧光共振能量转移(FRET)作用的基团标记的第一和/或第三寡核苷酸。
在一些实施方案中，一个或多个所述INVADER试验试剂以分发前(predispensed)的形式(即，用在没有重新测定或重新分发的程序中一个步骤的测定前的(premeasured))形式提供。在一些实施方案中，选择的INVADER试验试剂组分是“混合的”和“分发前的”在一起的。在优选的实施方案中，分发前的试验试剂组分是分发前的，并且提供在一个反应容器里(包括但不限于反应试管或例如微量滴定平板中的孔)。在特别优选的实施方案中，分发前的INVADER试验试剂组分在反应容器中是经干燥的(例如，脱水的或冷冻干燥的)。
在一些实施方案中，所述INVADER试验试剂可提供为试剂盒。如此处使用的，术语“试剂盒”指的是递送物质的任何递送系统。在反应试验的上下文中，这样的递送系统包括允许反应试剂(例如，适当容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持物质(例如，缓冲液，执行试验的书面说明书等等)从一个地点到另一个地点的储存、运输或递送的系统。例如，所述试剂盒包括一个或多个含有相关反应试剂和/或支持物质的包封物(例如，盒子)。如此处使用的，术语“分开的(fragmented)试剂盒”指的是包含两个或两个以上分开的容器的递送系统，其中每一个容器含有全部试剂盒组分的一个亚部分。所述容器被一起或分别递送到预期的接受器。例如，第一容器可含有用于试验的酶，而第二容器含有寡核苷酸。术语“分开的试剂盒”意在包括但不限于含有在联邦食物、药物和化妆品法案第520章节调控下的分析物特异性试剂(ASR’s)的试剂盒。当然，任何包含两个或两个以上分开的容器的递送系统都包括在术语“分开的试剂盒”之中，其中每个所述容器含有全部试剂盒组分的一个亚部分。相反，“联合的试剂盒”指的是在单个容器中含有一个反应试验的所有组分的递送系统(例如，容纳了每一个期望的组分的单个盒)。术语“试剂盒”包括分开的和联合的试剂盒。
在一些实施方案中，本发明提供了包含一个或多个实施本发明需要的组分的INVADER试验试剂盒。例如，本发明提供了用于储存或递送实行INVADER试验所需酶和/或反应组分的试剂盒。所述试剂盒可以包含试验所需或期望的任何和全部组分，包括但不限于，所述试剂本身、缓冲液、对照试剂(例如，组织样品、阳性和阴性对照靶寡核苷酸等等)、固态支持物、标记物、书面和/或图示说明书和产品信息、抑制剂、标记的和/或检测试剂、包装环境控制物(例如，冰、干燥剂等等)等等。在一些实施方案中，所述试剂盒提供了一亚套必需的组分，其中预期使用者将提供剩余的组分。在一些实施方案中，所述试剂盒包含两个或两个以上独立的容器，其中每个容器收藏了待递送的一亚套所述组分。例如，第一容器(例如，盒子)可以含有酶(例如，合适的储存缓冲液和容器中结构特异性切割酶)，而第二个盒子可以含有寡核苷酸(例如，INVADER寡核苷酸、探针寡核苷酸、对照靶寡核苷酸等等)。
如此处使用的术语“标记物”指的是能被用来提供可检测(优选定量的)的作用并且能附着于核酸或蛋白质的任何原子或分子。所述标记物包括但不限于染料；放射标记物(例如32P)；结合基团(例如生物素)；半抗原例如digoxgenin；发光的、发磷光的或发荧光的基团；质量标签以及荧光染料，单独或与能通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射谱的基团联合。所述标记物可以提供通过荧光、放射活性、比色法、重量测定、X射线衍射或吸收、磁力、酶活性、受质量影响的质量或行为的特征(例如，MALDI时间飞行质谱；荧光偏振)等等可检测的信号。标记物可以是带电荷的基团(正或负电荷)或可以是电中性的。所述标记物可包括核酸或蛋白质序列或由其组成，只要包含所述标记物的序列是可检测的。
如此处使用地，涉及信号的术语“截然不同的”指的是能互相区分的信号，例如通过质谱特性例如荧光发射波长、颜色、吸光度、质量、大小、荧光偏振特性、电荷等等，或者通过与另一个基团相互作用的能力，例如与化学试剂、酶、抗体等等。
如此处使用地，术语“互补的”或“互补”用于指因碱基配对法则而相关的多核苷酸(即，例如寡核苷酸或靶核酸的核苷酸序列)。例如，对于序列″5′-A-G-T-3′″互补于序列″3′-T-C-A-5′″。互补可以是“部分”的，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对法则是配对的。或者，核酸之间可以有“完全的”或“全部的”互补。核酸链之间互补的程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著的作用。这个在扩增反应以及依赖于核酸之间结合的检测方法中特别重要。任一个术语也可用于涉及单独的核苷酸，尤其是在多核苷酸的上下文中。例如，与余下的所述寡核苷酸和所述核酸链之间的所述互补相对照或相比较，寡核苷酸中特别的核苷酸因其互补于或缺乏互补于另一个核酸链中的核苷酸而被注意。
术语“同源性”和“同源的”指的是相同的程度。可以有部分同源性或完全同源性。部分同源的序列是一个序列与另外一个序列少于100％的相同。
如此处使用地，术语“杂交”用于指互补的核酸的配对。杂交和杂交的强度(即，所述核酸之间联合的强度)受例如所述核酸之间互补的程度、有关条件的严格性和形成之杂合体的Tm等因素的影响。“杂交”方法包括一个核酸与另一个互补核酸(即具有互补核苷酸序列)的核酸的退火。含有互补序列的核酸的两个多聚体互相寻找并且通过碱基配对相互作用退火的能力是广泛验证的现象。Marmur和Lane，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 46453(1960)和Doty等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 46461(1960)对“杂交”过程的最初观察之后，该方法被精炼成现代生物学的基本工具。
如此处使用的核酸序列的互补物指的是一种寡核苷酸，当与核酸序列比对使一个序列的5′末端与另一个序列的3′末端配对时，所述寡核苷酸处于“反平行的结合”。天然核酸中平常找不到的某些碱基可以包括在本发明的核酸之中，包括例如次黄嘌呤和7-去氮鸟嘌呤(deazaguanine)。互补不需要是完美的(perfect)；稳定的双体可以含有误配的碱基对或未匹配的碱基。核酸技术领域内的技术人员根据经验考虑包括如下的许多变量就能够确定双体稳定性，例如寡核苷酸的长度、碱基组成和寡核苷酸的序列、离子强度和误配碱基对的发生率。
如此处使用地，术语“Tm”用于指“熔化温度”。所述熔化温度是一群双链核酸半数解离为单链的温度。一些计算核酸Tm的方程在本领域是众所周知的。如标准参考文献指出地，当核酸在1M NaCl水溶液中时(见例如，Anderson和Young，核酸杂交中的定量过滤杂交(Quantitative Filter Hybridization，in Nucleic Acid Hybridization)(1985))，Tm值的简单估计可以通过方程Tm＝81.5+0.41(％G+C)进行计算。其它的参考文献(例如Allawi和SantaLucia，生物化学(Biochemistry)3610581-94(1997))包括更加复杂的计算，对于Tm的计算它考虑了结构和环境以及序列特征。
术语“基因”指的是包含有非编码功能的RNA(例如，核糖体或转运RNA)、多肽或前体的产生必需的控制和编码序列的DNA序列。所述RNA或多肽能由全长编码序列或者由所述编码序列的任何部分进行编码，只要期望的活性或功能被保存。
术语“野生型”指的是从天然发生的来源分离时具有的基因或基因产物的特征之基因或基因产物。野生型基因是最频繁地在一个群体中观察到，并且因而被主观地指定为基因的“正常的”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”、“突变的”或“多态性的”指的是当与野生型基因或基因产物比较时，显示了序列和/或功能特性的修饰(即改变的特性)的基因或基因产物。值得注意的是天然发生的突变体可以是分离的；这些突变体通过它们与野生型基因或基因产物比较时具有改变的特征之事实而被鉴定。
如此处使用的术语“重组DNA载体”指的是含有期望的异源序列的DNA序列。例如，尽管所述术语不局限于表达的序列或编码表达产物的序列的使用，在一些实施方案中，所述异源序列是一种编码序列和宿主生物体中编码序列的复制(或特别的宿主生物体中被有效地连接的编码序列)的表达必需之适当的DNA序列。原核细胞中表达必需的DNA序列包括启动子、任选地操纵子序列、核糖体结合位点以及可能的其它序列。真核细胞已知利用启动子、多腺苷化信号和增强子。
如此处使用的术语“寡核苷酸”被定义为包含两个或两个以上脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选地至少5个核苷酸，更加优选地至少大约10-15个核苷酸，更加优选地至少大约15至30个核苷酸。确切的大小将依赖于很多因素，这些因素反过来依赖于所述寡核苷酸的最终的功能或使用。所述寡核苷酸可以以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录、PCR或它们的联合。
因为单核苷酸以一个单核苷酸戊糖环的5′磷酸基在一个方向经由一个磷酸二酯连接附着于其相邻3′氧这样的方式进行反应，以制造寡核苷酸，如果寡核苷酸的5′磷酸基不联接于单核苷酸戊糖环的3′氧，这个末端就被称为“5′末端”，如果其3′氧不联接于随后的单核苷酸戊糖环的5′磷酸基，就被称为“3′末端”。如此处使用地，即便在一个更大的寡核苷酸内部，核酸序列也可以说具有5′和3′末端。如果沿着核酸链以5′至3′方向移动，第一区域的3′末端在第二区域的5′末端之前，所述核酸链的第一区域就被说成是另一个区域的上游。
当两个不同的非重叠的寡核苷酸与相同线性互补的核酸序列的不同区域退火，并且一个寡核苷酸的3′末端指向另一个的5′末端时，前者可以被称为“上游”寡核苷酸，后者被称为“下游”寡核苷酸。相似地，当两个重叠的寡核苷酸杂交于相同的线性互补核酸序列，在安置第一个寡核苷酸使得它的5′末端是第二个寡核苷酸的5′末端上游，第一个寡核苷酸的3′末端是第二个寡核苷酸3′末端的上游时，第一个寡核苷酸可被称为“上游”寡核苷酸，第二个核苷酸可被称为“下游”寡核苷酸。
术语“引物”指的是当置于可使引物延伸起始的条件下时，能够起合成起始点的作用之寡核苷酸。寡核苷酸“引物”当在纯化的限制性消化中时可以自然地产生，或者可以合成地生产。
选择引物以“基本上”互补于所述模板特异性序列的链。为了发生引物的延长，引物必须充分互补以杂交于模板链。引物序列不需要反映所述模板的确切序列。例如，非互补的核苷酸片段可以附着于所述引物的5′末端，引物序列的剩余部分基本上互补于所述链。非互补碱基或更长的序列能散布在所述引物之内只要引物序列具有与要杂交的模板序列充分的互补并且因此形成模板引物复合物以合成延伸引物。
如此处使用的术语“切割结构”，指的是通过至少一个探针寡核苷酸和靶核酸的相互作用形成的结构，形成包含双体的结构，所得结构通过包括但不限于酶的切割方式可被切割。与是通过例如磷酸二酯酶的试剂非特异性切割的底物之核酸分子相比，它不考虑二级结构而切割核酸分子(即，不需要双体结构的形成)，所述切割结构是通过所述切割方式特异性切割的底物。
如此处使用的术语“切割方式”或“切割试剂”指的是能够切割所述切割结构的任何方法，包括但不限于酶。“结构特异性核酸酶”或“结构特异性酶”是识别核酸分子中特异性二级结构并且切割这些结构的酶。本发明的切割方式响应切割结构的形成而切割核酸分子；所述切割方法于所述切割结构内任何特别位置切割所述切割结构不是必要的。
所述切割方式可以包括多种来源提供的核酸酶活性，包括CLEAVASE酶(第三波科技，Madison，WI)、FEN-1核酸内切酶(包括RAD2和XPG蛋白质)、Taq DNA聚合酶和大肠杆菌DNA聚合酶I。所述切割方式可以包括具有5′核酸酶活性的酶(例如Taq DNA聚合酶(DNAP)、大肠杆菌DNA聚合酶I)。所述切割方法也可以包括具有5′核酸酶活性但缺乏合成活性的修饰的DNA聚合酶。适合使用在本发明方法和试剂盒中使用的切割方式的实施例在美国专利号5,614,402、5,795,763、5,843,669、PCT申请号WO 98/23774、WO02/070755A2和WO0190337A2中有提供，它们的每一个此处整体引用作为参考。
当涉及例如5′核酸酶的酶而被使用时，术语“热稳定的”指所述酶在升高的温度下是功能性的或有活性的，即，在大约55℃或更高温度下(例如，包括但不限于60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃)。
如此处使用的术语“切割产物”，指的切割方法与切割结构的反应(即，用切割方法对切割结构的处理)产生的产物。
术语“非靶切割产物”指的是不来源于所述靶核酸的切割反应的产物。如上面讨论地，在本发明的一些方法中，所述切割结构的切割一般发生在探针寡核苷酸内。通过这个靶核酸依赖性切割产生的探针寡核苷酸的片段是“非靶切割产物”。
术语“探针寡核苷酸”在INVADER试验反应的上下文中指的是与靶核酸相互作用而在有或无INVADER寡核苷酸的存在下形成切割结构的寡核苷酸。当与靶核酸退火时，所述探针寡核苷酸与靶形成切割结构，切割发生在所述探针寡核苷酸之内。
术语“INVADER寡核苷酸”指的是在探针和靶核酸之间的杂交区域附近的位置上杂交于靶核酸的寡核苷酸，其中所述INVADER寡核苷酸包含与所述探针和靶之间的杂交区域重叠的部分(例如，化学基团或核苷酸——无论互补于或不互补于那个靶)。在一些实施方案中，所述INVADER寡核苷酸在其3′末端含有基本上与位于探针寡核苷酸5′末端的序列相同的序列。
术语“ARRESTOR分子”指的是为了阻止一个或多个反应组分参加随后的作用或反应而加入到或包括在侵入性切割反应的试剂。这个可以通过隔绝或失活一些反应组分(例如，通过与核酸组分结合或碱基配对，或者通过与蛋白质组分结合)来进行。术语“ARRESTOR寡核苷酸”(也称为捕集寡核苷酸)指的是为了阻止或捕获任何反应的一个或多个方面(例如，第一反应和/或任何随后的反应或作用；这不是旨在将所述ARRESTOR寡核苷酸限制于任何特别的反应或反应步骤)而包括在侵入性切割反应内的寡核苷酸。这个可以通过隔绝一些反应组分(例如，与另一个核酸碱基配对或者与蛋白组分结合)来进行。然而，这不是旨在将所述术语如此局限于刚刚使得反应组分被隔离的情况。
如此处使用的术语“盒子(cassette)”指的是在INVADER试验中为响应探针寡核苷酸切割而产生可检测的信号所配置的寡核苷酸或寡核苷酸的联合。在优选的实施方案中，所述盒子杂交于自所述探针寡核苷酸的切割得到的非靶切割产物，以形成第二侵入性切割结构，由此使所述盒子然后能够被切割。
本发明一些优选的实施方案中的次级切割反应包括FRET盒子的使用。这样的分子提供了次级靶(次级反应靶(或SRT))和FRET标记的可切割序列，允许连续侵入性切割反应的均相检测(即，所述反应之后没有产物的分离或其它操作)。其它优选的实施方案使用了次级反应系统，其中所述FRET探针和合成靶被提供为分开的寡核苷酸。来自初级反应的被切割的5′冗余链(flap)在次级反应中起入侵寡核苷酸的作用，其中它们结合于适当的次级反应靶(SRT)。
在一些实施方案中，所述盒子是包含发夹部分(即，一个区域，其中盒子寡核苷酸的一个部分在反应条件下杂交于相同寡核苷酸的第二个部分，以形成双体)的单个寡核苷酸。在其它的实施方案中，盒子包含至少两个包含有在反应条件下能形成双体的互补部分的寡核苷酸。在优选的实施方案中，所述盒子包含标记物。在特别优选的实施方案中，所述盒子包含产生荧光共振能量转移(FRET)作用的标记的基团。
当涉及核酸底物而被使用时，术语“基本上单链的”意味着与以通过链内碱基配对相互作用保持在一起的双链核酸形式存在的双链底物相对比，所述底物分子主要以单链核酸存在。
如此处使用地，短语“未被扩增的寡核苷酸检测试验”指的是这样构建的检测试验，其中为了检测有或无并未被扩增的(例如，通过PCR)特别的靶序列(例如，miRNA、SNP、重复序列等等)的存在，而无需产生所述靶序列的复制体。“非扩增的寡核苷酸检测试验”可以，例如，扩增用于指示靶序列之中有或无特别靶序列或多肽性存在的信号，只要所述靶序列未被复制。
如此处使用地，短语“非扩增性的寡核苷酸检测试验”指的是这样构建的检测试验，其中为了检测有或无靶序列(例如miRNA、SNP、重复序列等等)存在，而无需产生所述靶序列的复制体。“非扩增性的寡核苷酸检测试验”可以，例如，扩增用于指示靶序列中有或无特别靶序列或多肽性存在的信号，只要靶序列未复制。
如此处使用的术语“序列变异”指的是两个核酸之间核酸序列的差异。例如，野生型结构基因和这个野生型结构基因的突变形式可以由于一个碱基的替代和/或缺失，或一个或多个核苷酸的插入的存在，而在序列上不同。所述结构基因的这两个形式据说在序列上互不相同。所述结构基因的第二个突变形式可以存在。这个第二突变形式据说在序列上与野生型基因和所述基因第一个突变形式都不同。
如此处使用的术语“释放”指的是核酸片段通过例如5′核酸酶的作用从例如寡核苷酸的更大的核酸片段的释放，以至于释放的片段不再共价附着于剩余的寡核苷酸上。
如此处使用的术语“Km”指的是酶的Michaelis-Menten常数，被定义为特定的酶在酶催化的反应中产生其最大速率一半的特定底物的浓度。
如此处使用的“核苷酸类似物”指的是修饰的或非天然发生的核苷酸，包括但不限于具有改变的堆积相互作用的类似物例如7-脱氮嘌呤(即，7-脱氮-dATP和7-脱氮-dGTP)；有替代的氢键合构型的碱基类似物(例如Iso-C和Iso-G以及S.Benner的美国专利号6,001,983中描述的并且此处引用作为参考的其它非标准的碱基对)；非氢键合类似物(例如，非极性、芳香性核苷类似物，例如B.A.Schweitzer和E.T.Kool，有机化学杂志(J.Org.Chem.)，1994，59，7238-7242，B.A.Schweitzer和E.T.Kool，美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)，1995,117，1863-1872描述的2，4-二氟甲苯；它们的每一个此处引用作为参考)；“通用”碱基例如5-基吲哚和3-硝基吡咯；以及通用嘌呤和嘧啶(例如分别是“K”和“P”核苷酸；P.Kong，等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，1989，17，10373-10383，P.Kong等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，1992，20，5149-5152)。核苷酸类似物包括在糖基团上具有修饰的核苷酸，例如二脱氧核苷酸和2′-氧-甲基核苷酸。核苷酸类似物包括脱氧核糖核苷酸以及核糖核苷酸的修饰形式。
术语“多态性基因座”是群体中存在的在一个群体成员之间显示了变异的基因座(例如，最普通的等位基因具有少于0.95的频率)。相对比，“单态性基因座”是所述群体成员之间很少或没有变异被观察到的遗传基因座(一般认为是所述人群的基因池中最普通的等位基因超过0.95的频率的基因座)。
如此处使用的术语“微生物”是指一个生物体太小以至于肉眼观察不到，包括但不限于细菌、病毒、原生动物、真菌和纤毛虫。
术语“微生物基因序列”指的是来源于微生物的基因序列。
术语“细菌”指的是包括真细菌和古细菌类的任何细菌种类。
术语“病毒”指的是不能自主复制的(即，复制需要宿主细胞机制的使用)专性的、超显微镜的、细胞内寄生物。
本说明书和权利要求中的术语“样品”以其最广泛的意义而被使用。一方面它意在包括样本或培养物(例如，微生物培养物)。另一方面，它意在包括生物学的和环境的样品。样品可以包括合成来源的样本。
生物样品可以是动物，包括人类、流体、固体(例如，粪便)或者组织，以及液体和固体食物以及饲料产品和成分例如奶制品、植物、肉和肉的副产品以及垃圾。生物样品可以从所有各科的家畜，以及野兽或野生动物获得，包括但不限于例如有蹄类动物、熊、鱼、兔类、鼠等等的动物。
环境样品包括环境物质，例如表面物质、土壤、水和工业样品，以及得自食物和奶制品加工工具、设备、仪器、器具、一次性和非一次性项目。这些实例不被解释为限制可应用于本发明的样品类型。
术语“靶核酸的来源”指的是任何含有核酸(RNA(例如，miRNA)或DNA)的样品。靶核酸特别优选的来源是生物样品，包括但不限于血液、唾液、脑脊液、腹膜液、奶、淋巴、痰和精液。
如果一个寡核苷酸以比另一个寡核苷酸(或靶核酸序列)更高的摩尔浓度存在，就说那个寡核苷酸相对于另一个寡核苷酸(或靶核酸序列)而“过量”存在。当例如探针寡核苷酸的寡核苷酸在切割反应中相对于互补的靶核酸序列的浓度过量存在时，所述反应可被用于指出所述靶核酸存在的量。一般地，当过量存在时，所述探针寡核苷酸将以至少100倍摩尔过量存在；当所述靶核酸序列以大约10fmole或更少的量存在时，一般地至少1pmol的每个探针寡核苷酸会被使用。
“怀疑含有”第一和第二靶核酸的样品可以含有这两个靶核酸分子的任何一个，或者两个都含有或都不含有。
术语“反应物”此处以其最广泛的意义而被使用。所述反应物能包含，例如，酶反应物、化学反应物或光(例如，紫外光，特别是短波长紫外光已知破坏寡核苷酸链)。任何能与寡核苷酸反应缩短(例如，切割)或延长所述寡核苷酸的试剂都包括在术语“反应物”之中。
如此处使用地，术语“纯化的”或“要纯化”指的是污染物从样品中的去除。例如，在一些实施方案中，重组CLEAVASE核酸酶表达于细菌宿主细胞内，并且所述核酸酶通过宿主细胞蛋白质的去除进行纯化；这些重组核酸酶的百分比因此在样品中是增加的。
如此处使用的术语“部分”当涉及蛋白质时(例如“给定蛋白质的部分”中)指的是那个蛋白质的片段。所述片段大小范围可以从4个氨基酸残基到完整的氨基酸序列减去一个氨基酸(例如，4，5，6，...，n-1)。
如此处使用的术语“核酸序列”指的是寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸以及它们的片段或部分，以及基因组或合成来源的DNA或RNA，它们可以是单或双链的，并且代表有义或反义链。相似地，如此处使用的“氨基酸序列”指的是肽或蛋白质序列。
如此处使用地，术语“纯化的”或“基本上纯化的”指的是核酸(或氨基酸)序列的分子，所述分子从它们的天然环境被移出、被分离或被分开，并且是至少60％游离、优选地75％游离以及最优选地90％游离于与它们天然相关的其它组分。“分离的多核苷酸”或“分离的寡核苷酸”所以是基本上纯化的多核苷酸。
如此处使用的术语“核酸的连续链”意味着具有连续的、共价连接的骨架结构而没有缺口或其它中断之核酸的链。每个核苷酸碱基部分的倾向，无论碱基配对的、单链的或误配的，都不是连续链的定义的要素。所述连续链的骨架不局限于天然发生的未修饰的核酸中找到的核糖-磷酸酯或脱氧核糖-磷酸酯组分。本发明的核酸可以包含所述骨架结构的修饰，包括但不限于硫代磷酸酯残基、膦酸酯残基、2′取代的核糖残基(例如，2′-氧-甲基核糖)以及含有可选的糖(例如，阿拉伯糖)的残基。
如此处使用的术语“连续的双体”指的是双链核酸的一个区域，其中在所述双体内碱基对的行进过程中没有中断(即，沿着所述双体的所述碱基对没有被扭曲以在连续双体区域的约束内容纳一个间隙、凸出或误配)。如此处使用的所述术语仅仅指的是所述双体内所述碱基对的排列，而没有所述核酸链骨架部分连续性的暗示。有未打断的碱基配对但是在一条或两条链中有缺口的双体核酸在连续双体的定义之内。
术语“双体”指的是核酸的状态，其中一条链上核苷酸的碱基部分通过氢键合结合于排列于第二链上的它们的互补碱基。处于双体形式的条件反映了核酸的所述碱基的状态。依靠碱基配对，所述核酸链一般也假设了双螺旋的三级结构，具有大和小沟。所述螺旋形式的假设在变成双体的行为中暗示。
术语“模板”指的是核酸的一条链，在所述链上互补的复制体通过模板依赖性的核酸聚合酶的活性由核苷三磷酸进行构造。双体之内所述模板链，根据惯例，被描写并且描述为“底”链。相似地，所述非模板链经常被描写和描述为“顶”链。
发明详述
本发明涉及微小RNA(miRNA)或其它短核酸分子，例如，siRNA，的组合物及其检测和特征分析的方法。本发明提供了检测、特征分析和定量分析miRNA表达的改进的方法。在一些实施方案中，本发明提供了包括将核酸加入到miRNA以帮助检测的检测miRNA表达的方法。所得“miRNA检测结构”然后使用任何合适的方法进行检测，包括但不限于此处公开的那些方法。虽然下面的描述集中在miRNA的检测和定量分析，应当理解本发明也找到了用其它短核酸分子(例如，长度少于例如50、40、30或20个核苷酸的DNA和RNA)的用途。
1.miRNA检测结构的形成
在一些实施方案中，本发明提供了产生miRNA检测结构以帮助miRNA检测的方法。miRNA是很小的(大约21个核苷酸)，因而使用标准化的杂交方法进行检测是困难的。在一些实施方案中，本发明的方法包含将核酸分子加入到miRNA(例如，经由杂交、延伸或连接)以产生检测结构。这样的检测结构然后能使用任何合适的方法进行检测。
在一个特别的实施方案中，为了miRNA的检测产生了图2中描述的检测结构。在这个实施方案中，两个寡核苷酸与所述miRNA退火以形成一个双环或“哑铃”样结构。所述哑铃结构通过延伸有寡核苷酸双链区域的所述miRNA末端而产生了一个更大区域的双链核酸。在一些实施方案中，所述miRNA的每个末端被延伸了2至5个之间的核苷酸。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的末端包含不杂交于所述miRNA的额外的核酸序列。在一些实施方案中，这些额外的序列形成了侵入性切割结构(例如，INVADER试验侵入性切割结构)。在一些实施方案中，侵入性切割结构通过INVADER试验进行检测(见例如，下面的描述)。
在其它的实施方案中，为了miRNA的检测产生了图3中描述的检测结构。在这个实施方案中，寡核苷酸与所述miRNA退火以产生弓形结构。所述miRNA将寡核苷酸的末端集合在一起，带来比没有所述miRNA存在更大的效率。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的末端包含了延伸到超出miRNA且不杂交于所述mRNA的额外的序列。在一些实施方案中，这些额外的序列形成了侵入性切割结构(例如，INVADER试验侵入性切割结构)。在一些实施方案中，侵入性切割结构通过所述INVADER试验进行检测(见例如，下面的描述)。在其它的实施方案中，在INVADER试验侵入性切割结构的切割之后，得到的末端被连接以形成环形结构。在其它的实施方案中，寡核苷酸杂交于miRNA，使得所述寡核苷酸的末端被带到近处(例如，杂交于所述miRNA邻近的核苷酸)并且然后被连接。
在更进一步的实施方案中，产生了图16和17中描述的检测结构。在这个实施方案中，探针或INVADER寡核苷酸被延伸以产生单个发夹环或“半哑铃”结构。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的末端包含不杂交于所述miRNA的额外的核酸序列。在一些实施方案中，这些额外序列形成侵入性切割结构(例如，INVADER试验侵入性切割结构)。在一些实施方案中，侵入性切割结构通过所述INVADER试验进行检测(见例如，下面的描述)。
在其它的实施方案中，这些额外的序列互补于加入到反应混合物以稳定切割结构的额外的寡核苷酸，例如INVADER试验侵入性切割结构(图4)。
在一些实施方案中，如上述产生的环形结构使用滚环复制试验(见例如，滚环复制的下面的描述)进行检测。
在更进一步的实施方案中，检测结构从与miRNA有一个或多个短区域同源性的长寡核苷酸(例如，大于50、100、1000或更多个核苷酸)产生。一个或多个miRNA杂交于所述寡核苷酸以产生所述检测结构。在一些实施方案中，这些检测结构通过miRNA的延伸(例如，经由连接或聚合反应例如RT-PCR)进行检测。在一些实施方案中，这些检测结构通过与偶联于(例如微球、或其它表面或结构的)固相支持物的寡核苷酸之杂交进一步地进行检测。
在一些实施方案中，用于形成检测结构的寡核苷酸包含一个或多个核苷酸类似物。例如，在一些实施方案中，2′-氧-甲基核苷酸被利用。本发明不局限于特别的机制。当然，对所述机制的理解在实行本发明不是必需的。然而，可以预期2′-氧-甲基碱基的存在增加了所述杂交的检测结构的稳定性，并且帮助了进一步的检测方法。
2.干扰RNA的检测
在一些实施方案中，本发明提供了检测miRNA的方法。本发明不局限于特定的检测试验。任何合适的方法可以被利用，包括但不限于此处公开那些方法。
在本发明一些优选的实施方案中，miRNA检测方法是定量的。本发明不局限于特别的机制。当然，对所述机制的理解在实行本发明不是必需的。然而，可以期望体内特别的miRNA的水平与来自它们同类基因的基因表达水平是相关的。本发明因而提供了与特定基因(例如，参与疾病状态或代谢的基因)的基因表达相互关联的miRNA的方法。例如，在一些实施方案中，本发明的方法被用来测定特定miRNA的异常(例如，高或低)水平的存在，或测定一种干预(例如，药物)对miRNA表达的作用。在其它的实施方案中，对异源性miRNA(例如，来自表达载体、转基因构建体、转染等等)进行检测以表征miRNA表达系统的效率。
在一些实施方案中，本发明提供了检测特定miRNA(例如，miRNA诸如mir-1或mir-135)的方法。在其它的实施方案中，本发明的方法被用来区别特定miRNA中的变异体(例如，多态性或突变)。在更进一步的实施方案中，本发明提供了裂解细胞以检测miRNA存在的方法。
A.INVADER试验
在一些实施方案中，所述INVADER试验被用于miRNA的检测。在一些实施方案中，所述INVADER试验包含形成依赖于靶核酸存在的核酸切割结构，以及切割所述核酸切割结构以释放独特的切割产物。例如，5′核酸酶的活性被用于切割所述靶依赖性切割结构，所得切割产物或所述切割结构的切割是样品中特异性靶核酸序列存在的指示。当核酸的一个或两个(或两个以上)链，或者寡核苷酸，都杂交于靶核酸链以使它们形成重叠的侵入性切割结构时，如下面描述地，侵入性切割能够发生。通过切割试剂(例如，5′核酶)和上游寡核苷酸的相互作用，可制造所述切割试剂，以独特的片段被产生的方式在内部位点处切割下游寡核苷酸。这样的实施方案被称为INVADER试验(第三波科技)并且在美国专利号5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,090,543、6,348,314和6,458,535，WO 97/27214、WO98/42873，Lyamichev等人，自然生物技术(Nat.Biotech.)，17292(1999)、Hall等人，PNAS，USA，978272(2000)中有描述，为了所有的目的它们的每一个此处引用作为参考)。
所述INVADER试验通过结构特异性酶对特异性结构的酶切割，检测探针与靶的杂交(见，INVADER试验，第三波科技；见例如，美国专利号5,846,717、6,090,543、6,001,567、5,985,557、5,994,069、6,090,543、6,348,314、6,458,535,美国专利申请号20030186238(序列号10/084839)、20030104378A1(序列号09/864636)，Lyamichev等人，自然生物科技(Nat.Biotech.)，17292(1999)、Hall等人，PNAS，USA，978272(2000)，WO97/27214以及WO98/42873，为了所有的目的它们的每一个此处引用作为参考)。
所述INVADER试验通过使用结构特异性酶(例如FEN核酸内切酶)切割由重叠寡核苷酸探针的杂交形成的复合物，检测特异性的DNA和RNA序列(见，例如图1)。升高的温度和一个所述探针的过量能使待切割的针对每一靶的多重探针存在而无温度循环。在一些实施方案中，这些切割的探针然后指导第二标记探针的切割。所述次级探针寡核苷酸能用被内部染料淬灭的荧光素进行5′末端标记。一经切割，所述去淬灭的荧光素标记的产物可以使用标准荧光平板阅读仪进行检测。
所述INVADER试验检测了未扩增的以及扩增的RNA和DNA中的特异性序列、突变和SNP，包括基因组DNA。在图1中图表显示的实施方案中，所述INVADER试验使用两个都产生并且然后扩增所述靶特异性信号的级联步骤(初级和次级反应)。为了方便，下面的讨论中所述等位基因被描述为野生型(WT)和突变型(MT)，即使这个术语并不适用于所有的基因变异。在所述初级反应中(图1，A表)，所述野生型初级探针和所述INVADER寡核苷酸一前一后杂交于所述靶核酸以形成重叠结构。未配对的“flap”被包括在所述WT初级探针的5′末端。结构特异性酶(例如CLEAVASE酶，第三波科技)识别所述重叠，切割掉所述未配对的flap，将它释放为靶特异性产物。在所述次级反应中，这个切割的产物起WT荧光共振能量转移(WT-FRET)探针上INVADER寡核苷酸的作用，以再次产生结构特异性酶识别的所述结构(A表)。当单个FRET探针上的所述两个染料通过切割被分开时(通过图1中的箭头指出)，产生在背景荧光之上的可检测的荧光信号。因此，这个二级结构的切割导致荧光的增加，指示WT等位基因(或者突变等位基因，如果所述试验为了突变型等位基因产生可检测的信号而配置)的存在。在一些实施方案中，针对每个等位基因或基因座的检测，提供具有不同标记物的FRET探针(例如，通过发射或激发波长的不同可分辨的，或者通过时间分辨荧光检测可分辨的)，以使单个反应中可检测不同的等位基因或基因座。在这样的实施方案中，所述初级探针组合(set)和所述不同的FRET探针在单个试验中可以联合起来，允许来自相同样品中每个等位基因或基因座的所述信号的比较。
如果初级探针寡核苷酸和靶核苷酸序列在切割位点不是完美匹配(例如，就象MT初级探针和WT靶，图1，B表)，所述的重叠的结构并没有形成并且切割被抑制。与非重叠的结构相比，使用的所述结构特异性酶(例如，CLEAVASEVin酶，第三波科技)更加有效率地切割所述的重叠的结构(例如至少340倍)，允许所述等位基因的极好的区分。
所述探针无需温度循环运转(turn over)以产生每个靶的许多信号(即，线性信号扩增)。相似地，每个靶特异性产物可允许许多FRET探针的切割。
初级INVADER试验反应被指向待检测的靶DNA(或RNA)。所述靶DNA是第一侵入性切割中限制性组分，因为所述INVADER和初级探针以摩尔过量提供。在第二侵入性切割中，限制性的是释放的flap。当这两个切割反应相继进行时，来自混合反应(compositereaction)的荧光信号依据靶DNA的量线性蓄积。
在某些实施方案中，所述INVADER试验或其它核苷酸检测试验用可得的位点设计寡核苷酸和/或桥接寡核苷酸进行。这样的方法、程序和组合物在美国专利6,194,149、6,358,691、6355,437，美国专利申请序列号09/882,945和PCT申请WO9850403和WO0198537中有描述，所有的专利特异地完整引用作为参考。
在一些优选的实施方案中，如果靶序列存在于样品中，所述样品暴露于寡核苷酸和试剂，包括将所述样品在所述靶序列和所述寡核苷酸之间形成侵入性切割结构的条件下暴露于寡核苷酸和试剂，其中所述侵入性切割结构被所述切割试剂切割而形成切割产物。
在一些实施方案中，所述靶序列包含第一区域和第二区域，所述第二区域在第一区域的下游并且与其邻近，所述寡核苷酸包含第一和第二寡核苷酸，其中至少所述第一寡核苷酸的一部分完全互补于靶序列的第一部分，其中所述第二寡核苷酸包含3′部分和5′部分，其中5′部分完全互补于所述靶核酸的第二部分。
在一些优选的实施方案中，如果靶序列存在于样品中，所述样品暴露于寡核苷酸和试剂，包括将所述样品在靶序列和寡核苷酸之间形成侵入性切割结构的条件下暴露于寡核苷酸和试剂，其中所述侵入性切割结构被所述切割试剂切割而形成切割产物。
在一些优选的实施方案中，如果所述靶序列存在于所述样品中，所述样品暴露于寡核苷酸和试剂，包括将所述样品在所述靶序列和所述寡核苷酸之间形成侵入性切割结构的条件下暴露于寡核苷酸和试剂，其中所述侵入性切割结构被切割试剂切割而形成切割产物。
在一些特别优选的实施方案中，靶序列包含第一区域和第二区域，所述第二区域在所述第一区域的下游并且与其邻近，并且所述寡核苷酸包含第一和第二寡核苷酸，其中至少所述第一寡核苷酸的一部分完全互补于所述靶序列的所述第一部分，其中所述第二寡核苷酸包含3′部分和5′部分，其中所述5′部分完全互补于所述靶核酸的所述第二部分。
在某些实施方案中，本发明提供了使用INVADER检测试剂(例如，初级探针、INVADER探针和FRET盒)分析合并的样品(例如合并的血液样品或合并的细胞裂解物)的试剂盒。在优选的实施方案中，所述试剂盒进一步包含怎样进行所述INVADER试验的说明书，以及在一些实施方案中，怎样将所述INVADER检测试验应用于来自许多个体的合并的样品或来自单个研究对象的很多细胞(例如，来自活检样品)的“合并的”样品的说明书。
本发明进一步提供了这样的试验，其中在用寡核苷酸探针的多轮杂交以及不需要使用温度循环(即，为了靶核酸链周期性的变性)或核酸合成(即，为了靶或探针核酸链的基于聚合化的替代)的探针的切割过程中，靶核酸被再使用或再循环。当切割反应在探针被持续放置于靶链之上的条件下(例如通过探针-探针替代，或通过探针/靶结合和分离之间的平衡，或者通过包含这些机制的联合，(Reynaldo等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)97511-520(2000))进行时，多重探针能杂交于相同的靶，允许多重切割以及多重切割产物的产生。
INVADER试验反应
在INVADER DNA试验的优选实施方案中，两个寡核苷酸(分辨性的初级探针和INVADER寡核苷酸)一前一后地杂交于靶DNA以形成重叠结构。所述初级探针的5′末端包括不杂交于靶DNA的5′flap(图1)。结合的INVADER寡核苷酸的3′核苷酸重叠于所述初级探针，但是不需要杂交于靶DNA。CLEAVASE酶识别这个重叠结构，将所述初级探针未配对的5′flap切割下来，将它释放作为靶特异性产物。所述初级探针经设计以具有与反应温度相近的融化温度。因此，在等温度试验条件下，过量提供的初级探针在靶DNA上循环。这允许针对每个靶DNA的多轮初级探针切割，以及释放的5′flap数量的扩增。
在次级反应中，每一个释放的5′flap能起荧光共振能量转移(FRET)盒上INVADER寡核苷酸的作用以产生另外一个被CLEAVASE酶识别并切割的重叠结构(图1)。当FRET盒被切割时，荧光团(F)和淬灭剂(Q)被分开，产生可检测的荧光信号。与最初的反应相似，释放的5′flap和FRET盒循环，导致扩增的荧光信号。所述最初和次级反应在相同的孔中同时进行。
所述INVADER试验的双体格式实现了在单个孔中两种DNA序列的同时检测。最经常地，这包括特定多态性的两个变异体的检测(例如，miRNA中)。所述双体格式使用两种不同的分辨性初级探针，每种有独特的5′flap，和两种不同的FRET盒，每种有波谱截然不同的荧光团。通过设计，释放的5′flap将只结合于它们各自的FRET盒以产生靶特异性的信号。
在一些实施方案中，本发明提供了包含实行本发明必需的一个或多个组分。例如，本发明提供了储存或递送本发明的酶和/或实行切割试验(例如，所述INVADER试验)必需的反应组分。以举例的方式，并不是意将本发明的试剂盒限制为任何特别的配置或组分的联合，下面的章节描述了实行本发明的试剂盒的一个实施方案
在一些实施方案中，本发明的试剂盒提供了下面的试剂
CLEAVASE酶 初级寡核苷酸
DNA反应缓冲液I INVADER寡核苷酸
FRET盒1(例如，F)
FRET盒2(例如，R)
突变型DNA对照
野生型DNA对照
“无靶”的空白对照
在其它的实施方案中，本发明的试剂盒为了RNA的直接检测而被配置。这些试剂盒可以提供下面的试剂
CLEAVASE酶 初级探针
寡核苷酸
DNA反应缓冲液I INVADER寡核苷酸
FRET探针1(例如，F)
FRET探针2(例如，R)
次级反应靶1
次级反应靶2
ARRESTOR寡核苷酸1
ARRESTOR寡核苷酸2
突变型DNA对照
野生型DNA对照
“没有靶”的空白对照
必须有额外的考虑，其与由单一反应中寡核苷酸的特定组合产生的非期望作用有关。一种这样的作用是背景信号的靶独立性的产生。某些寡核苷酸与其它的寡核苷酸组合，在所述INVADER试验中在没有待检测的特别靶存在下可以产生信号。将这些寡核苷酸的组合分开到不同的池中能用于减轻该作用。相似地，某些寡核苷酸的组合能够虚假地抑制来自期望靶的信号产生。再一次，这些组合分开到不同的池中能够减轻这个作用。
设计探针组合(set)(例如，寡核苷酸和/或其序列)以适合于miRNA检测试验中的使用，其利用反应设计和此处提供的最优化的指导方针(见例如，实验章节)。例如，在一些实施方案中，降低所述反应温度(例如，到50-60℃)以进行小区域的杂交。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒提供了为了进行本发明的方法由使用者供给的额外组分的列表(例如，试剂、供应品和/或设备)。例如，并且不是意在将这样额外的组分的列表限制于任何特别的组分，这样的列表的一个实施方案包含了如下
·透明CHILLOUT-14液体蜡(MJ Research)或无RNase的光学级矿物油(Sigma，Cat.No.M-5904)
·96孔聚丙烯微量平板(MJ Research，Cat.No.MSP-9601)
·无菌的1.5ml或2.0ml微量离心管
·无菌的、无DNase/RNase的一次性气溶胶隔离移液器吸头
·多道移液器(0.5-10μl，2.5-20μl)
·温度循环器或其他热源(例如，实验室烘箱或加热块)
·各式各样的实验室设备(试管架、微量移液器、多道移液器、微量离心机、振荡混合器)
·荧光微量平板读取器(优选的平板读取器是从上面读数的并且配备了有下面特征的滤光器
激发发射
(波长/带宽) (波长/带宽)
485nm/20nm 530nm/25nm
560nm/20nm 620nm/40nm
在一些实施方案中，本发明的试剂盒提供了为了方便本发明的方法执行由使用者供给的额外组分的列表(例如，试剂、供应品和/或设备)。例如，并且不是意在将这样可选的组分列表限制于任何特别的组分，这样的列表的一个实施方案包含了如下
·无菌8试管条或微量平板(可选的)
·一次性塑料水槽(可选的)
·平板封口带(可选的)
在一些实施方案中，本发明的试剂盒提供了为了方便本发明方法的进行由使用者供给的必需组分的列表，为此多个可选物是可接受的(例如样品制备试剂盒)。例如，并且不是意在将这样的可选组分的列表限制于任何特别的组分，这样的列表的一个实施方案包含如下
·QIAGENQI AMP血液试剂盒
·Gentra Systems PUREGENE试剂盒
·Gentra Systems GENERATION产品
在试剂盒的一些实施方案中，提供了详细的实验方案。在优选的实施方案中，提供了INVADER试验反应的汇编的实验方案(例如，制剂和制造反应混合物的优选程序)。在特别优选的实施方案中，反应混合物的汇编之实验方案包括电脑或绘图的帮助，以降低本发明方法执行中犯错的风险(例如，方便多重反应需要的试剂之体积的计算的表格，以及辅助配置含有许多试验反应的多孔试验平板的平板设计指导)。
在一些实施方案中，提供了增补文件，例如补助程序的试验方案，例如为了额外试剂的制备，或为了用于本发明方法中样品制备的实验方案。在优选的实施方案中，增补文件包括为了方便非技术人员或无经验的使用者对所述方法和试剂的成功使用而提供的指导方针和预防措施列表。在特别优选的实施方案中，增补文件包括解决问题指南，例如，描述了使用者遭遇的可能问题，以及提供了意在帮助使用者解决或避免这样的问题而提出的解决方案或改正方法的指南。
在优选的实施方案中，样品被稀释到相应于每个反应加入10μl的浓度。100ng样品的浓度应当是15ng/μl。
B.滚环复制
在其它的实施方案中，滚环复制方法(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)被用于miRNA检测结构的检测(见例如，美国专利6,344,329、6,143,495、6,316,229、6,210,884、6,183,960和6,235,502；它们的每一个在此引用作为参考)。在一些实施方案中，滚环复制被用来检测从与miRNA退火的单个寡核苷酸末端的退火产生的环状miRNA检测结构。在一些实施方案中，寡核苷酸的末端杂交于没有重叠的miRNA。这个寡核苷酸在有或无miRNA存在下能够被连接。然而，所述连接反应在有所述miRNA存在下更有效率。在这样的实施方案中，将随着时间检测的环状分子水平与缺乏miRNA的对照反应比较。
在其它的实施方案中，所述寡核苷酸的末端杂交于有重叠末端的miRNA以产生侵入性切割结构。这样的结构在连接之前被切割，因而提高所述环状检测结构产生的特异性。
滚环扩增(RCA)包括环状单链DNA分子的复制。在RCA中，滚环复制的引物杂交于环状核酸分子，之后是使用链替代DNA聚合酶的核酸分子的滚环复制。所述扩增发生在单个反应循环的滚环复制之中。滚环复制得到含有核酸序列的串联重复序列的大DNA分子。这个DNA分子被称为串联序列DNA(TS-DNA)。
在一些实施方案中，利用复制之前包括连接操作的连接介导的滚环扩增(LM-RCA)。在所述连接操作中，探针杂交于其同类靶核酸序列(如果存在的话)，之后是杂交探针末端的连接形成共价闭合的单链核酸。连接之后，滚环复制引物杂交于探针分子，之后是使用链替代DNA聚合酶的环状分子的滚环复制。一般地，LM-RCA包含将开环探针与靶样品混合，得到探针-靶样品混合物，并且在促进所述开环探针和靶序列之间杂交的条件下孵育所述探针-靶样品混合物，将连接酶与所述探针-靶样品混合物混合，得到连接混合物，并且在促进所述开环探针连接的条件下孵育所述连接混合物以形成扩增靶环(ATC)，将滚环复制引物(RCRP)与所述连接混合物混合，得到引物-ATC混合物，并且在促进所述扩增靶环和所述滚环复制引物之间杂交的条件下孵育所述引物-ATC混合物，将DNA聚合酶与所述引物-ATC混合物混合，得到聚合酶-ATC混合物，并且在促进所述扩增靶环复制的条件下孵育所述聚合酶-ATC混合物，这里所述扩增靶环的复制导致串联序列DNA(TS-DNA)的形成。
C.额外的检测方法
技术领域：
本发明不限于INVADER试验或滚环试验检测。任何允许miRNA检测结构的检测的方法可以被利用。作为示例的，发现用于本发明方法的非限制的检测试验在下面有描述。
1.杂交试验
在本发明的一些实施方案中，检测结构使用杂交试验进行检测。在杂交试验中，有或无特定核酸序列的存在基于来自样品的DNA杂交于互补DNA分子(例如，寡核苷酸探针)的能力进行测定。使用各种杂交和检测技术的各种杂交试验是可以利用的。试验挑选的描述在下面有提供。
a.杂交的直接检测
在一些实施方案中，探针与目的序列的杂交(例如，SNP或突变)通过显现结合探针(例如，Northern或Southern试验；见例如Ausabel等人(eds.)，分子生物学当代实验方案(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley & Sons，NY[1991])直接进行检测。在这些试验中，基因组DNA(Southern)或RNA(Northern)从研究对象分离出来。所述DNA或RNA然后用一系列基因组中罕见地并不在待分析的任何标志物附近切割的限制性酶进行切割。所述DNA或RNA然后被分开(例如，在琼脂糖凝胶上)并且被转移到膜上。标记的(例如，通过引入一个放射性核苷酸)探针或特异于待检测的所述SPN或突变的探针被允许在低、中或高严格条件下与所述膜接触。未结合的探针被去除并且结合的存在通过显现所述标记的探针进行检测。
b.使用“DNA芯片”试验的杂交的检测
在本发明的一些实施方案中，变异体序列使用DNA芯片杂交试验进行检测。在这个试验中，一系列寡核苷酸探针被附于固相支持物。所述寡核苷酸探针被设计成对于特定的靶序列是唯一的(例如，miRNA靶序列)。目的DNA样品与所述DNA“芯片”接触并且对杂交进行检测。
在一些实施方案中，所述DNA芯片试验是GeneChip(Affymetrix，Santa Clara，CA；见例如，美国专利号6,045,996、5,925,525和5,858,659；它们的每个此处引用作为参考)试验。所述GeneChip技术使用附于“芯片”的寡核苷酸探针的小型、高密度阵列。探针阵列通过Affymetrix的光指示化学合成法进行生产，它联合了固相化学合成和半导体工业采用的照相平版印刷制作技术。为了定义芯片暴露位点使用了一系列照相平版印刷底片，之后是特异性化学合成步骤，所述方法构建了寡核苷酸的高密度阵列，有每一个探针在阵列中预先确定的位置。多重探针阵列在大的玻璃夹心晶片上同时进行合成。所述夹心晶片然后被切成方块，并且单独的探针阵列被包装在注模塑料盒中，所述盒子保护它们免受环境的影响并且用作杂交的腔室。
待分析的核酸被分离，通过PCR进行扩增，并且用荧光报告基团进行标记。所述标记的DNA然后使用流体工作站(fluidics station)与所述阵列进行孵育。所述阵列然后被插入扫描仪中，在此检测杂交的模式。收集杂交数据，为已经整合进靶的荧光报告基团的发射光，所述靶结合于所述探针阵列。既然所述阵列上每个探针的序列和位置是已知的，通过互补性，应用于所述探针阵列的靶核酸的身份能够被测定。
在其它的实施方案中，利用含有电子捕捉探针的DNA微芯片(Nanogen，San Diego，CA)(见例如，美国专利号6,017,696、6,068,818和6,051,380；它们的每个此处引用作为参考)。通过微电子的使用，Nanogen的技术实现了到达和来自半导体微芯片上指定的测试位点的带电分子之活跃的运动和浓缩(concentration)。对于特定靶序列是唯一的DNA捕获探针通过电子手段被放置于或“定位于”所述微芯片上的特异性位点。既然DNA具有很强的负电荷，它能通过电子手段被移到正电荷区域。
首先，所述微芯片上一个测试位点或一行测试位点用正电荷电子激活。其次，含有所述DNA探针的溶液被引入到所述微芯片上。负电荷探针很快地移动到带正电荷的位点，在此它们浓缩并且被化学结合于所述微芯片上的位点。然后清洗所述微芯片，加入截然不同的DNA探针的另一个溶液直到特异性结合DNA探针的阵列完成。
然后对测试样品通过测定哪个所述DNA捕获探针杂交于靶序列而分析靶序列的存在。电子电荷也被用于移动和浓缩靶分子至所述微芯片上一个或多个测试位点。在每个测试位点上样品DNA的电子浓度促进了样品DNA与互补捕获探针的快速杂交(杂交可以在数分钟内发生)。为了从每个位点去除任何未结合的或非特异性结合的DNA，所述位点的极性或电荷被逆转为带负电荷的，因此强迫任何未结合的或非特异性结合的DNA回到远离所述捕获探针的溶液。基于激光的荧光扫描仪被用于检测结合。
在更进一步的实施方案中，基于通过表面张力的不同，隔离平面(芯片)上的流体的阵列技术(ProtoGene，Palo Alto，CA)(见例如，美国专利号6,001,311、5,985,551和5,474,796；它们的每个此处引用作为参考)。Protogene的技术基于流体能够被隔离在通过化学包被给予的表面张力不同的平面之上的事实。一旦这么被隔离，寡核苷酸探针通过试剂的喷墨打印在所述芯片上直接合成。带有由表面张力定义的反应位点的阵列在一套四个压电喷嘴下被装在X/Y移动平台上，每一个喷嘴代表四个标准DNA碱基的一个。所述移动平台沿着所述阵列的每行移动并且适当的试剂被递送到每一个反应位点。例如，Aamidite只被递送到amidite A在那个合成步骤之中被偶联的位点等等。普通试剂和清洗液通过覆满(flooding)整个表面并且然后通过离心将其去除而被递送。
对于目的靶序列(例如，miRNA靶序列)唯一的DNA探针使用Protogene的技术被附于所述芯片。所述芯片然后与PCR扩增的目的基因接触。杂交之后，未结合的DNA被去除并且杂交使用任何合适的方法进行检测(例如，通过整合的荧光基团的荧光去淬灭)。
然而在其它的实施方案中，“珠子试验”被用于多态性的检测(Illumina，San Diego，CA；见例如，PCT公开WO 99/67641和WO00/39587，它们的每个在此引用作为参考)。Illumina使用联合了纤维光束和自己装配成为阵列的珠子的珠子阵列技术。每个纤维光束依赖于所述光束的直径而含有数千至数百万的单个纤维。所述珠子用特异于特定SNA或突变的检测的寡核苷酸包被。几批珠子被联合以形成特异于所述阵列的集合。为了进行试验，所述珠子试验与制备好的研究对象的样品(例如，核酸样品)接触。杂交使用任何合适的方法进行检测。
c.杂交的酶法检测
在本发明的一些实施方案中，杂交通过特异性结构的酶切割进行检测。
在一些实施方案中，结合探针的杂交使用TaqMan试验(PEBiosystems，Foster City，CA；见例如，美国专利号5,962,233和5,538,848，它们的每个此处引用作为参考)进行检测。所述试验在PCR反应的过程中进行。所述TaqMan试验利用了AMPLITAQ GOLD DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性。特异于特定等位基因或突变的探针被包括在所述PCR反应之中。所述探针由有5′报告基因染料(例如，荧光染料)和3′淬灭染料的寡核苷酸组成。在PCR过程中，如果所述探针结合于其靶，AMPLITAG GOLD聚合酶的5′-3′核酸水解活性切割了所述报告基因和所述淬灭染料之间的探针。报告基因染料从淬灭染料分开导致荧光的增加。所述信号随着PCR的每个循环蓄积并且能用荧光仪进行监测。
在更进一步的实施方案中，多态性使用SNP-IT引物延伸试验(Orchid Biosciences，Princeton，NJ；见例如，美国专利号5,952,174和5,919,626，它们的每个在此引用作为参考)进行检测。在这个试验中，SNP通过使用特异性合成的DNA引物和DNA聚合酶由可疑SNP位置的一个碱基选择性延伸所述DNA链进行鉴别。目的区域中的DNA被扩增和变性。聚合酶反应然后使用被称为微流体的小型化系统进行。检测通过将标记物加入到被怀疑在靶序列位置的核苷酸来完成。所述标记物整合进所述DNA能通过任何合适的方法进行检测(例如，如果所述核酸含有生物素标记物，检测可以经由特异于生物素的荧光标记抗体)。
2.其它检测试验
在miRNA检测结构的检测中有用的额外的检测试验，包括但不限于酶错配切割方法(例如，Vairagenics，美国专利号6,110,684、5,958,692、5,851,770，此处完整引用作为参考)；聚合酶链式反应；分支杂交方法(例如，Chiron，美国专利号5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802，此处完整引用作为参考)；NASBA(例如，美国专利号5,409,818，此处完整引用作为参考)；分子信标技术(例如，美国专利号6,150,097，此处完整引用作为参考；电子传感器(Motorola，美国专利号6,248,229、6,221,583、6,013,170和6,063,573，此处完整引用作为参考)；循环探针技术(例如，美国专利号5,403,711、5,011,769和5,660,988，此处完整引用作为参考)；DadeBehring信号扩增方法(例如，美国专利号6,121,001、6,110,677、5,914,230、5,882,867和5,792,614，此处完整引用作为参考)；连接酶链式反应(Barnay，Proc.Natl.Acad.Sci USA 88，89-93(1991))；以及夹心杂交方法(例如，美国专利号5,288,609，此处完整引用作为参考)。
实验的
为了证明和进一步阐明某些优选的实施方案和本发明的各个方面，提供下面的实施例，并且不被解释为限制本发明的范围。
实施例1
材料和方法
·下面最终浓度(除非有注明的)用于所有的反应
探针＝1μM
INVADER＝1μM
ARRESTOR＝2.67μM
CLEAVASE XII酶＝30ng
所有合成的miRNA寡核苷酸从Dharmacon购买并且在20％变性丙烯酰胺凝胶纯化。合成的miRNA被用来测定温度的最适(见下面)和LOD。
INVADER、探针和ARRESSTOR寡核苷酸由整合DNA技术(IDT)或第三波科技合成，在20％变性丙烯酰胺上进行纯化，除非另外有指出。
·下面的2.5×初级反应缓冲液用于(除非另外有注明的)所有的反应
25mM MOPS pH7.5
62.5mM KCl
0.125％Tween 20
0.125％Nonidet NP40
62.5mMMgSO4
5％PEG
·除非另外有指出，所有的反应在第一个热孵育之前被10μl矿物油覆盖。
·除非另外有注明，合成的miRNA含有5′羟基。比较5′磷酸化与非磷酸化合成的miRNA靶检测的实验指出，INVADER试验检测这两个不同类型合成分子的能力没有明显的不同。
实施例2
let7和mir-1的温度最优化实验
let-7的寡核苷酸设计显示在图5中。mir-1的寡核苷酸设计显示在图5中。下面的初级混合物被制成并且在96孔板中在50C±10℃孵育30分钟。另外，没有靶的总体混合物(master mix)被制备(加入水取代RNA)。所有的反应用矿物油覆盖以阻止蒸发。
初级反应完成后，加入5μl下面的次级反应混合物，并且所述反应然后在60℃反应孵育10-15分钟。
所述反应完成后，所述平板在CYTOFLUOR4000荧光微量平板阅读器内使用485nm的激发波长和530nm的发射波长进行读数。结果显示在图6和7中。当所述INVADER寡核苷酸的3′末端是2′-氧-甲基化的时候，所述INVADER寡核苷酸的5′末端到所述miRNA的3′末端的堆砌被增强。另外，所述INVADER寡核苷酸5′末端的2′-氧-甲基化增加了反应温度。延伸INVADER寡核苷酸的2′-氧-甲基化碱基以至于它们与所述miRNA(SEQ ID NO8(1496-96-02)对let-7a的SEQ ID NO9(1496-96-OlR)设计中SEQ ID NO23(1496-96-03))的最初两个碱基的碱基配对，增加了所述反应的最适温度但是不增强所述检测。
实施例3
let-7和miR-1的LOD试验
测定每一个组合的探针和INVADER寡核苷酸的最优反应温度和测定最好的工作设计(来自温度最优净信号)后，下面的实验被设置以使用合成的RNA测定所述设计的LOD。下面的反应混合物被分装到有每个孔含有如下的96孔板中(见下面平板设置)
2.5μl下面的miRNA浓度使用下面的设置以三复样或四复样加入
＜--------[miRNA]-----→
所述平板用矿物油覆盖(10μl)并且在50℃孵育2小时。在初级反应完成后，5μl下面的组分加入到每个孔并且所述平板在60℃孵育1.5小时。所述平板用上面描述的设置(见实施例2)进行读数。
接着let-7和mir-1的LOD在人类RNA样品上进行检测。上面描述的实验方案被利用。50-100ng组织特异性总的人RNA样品(Clonetech，Palo Alto，CA)被使用。结果显示在图8和10中。使用总RNA所述let-7a INVADER试验检测了如以前观察到的依赖于组织来源的let-7a表达水平相同的组织表达谱(profile)(Pasquinelli等人，40886[2000])。
实施例4
Let-7a、c、e和f的交叉反应实验
该实施例描述了针对let-7一种亚型的探针和/或INVADER寡核苷酸对于另一个亚型的交叉反应性的分析。采用实施例3中描述的合成的let-7a设置的实验方案。图5显示了寡核苷酸设计。采用下面的平板设置
结果显示在图9中。对于let-7a设计，当所述miRNA长度相同、在远离所述切割位点有一个碱基改变时，交叉反应性最大。换句话来说，当误配更加远离所述切割位点(let-7c)时，INVADER寡核苷酸/miRNA杂交区域的误配得到高的交叉反应性。当碱基变化在所述切割位点的对面(或与其接近)时，交叉反应性最低。对于let-7a，最严重的交叉反应性是和let-7c，其得到了25％的所述信号。该实施例证明了所述INVADER试验能够区分非常相似的miRNA。
实施例5
CLEAVASE IX酶对CLEAVASE XII酶
该实施例描述了用于miRNA试验的CLEAVASE酶的最优化。上面描述的温度最优化的试验方案被利用。使用20ng的CLEAVASE IX酶(第三波科技，Madison，WI)或30ng的CLEAVASE XII酶(第三波科技，Madison，WI)。下面的缓冲液用于CLEAVASE IX酶
2.5X初级反应缓冲液25mM MOPS pH7.5，250mM KCl，0.125％Tween 20，0.125％ Nonidet NP40，31.25mM MgSO4，10％PEG。
7.5X次级反应缓冲液87.5mM MgSO4。
下面的缓冲液被用于CLEAVASE XII酶
2.5X初级反应缓冲液25mM MOPS pH7.5，62.5mM KCl，0.125％Tween 20，0.125％ Nonidet NP40，62.5mM MgSO4，5％ PEG。
7.5X次级反应缓冲液水
LOD实验的实验方案与CLEAVASE IX或XII酶一起使用。测定了两个酶的LOD。结果显示在图11中。
当与CLEAVASE IX酶或CLEAVASE XII酶一起分析时信号随着let-7miRNA量的增加而线性增加。然而，R2值在CLEAVASE XII酶更大，指出了更大的线性关系。另外，所述LOD在CLEAVASE XII酶更低。2.5阿摩尔的检测净信号(net signal)在CLEAVASE IX酶是20个计数并且在CLEAVASE XII酶是66.75。
实施例6
miR-135、GAPDH和U6 RNA
A.检测miR135的寡核苷酸的设计
该实施例描述了miRNA miR135试验设计和LOD的测定。miR-1的实验如实施例2和3描述地进行。所述寡核苷酸设计在图5中有描述。为了mir-135miRNA的检测每个所述设计(A-D)利用了不同的INVADER和探针寡核苷酸。比较所有所述设计进行的温度最优化实验的结果显示在图13中。设计D产生最高的信号。使用试验设计D的LOD实验的结果显示在图14中。
图14A呈现了在每个指出的靶浓度从四个重复试验产生的粗计数。每一个靶浓度得到的平均计数表示净信号并且是零之上的倍数(FOZ)。在这个实验中miR-135靶的检测限是164 zmoles，相当于98,743个分子。图14B含有在每个浓度得到的平均计数的图示，并且指出INVADER试验在测试的许多浓度范围是线性的。
B.检测GAPDH和U6 RNA的寡核苷酸的设计
在一些情形下，例如双体试验中共同检测一般在所有细胞中以恒定水平与一个或多个miRNA种类一起存在的RNA是期望的，所述RNA以组织特异性的方式表达。INVADER试验因此被设计成一般在所有细胞类型中可见的两个截然不同的RNA人三磷酸甘油醛脱氢酶(hGAPDH)和U6的RNA。
在hGAPDH的情况下，下面的寡核苷酸被用于双体miRNA检测试验INVADER寡核苷酸(SEQ ID NO41)；探针(SEQ ID NO42)；ARRESTOR寡核苷酸(SEQ ID NO43)；SRT寡核苷酸(SEQ IDNO49)，FRET寡核苷酸(红色染料)(SEQ IN NO48)。
在U6的情况下，从秀丽新小杆线虫到小鼠到芥属(arabidopsis)到人类8个不同种类的U6 RNA序列比对，以鉴定适合于“通用”INVADER试验设计的区域。所述比对显示在图12中；产生以检测这个序列的寡核苷酸序列是SEQ ID NO93-95。
在细胞裂解物上使用SEQ ID NO45-47与这些寡核苷酸进行的初始试验证明了来自U6反应的信号在miRNA信号之前达到非常饱和，可能因为细胞内大量的U6 RNA。因此，进行滴定反应，以确定稀释探针和INVADER寡核苷酸的浓度是否会使得这个探针组合适合用于终浓度范围从1μM到12.5nM的INVADER和探针的双体miRNA检测试验。12.5-50nM之间的所述INVADER和探针寡核苷酸的终浓度适于miR-1d和let-7a的双体miRNA检测。ARRESTOR、SRT和FRET探针浓度如在前面的实施例中描述的。进一步的实验证明了用“通用”U6RNA寡核苷酸(SEQ IN NO93-95)的U6RNA的检测与用SEQ ID NO45-47的检测相当。
实施例7
细胞裂解物中let-7、GADPH和U6 RNA的检测
A.细胞裂解物中let 7a的检测
这个实施例描述了直接在总细胞RNA中以及来自人骨肉瘤细胞系MG63(第三波科技，Madison，WI；目录号CRL-1427)的未诱导的成纤维细胞中let-7 miRNA的检测。总细胞RNA，如以前描述地(Chomczynski等人，分析生物化学(Anal.Biochem.)162156-156(1987))，使用TRIZOL(Gibco-BRL)进行提取，并且细胞裂解物如Eis等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)，19673-6(2001)进行制备；两个发表文章在此引用作为参考。
反应如下进行设置。等分的5μl细胞裂解物、裂解缓冲液中为所示浓度的合成miRNA靶(Eis等人，自然生物技术(NatureBiotechnology)，19673-6(2001))或5μl 20ng/μl tRNA(作为无靶对照)用移液器加入到微量滴定平板适当的孔中。初级反应总体混合物被制成用于96个反应，含有下面的试剂。
5μl初级反应总体混合物的分装物加入到含有适当靶或对照的孔中。所述平板用矿物油(10μl)覆盖并且在53℃孵育2小时。初级反应完成后，5μl的下列组分加入到每个孔中，并且所述平板在60℃孵育1.5小时。所述平板使用上面描述的设置进行读数(见实施例2)。
所有靶以四复样进行试验。对总RNA和细胞裂解物进行试验之不同细胞数所获得的平均计数作图于图15中。从已知量的合成let-7amiRNA的INVADER试验获得的标准曲线被用于外推每个细胞的let-7a拷贝数。产生细胞裂解物之细胞的数量在细胞裂解之前的接种程序过程中如Eis等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)，19673-6(2001)中描述地进行测定，此处引用作为参考。在这个实验中，在从156个细胞获得的总RNA提取物中达到了细胞裂解物的检测限。
B.没有Mg++存在的裂解
可选的裂解程序开展如下。已经指出当使用上面的裂解程序时，长mRNA，即来自GADPH，没有检测到预期的量。进行所述实验以检查Mg++对裂解物中RNA提取的作用。在有或无MgCl2存在下裂解的提取物与使用如上面描述地使用TRIZOL制备的总细胞RNA提取物进行比较。
Hela细胞(7.5×106细胞)悬浮在100μl的带有100mM KCl之10mM MOPS缓冲溶液中，pH7.5。10μl分装物加入到单独(separate)的试管内并且用100μl如下制备的两个不同裂解缓冲液裂解
所有的试管然后在80℃孵育15分钟以裂解细胞，然后离心收集碎片。各种裂解物5μl的分装物如下加入到INVADER反应。
初级INVADER反应如上面let-7a描述的；GADPH(SEQ ID NO41-43)和U6(SEQ ID NO45-47在50nM终浓度)的PI寡核苷酸混合物也被制成。
*初级INVADER反应如上面let-7a描述的；GADPH(SEQ ID NO41-43)和U6(SEQ ID NO45-47在50nM终浓度)的PI寡核苷酸混合物也被制成。
初级反应混合物在49℃孵育1小时。下面第二反应混合物的分装物然后被加入
次级反应混合物包括在如实施例7A中所示浓度的SRT(对于let-7，SEQ ID NO22；对于GADPH和U6，SEQ ID NO49)靶，FRET寡核苷酸(对于let-7，SEQ ID NO21；对于GADPH和U6，SEQ ID NO48)，arrestors(对于let-7，SEQ IN NO7；对于GAPDH，SEQ ID NO43以及对于U6，SEQ ID NO47)。
次级反应在60℃进行1小时。反应在如实施例2中描述的CYTOFLUOR微量平板读取器进行读数。结果呈现在图16中，表明GAPDH信号的存在依赖于裂解缓冲液中无Mg++的存在，而U6 RNA信号不管有无Mg++的存在都保持相对恒定。额外的实验证实，所有的RNA在与无Mg++存在的裂解中获得那些RNA相当水平的总细胞RNA中是可检测到的。
实施例8
多种miRNA检测备选的INVADER试验设计
A.let-7A检测备选设计
这个实施例描述了let-7a miRNA检测备选的寡核苷酸设计的创造和测试。在一系列的实验中，产生了一套可选的设计，其中所述INVADER寡核苷酸和所述探针寡核苷酸的靶特异性区域均是11个核苷酸长。产生了第二套设计，其中所述探针寡核苷酸的靶特异性区域是10个核苷酸长，所述INVADER寡核苷酸是12个核苷酸长。
1.寡核苷酸设计
a.11聚体探针和INVADER寡核苷酸设计
图5显示了检测let-7a miRNA备选的核苷酸设计，其中探针和INVADER寡核苷酸的靶特异性区域都是11个核苷酸长。SEQ ID NO50-51提供了所述INVADER和探针都是线性的设计。SEQ ID NO6含有形成了茎环结构的探针寡核苷酸；SEQ ID NO5，形成茎环结构的INVADER寡核苷酸)；SEQ ID NO5-6，两个都有茎环的探针和INVADER寡核苷酸。
b.10聚体探针和12聚体INVADER寡核苷酸设计
图5显示了检测let-7a miRNA的一套备选的寡核苷酸设计，其中所述探针的靶特异性区域包含10个核苷酸，INVADER寡核苷酸的那些靶特异性区域包含12个核苷酸。SEQ ID NO52-53提供了INVADER和探针寡核苷酸都是线性的设计。SEQ ID NO2含有形成了茎环结构的探针寡核苷酸；SEQ ID NO1，形成了茎环结构的INVADER寡核苷酸。
2.Let-7a miRNA之检测备选寡核苷酸设计的温度最优化谱(profile)
温度最优化实验进行如下。总和混合物被制成用于24个反应。每个反应含有下面的
*探针和INVADER寡核苷酸的多种组合如图16-17所示用于这个实验中。
次级反应混合物如let-7的实施例3中描述的。适当的时候，制成ARRESTOR序列以对应(compliment)所述探针完整的环和靶特异性区域，且朝着所述探针5′末端延伸6个碱基。
在11聚体温度最优化实验的情况下，初级反应在50±9℃进行1小时，之后是如实施例2中描述的在60℃下15分钟的次级反应。对于所述10聚体探针，和12聚体INVADER寡核苷酸一起，初级反应在50±9℃进行15分钟，之后是在60℃的15分钟的次级反应。
其中INVADER和探针寡核苷酸的靶特异性部分是11个核苷酸长之设计的结果呈现在图18中。图18A显示了每个设计的温度最优化谱。图18B显示了每个设计标准化的最大限度的执行，包括每个设计的最优温度。其中探针寡核苷酸的靶特异性部分是10个碱基，INVADER寡核苷酸是12个碱基之设计的结果呈现在图19中。图19A显示了温度最优化谱，并且图19B显示了每个设计标准化的最大限度的执行。
这些结果的检查提示，设计导致最大限度执行的设计取决于反应条件和形成的miRNA-寡核苷酸杂交体的相对稳定性的不同而不同。例如，当两个寡核苷酸的靶特异性区域都是11个碱基长时，所述探针靶特异性区域具有49℃的预期Tm，所述INVADER靶特异性区域有37℃的预期Tm。在这个情况下，INVADER寡核苷酸-miRNA相互作用的稳定化给这个设计提供了改善的试验实施。然而，对于探针是10聚体并且INVADER寡核苷酸是12聚体的let-7a设计，所述两个寡核苷酸的靶特异性区域具有大约相等的Tm。在这个情况下，两个寡核苷酸均是环状的设计运行地最好。
3.使用两个可选设计的let-7a的LOD
实验如实施例3中描述地进行设置以比较所述双环设计和所述单环设计的LOD，其中INVADER寡核苷酸形成了茎环结构。
测定LOD的反应以四复样进行。反应混合物含有下面的试剂(终浓度)
5μl miRNA的分装物以图20中指出的终浓度加入到含有反应混合物的孔中。初级反应在实施例8B中测定的每个设计的最优化温度(成环的INVADER寡核苷酸设计为50℃，双环设计为53℃)进行1.5小时。次级反应如在实施例2和3中描述地进行设置并且在60℃进行1小时。
图20中的结果显示了产生的净信号，其为miRNA摩尔量的函数。所述图表的线性范围指出使用所述INVADER环状设计比双环设计从特定量的miRNA产生更多的信号。相似地，图20中所述表的检查表明在每个miRNA水平高于零的倍数数值比单环设计的更大。两个设计在测试的最低浓度(等同于大约16,000分子的2.68×10-20摩尔或26.8仄摩尔(zeptomole))得到了足够的FOZ。
4.全长的对于截短的ARRESTOR寡核苷酸
进行实验以评价例如如图4和12中所示的全长ARRESTOR分子对于截断的ARRESTOR分子的相对性能，其中所述全长的ARRESTOR分子在环周围的其5′末端延伸，贯穿探针miRNA特异性区域的全长并且至5′flap区域，所述截短的ARRESTOR分子仅仅互补于探针的miRNA特异性区域和所述5′flap的一部分，但是不延伸到环状区域或更远区域。反应如下进行设置以检测合成的let-7amiRNA
6μl初级反应混合物的分装物加入到微量滴定平板适当的孔中，之后加入如下表中指出的4μl合成let-7a miRNA的分装物或4μl溶于蒸馏水的10ng/μl tRNA的分装物。初级INVADER反应在53℃孵育1.5小时。
次级反应混合物的分装物如下加入
次级反应在60℃孵育1.5小时。微量滴定平板如实施例2描述地进行读数。结果显示在图17中。
这些结果表明，当互补于所述探针miRNA特异性部分的全长的或截断的ARRESTOR寡核苷酸用于次级INVADER反应中时，信号的产生或检测限没有明显地不同。
B.使用线性探针和INVADER寡核苷酸可选的设计
对可选的设计进行测试，其中所述探针和INVADER寡核苷酸都含有通用序列，并且没有寡核苷酸形成发夹。所述设计的示意图呈现在图4中。所述通用序列存在于INVADER寡核苷酸的5′末端和探针寡核苷酸的3′末端。加入短的互补的“捕获”寡核苷酸，并且包含2′-氧-甲基残基，允许它在miRNA(例如SEQ ID NO60)的存在下促进同轴堆积。产生miR-15(SEQ ID NO58、59和60)和mir-135(SEQID NO63-65)的设计。最初的设计虽然在无miRNA靶的存在下导致了高的非特异性背景信号，但是指出了用这样的通用捕获寡核苷酸检测miRNA是可行的。
实施例9
环中核苷酸残基2′-氧-甲基化的作用
这个实施例描述了旨在评定用于检测miRNA之整合于所述探针和INVADER寡核苷酸中的一些或全部2′-氧-甲基残基被2′-脱氧残基取代的作用的实验。在前述的实施例中呈现的所有设计都包括了如实施例2中描述的所述环区域中的2′-氧-甲基残基。进行实验以测试为了检测let-7a miRNA设计的INVADER和探针寡核苷酸中一些或全部2′-氧-甲基残基被2′脱氧残基取代的作用。
图5显示了改良的let-7a设计。SEQ ID NO5-6含有如实施例2中描述的2′-氧-甲基残基。SEQ ID NO73-74中的设计在所有的位置都含有2′脱氧残基；并且在SEQ ID NO75-76中的那些设计，在邻近靶的所述茎干部分中含有2′-氧-甲基残基。
进行INVADER反应以比较三个不同设计的信号产生和温度的最优化。反应如实施例8中LOD试验中描述的，包括100pM合成的miRNA、1μM探针和10μM INVADER寡核苷酸。初级反应在所示温度进行15分钟；次级反应在60℃进行5分钟。
INVADER试验的结果显示在图21中，显示其中所述茎环结构包含2′-氧-甲基残基的设计产生最多的信号，之后是其中邻近靶的碱基包含2′-氧-甲基残基的设计。完全包含2′-脱氧残基的寡核苷酸产生最低水平的信号。
另一套实验如下设计以测试额外的设计变异有更短发夹的探针和INVADER寡核苷酸，有更稳定的环的或可选的有更短的环的探针和INVADER寡核苷酸，只有三个2′-氧-甲基残基的探针和INVADER寡核苷酸。初级反应如下设置以测试miR-15的检测。
对下面的探针/INVADER寡核苷酸的联合进行测试。
初级反应混合物如下制成
5μl初级反应混合物的分装物以下面的终量加入到5μl合成的miR-15RNA0、0.1阿摩尔(amole)、0.33阿摩尔、1.09阿摩尔。初级反应在52.5℃孵育2小时。
次级反应混合物如下制成
加入5μl的分装物，反应在600℃孵育45分钟。
结果，以相对荧光单位(RFU)，呈现如下。
这些结果提示，其中探针寡核苷酸含有截短的发夹和包含2′-氧-甲基残基的高度稳定的四环探针寡核苷酸的设计与最初的INVADER寡核苷酸的设计(2′-氧-甲基残基，TTTT环，长发夹)相组合，可以产生稍微更高的FOZ值。否则，没有一个可选的设计寡核苷酸套提供了任何在最初设计之上的提高。值得注目的是所有DNA寡核苷酸与最初嵌合探针寡核苷酸的组合给出大约等同于用嵌合探针和INVADER寡核苷酸获得的那些FOZ值。在一些应用中，所有DNAINVADER寡核苷酸的取代是期望的，以降低寡核苷酸合成成本，并且制备不会牺牲检测限。
更进一步的实验证明了通过往反应中加入更多的RNA(例如裂解物、纯化的总RNA、合成的miRNA)用特别的寡核苷酸集合补偿亚优化(suboptimal)信号的产生是可能的。相似地，如实施例1中描述的各种寡核苷酸(即探针、INVADER、ARRESTOR或其多种组合)被凝胶纯化的额外的实验指出，所有三种类型寡核苷酸的标准凝胶纯化给出了最大的信号。如果其它的寡核苷酸，即INVADER和ARRESTOR寡核苷酸在合成之后脱盐，那么获得大约等于用凝胶纯化探针的最大水平的信号水平是可能的。
实施例10
来自多重组织类型的总RNA中miRNA表达的检测
这个实施例描述了为了测试INVADER试验的适当性进行的实验，以检测提取自不同组织类型的总RNA中不同的miRNA类型。为了评价组织特异性基因表达，每一个设计的温度最优化和LOD先被测定。
1.INVADER和探针寡核苷酸设计
设计INVADER试验寡核苷酸以检测miR-15、miR-16和miR125bmiRNA种类。这些试验的设计呈现在图5中。Let-7a和miR-135的设计分别在实施例2和6中有描述。
2.温度最优化和LOD的测定
为了每一个这些寡核苷酸组合，温度最优化实验如实施例8中描述地而被实施。每一个初级反应包括1nM靶miRNA，并且在50±9℃的温度范围内进行15分钟。次级反应如实施例2中描述的，并且在60℃进行1至1.5小时。最优温度如下
一旦获得温度最优化，每个miRNA种类的LOD如实施例8中描述地进行测定。所有LOD是30仄摩尔。
3.基因表达谱(profiling)
基因表达谱在提取自20个不同组织类型的总RNA上进行。总RNA从Clontech购买(Palo Alto，CA，目录号K4008-1，Human TotalRNA Master Paneln)。对于let-7a，每个反应中对50ng的总RNA进行测试；对于其它的miRNA种类，对100ng的总RNA进行测试。所有反应如实施例8中所述进行设置；初级反应在最优温度进行1.5小时；次级反应是如上描述的。
每个miRNA种类的基因表达谱呈现在图23中。这些结果指出INVADER试验能被用于检查不同组织类型中miRNA的表达。这些数据进一步提示let-7a和miR-125b表达于各种各样的组织中；其它的miRNA种类似乎对于有限数量的组织类型更有特异性。
实施例11
不同的寡核苷酸长度对miRNA的INVADER试验检测的作用
这个实施例描述了探针和INVADER寡核苷酸长度的改变对let-7a 22个核苷酸的miRNA检测的影响。特别地是，这些实验比较了如下两种miRNA的检测所述探针和INVADER寡核苷酸的末端之间形成理想堆积相互作用的miRNA的检测，和形成5′和3′重叠的miRNA的检测以及在所述5′和3′末端得到单个核苷酸缺口的miRNA的检测。
图24显示了分析三种类型设计的结果。SEQ ID NO5-6显示了22个核苷酸靶与成环的探针和INVADER寡核苷酸的侧面末端之间完美的堆积。在SEQ ID NO83-84中，探针和INVADER寡核苷酸都延伸了一个碱基，得到了5′和3′重叠。在SEQ ID NO85-86中，探针和INVADER寡核苷酸相对于SEQ ID NO5-6的设计都截短了一个碱基，得到了在两个末端的一个核苷酸缺口。
设置INVADER试验以测试这些寡核苷酸组合对于合成let-7amiRNA检测的执行。反应如实施例8中所述进行，包括100pM合成的let-7a miRNA、1μM探针和10pM INVADER寡核苷酸。初级反应在53℃进行15分钟；次级反应如实施例2中描述地在60℃进行5分钟。结果呈现在图24中。
这些数据指出在这个实验中，在miRNA靶两个末端的单个核苷酸重叠导致信号的产生降低大约30％，最优温度降低2℃。然而，所述靶两个末端的一个核苷酸缺口都不降低信号的产生，但是它确实降低了最优反应温度5℃。
实施例12
miRNA与前体RNA以及与编码DNA的区别
为了测定INVADER miRNA试验是否能从miRNA靶的前体RNA以及从编码所述miRNA的DNA区分miRNA靶本身而进行实验。
A.前体交叉反应性测试
前体let-7 RNA(SEQ ID NO87)体外进行转录，通过毛细管电泳进行分析以测定它是否含有模仿let-7a miRNA的任何片段。最短的污染片段估计是大约45个核苷酸。LOD反应基本上如实施例3中描述地在如下表中指出的前体或合成的5′P let-7a miRNA浓度下进行。PI混合物含有10pM探针SEQ ID NO6和100μM INVADER寡核苷酸SEQ ID NO5。初级反应在53℃进行1小时；基本上如实施例3中描述的次级反应混合物(FRET探针SEQ ID NO21，SRT SEQ ID NO22和ARRESTOR SEQ ID NO7)的次级反应在58℃进行1小时。这个实验的结果指出这个miRNA试验对于前体RNA有大约4％的交叉反应性。
B.RNA对DNA信号的区别
为了检测细胞裂解物中的let-7a miRNA如实施例7中所述进行反应。在用INVADER试验的检测之前，1μl 8μg/μl RNAse A(Qiagen公司)的分装物加入到80μl细胞裂解物中并且在37℃孵育2.25个小时。RNAse A处理的样品不能产生任何背景之上的信号，指出缺乏RNAse A的试验中产生的信号起因于miRNA靶，而不是编码DNA的检测(图16)。进行更进一步的实验，其中RNAse A在初级反应之前或次级反应之前加入。当RNAse A在初级反应之前加入时，没有信号产生，与以前的结果一致。当RNAse A在初级反应之后加入，没有观察到丢失的信号，进一步指出检测的信号是因为RNA并且RNAse对例如CLEAVASE酶的其它反应组分没有不利的作用。
实施例13
双重形式miRNA的检测
产生为了miR-124a的寡核苷酸设计。这些寡核苷酸能用于检测两个天然发生的miRNA，一个长21个核苷酸，另一个22个核苷酸。
温度最优化反应基本上如实施例3中描述地被设置，使用1nM合成的miRNA靶、25分钟的初级反应和15分钟的次级反应。这些反应中使用的寡核苷酸列于图5中(SEQ ID NO90-92)。两个不同长度的miRNA靶的温度谱(profile)显示在图22中并且指出相同的寡核苷酸设计能被用于检测两个靶。
实施例14
siRNA检测的寡核苷酸设计
与前述的实施例中描述的那些相似的方法可以相似地被用于检测siRNA。图25阐述了β-肌动蛋白siRNA检测的两个可选的INVADER试验设计。这个siRNA在Harborth，J.等人，细胞科学杂志(Journalof Cell Science)，1144557-4565(2001)中有描述。对于每个有义和反义链存在一个设计；检测这个siRNA的示范性实例的寡核苷酸列于图6中，SEQ ID NO101-106。
上面详述中提到的所有出版物和专利此处引用作为参考。本发明描述的方法和系统的各种修饰和变异对于本领域的技术人员将是显而易见的，而不偏离本发明的领域和精神。尽管本发明连同特别的优选实施例有描述，应当理解所要求的本发明不应当被不适当地限制于这样特别的实施方案。当然，对分子生物学、基因或相关领域的技术人员是显而易见的为了进行本发明所描述的模式的各种修饰意在落入下面的权利要求范围之中。
权利要求
1.一种方法，包括
a)将干扰RNA靶杂交于至少一种核酸，所述核酸含有不互补于所述干扰RNA靶以产生检测结构的序列；以及
b)检测所述检测结构。
2.根据权利要求1的方法，其中所述干扰RNA靶是miRNA。
3.根据权利要求1的方法，其中所述干扰RNA靶是siRNA。
4.根据权利要求3的方法，其中所述siRNA是双链。
5.根据权利要求1的方法，其中所述检测结构包含侵入性切割结构。
6.根据权利要求2的方法，其中所述检测结构包含为了形成联合所述miRNA的侵入性切割结构而配置的第一和第二寡核苷酸。
7.根据权利要求2的方法，其中所述检测结构包含为了形成联合所述miRNA的侵入性切割结构而配置的第一寡核苷酸。
8.根据权利要求6的方法，其中所述第一寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述3′部分为了杂交于所述靶序列而配置，其中所述5′部分为了不杂交于所述靶序列而配置。
9.根据权利要求6的方法，其中所述第二寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述5′部分为了杂交于所述靶序列而配置，其中所述3′部分为了不杂交于所述靶序列而配置。
10.根据权利要求1的方法，其中所述检测包括侵入性切割试验的使用。
11.根据权利要求1的方法，其中所述检测结构包含杂交于所述miRNA的环形寡核苷酸以产生环形检测结构。
12.根据权利要求11的方法，其中所述检测包括滚环复制试验的使用。
13.根据权利要求1的方法，其中所述检测包括选自如下的检测试验的使用测序试验、聚合酶链式反应试验、杂交试验、采用互补于突变的探针之杂交试验、微阵列试验、珠子阵列试验、引物延伸试验、酶错配切割试验、支链杂交试验、NASBA试验、分子信标试验、循环探针试验、连接酶链式反应试验、侵入性切割结构试验、ARMS试验以及夹心杂交试验。
14.根据权利要求1的方法，其中所述检测在细胞裂解物中进行。
15.根据权利要求1的方法，其中检测多种不同的miRNA。
16.根据权利要求15的方法，其中所述多种miRNA包含第一miRNA和第二miRNA，所述第二miRNA为具有多态性的所述第一miRNA。
17.根据权利要求1的方法，进一步地包括检测第二核酸靶。
18.根据权利要求17的方法，其中所述第二核酸靶是RNA。
19.根据权利要求18的方法，其中所述第二核酸靶选自U6和GAPDH。
20.根据权利要求2的方法，其中所述miRNA选自Let-7、miR-1、miR-135、miR-15、miR-16、miR125b、miR-1d和miR124a。
21.一种试剂盒，其包含为了当杂交于干扰RNA靶序列时形成检测结构而配置的核酸，其中所述核酸包含不互补于所述干扰RNA靶序列的序列。
22.根据权利要求21的试剂盒，其中所述检测结构包含侵入性切割结构。
23.根据权利要求22的试剂盒，其中所述第一寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述3′部分为了杂交于所述靶序列而配置，其中所述5′部分为了不杂交于所述靶序列而配置。
24.根据权利要求22的试剂盒，其中所述第二寡核苷酸包含5′部分和3′部分，其中所述5′部分为了杂交于所述靶序列而配置，其中所述3′部分为了不杂交于所述靶序列而配置。
25.根据权利要求21的试剂盒，其中所述检测结构包含杂交于所述miRNA的环形寡核苷酸以产生环形检测结构。
26.根据权利要求25的试剂盒，其中所述检测结构是用于滚环复制试验的检测结构。
27.根据权利要求21的试剂盒，其中所述干扰RNA靶是miRNA。
28.根据权利要求21的试剂盒，其中所述干扰RNA靶是siRNA。
29.根据权利要求27的试剂盒，其中所述miRNA选自Let-7、miR-1、miR-135、miR-15、miR-16、miR-lb、miR-124a和miR125b。
30.根据权利要求21的试剂盒，其中所述试剂盒为了检测miRNA靶和至少一个其它的RNA靶而配置。
31.根据权利要求21的试剂盒，其中所述试剂盒为了检测细胞裂解物中所述干扰RNA靶序列而配置。
全文摘要
本发明涉及干扰RNA(诸如微小RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA))和其它短核酸分子的组合物及其检测和表征的方法。更加特别地，本发明涉及干扰RNA表达的检测和定量分析的改进方法。本发明更进一步地提供了miRNA和siRNA的变异体和类型的检测。
文档编号A61K48/00GK1753993SQ20038010977
公开日2006年3月29日 申请日期2003年12月18日 优先权日2002年12月18日
发明者J·E·达尔伯格, H·T·阿拉维, V·莱米柴夫, B·P·奈里, M·奥尔森－穆诺兹, L·柴哈克, S·M·奥尔森 申请人:第三次浪潮技术公司