核酸保护基的脱离方法

专利名称：：核酸保护基的脱离方法
技术领域：
：本发明涉及对于核糖的2'位羟基被下述取代基(I)保护、3'位羟基和5'位羟基被硅保护基保护的核糖核酸衍生物，除去核糖的3'位羟基和5'位羟基的硅保护基的方法。(I)式(I)中，WGi表示吸电子基团。作为WGi的吸电子基团，可例举例如氰基、硝基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、卤素。其中优选氰基。作为WGi的垸基磺酰基的烷基部分，可例举例如直链状或支链状的碳数15的烷基。具体可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基。作为W&的芳基磺酰基的芳基部分，可例举例如碳数612的芳基。具体可例举例如苯基、l-萘基、2-萘基、联苯基。该芳基可被取代，作为该取代基，可例举例如卤素、烷基、烷氧基、氰基、硝基，它们可在任意位置取代有13个。
背景技术：
：众所周知，低聚核糖核酸(低聚RNA)作为基因分析的RNA探针、RNA药物原材料(反义RNA、核酶、利用了RNAi的基因表达控制)、人工酶、适体有用。作为用于制造低聚RNA的试剂，已知的有核糖的2'位羟基被中性条件下可脱离的2-氰基乙氧基甲基(CEM基)取代的亚磷酰胺化合物(非专利文献1)。此外，作为用于制造低聚RNA的试剂，和田等人还提供了例如在2'位羟基导入了l-(2-氰基乙氧基)乙基(CEE基)的亚磷酰胺化合物(非专利文献2、非专利文献3)。据和田等人报道，在制造该亚磷酰胺化合物的过程中，为了脱离保护核糖的3'位羟基和5，位羟基的二硅氧垸基(-乂口年^/k基)，可使用氟化剂(氟化四丁基铵(以下称为TBAF))、三乙胺三氢氟酸盐、氢氟酸吡啶等)和酸(乙酸、盐酸、硫酸)的任意的混合比的混合试剂(专利文献1)。但是，实施例中仅有使用TBAF和乙酸的混合试剂进行二硅氧烷基的脱保护的例子。此外，据实吉等人报道，在制造2'位羟基被2-氰基乙基取代的亚磷酰胺化合物的过程中，为了脱离保护核糖的3'位羟基和5，位羟基的二硅氧垸基，可使用三乙胺三氢氟酸盐和三乙胺的1:0.5的混合比的混合试剂(非专利文献4)。专利文献l:国际公报W02005/023828Al文本非专利文献l:大木等，ORGANICLETTERS,Vol,7,3477(2005)非专利文献2:和田猛，BIOINDUSTRY,Vol.21，No.1，17(2004)非专禾U文献3:T.Umemoto等，TetrahedronLetters,Vol.45，9529(2004)非专利文献4:实吉尚郎等，JornalofOrganicChemistry,70,10453(2005)发明的揭示本发明的目的主要是提供对于核糖的2'位羟基被下述取代基(I)保护、3'位羟基和5'位羟基被硅保护基保护的核糖核酸衍生物，高效地将保护核糖的3'位羟基和5'位羟基的硅取代基脱离的方法。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(I)式(i)中，WG^n前所述。本发明者为了实现上述目的而进行了认真探讨，结果发现通过使以下的通式(2)表示的叔胺和氢氟酸的盐或叔胺和氢氟酸的混合物作用于以下的通式(l)表示的核糖核酸衍生物，可高效地制造以下的通式(3)表示的核糖核酸衍生物，藉此完成了本发明。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>式(l)、(2)及(3)中，Bz表示可具有保护基的核酸碱基或其修饰体，WG1如前所述，R7a、R7b、R"分别相同或不同，表示烷基，或者R73、R7b、R"表示与邻接的氮原子一起形成的2环性饱和氨基环基，x表示130的范围内的数，A表示以下的通式(4a)或(4b)表示的硅取代基，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>式(4a)及(4b)中，R6表示垸基。Bz的核酸碱基只要是被用于核酸的合成的碱基即可，无特别限定，例如可例举胞嘧啶、尿嘧唆等嘧啶碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤等嘌呤碱基。Bz的核酸碱基可被保护，其中具有氨基的核酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶，其氨基最好被保护。作为该氨基的保护基，只要是作为核酸的保护基使用的基团即可，无特别限定，具体可例举例如苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基。Bz的修饰体是指核酸碱基被任意的取代基取代而得的基团，作为该取代基，可例举例如卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基垸基、羟基、氨基、一垸基氨基、二垸基氨基、羧基、氰基、硝基，它们在任意的位置取代有13个。作为Bz的修饰体中的卤素，可例举例如氟、氯、溴、碘。作为Bz的修饰体中的酰基，可例举例如直链状或支链状的碳数16的垸酰基、碳数713的芳酰基。具体可例举例如甲酰基、乙酰基、正丙酰基、异丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、己酰基、苯甲酰基、萘甲酰基、乙酰丙酰基。作为Bz的修饰体中的烷基，可例举例如直链状或支链状的碳数15的垸基。具体可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基。该烷基可被取代，作为该取代基，可例举例如卤素、垸基、垸氧基、氰基、硝基，它们可在任意的位置取代有3个。Bz的修饰体中的芳烷基、烷氧基烷基、一烷基氨基、二烷基氨基及垸基磺酰基的烷基部分可例举与上述垸基相同的基团。作为Bz的修饰体中的烷氧基，可例举例如直链状或支链状的碳数14的垸氧基。具体可例举例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。其中较好的是碳数13的烷氧基，特好的是甲氧基。Bz的修饰体中的垸氧基烷基的垸氧基部分可例举与上述垸氧基相同的基团。Bz的修饰体中的芳烷基的芳基部分可例举例如碳数612的芳基。具体可例举例如苯基、1-萘基、2-萘基、联苯基等。该芳基可被取代，作为该取代基，可例举例如卤素、垸基、烷氧基、氰基、硝基，它们可在任意的位置取代有13个。作为Bz的修饰体中的垸基、芳基的取代基的卤素、垸基及垸氧基，可分别例举与上述相同的基团。作为R6的烷基，可例举例如直链状或支链状的碳数15的烷基。具体可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基。作为可在本发明中使用的叔胺和氢氟酸的盐或叔胺和氢氟酸的混合物，可例举例如上述通式(2)表示的叔胺和氢氟酸的盐或在合适的溶剂中叔胺和氢氟酸以任意比混合而得的混合物。作为R73、R7b、Rje的烷基，可例举与Bz的修饰体中的烷基相同的基团。作为R^、R7b、R"的2环性饱和氨基环基，可例举例如奎宁环、三亚乙基二胺。x表示130的范围内的数，可以不是整数，优选215的范围内的数，更好为310的范围内的数。作为本发明所用的叔胺，可例举例如三甲胺、三乙胺、三丙胺、三丁胺、N,N-二异丙基乙胺、奎宁环、三亚乙基二胺。作为本发明的叔胺和氢氟酸的盐，可例举例如三甲胺三氢氟酸盐、三甲胺四氢氟酸盐、三甲胺五氢氟酸盐、三甲胺六氢氟酸盐、三甲胺五氢氟酸盐、三乙胺二氢氟酸盐、三乙胺三氢氟酸盐、三乙胺四氢氟酸盐、三乙胺26氢氟酸盐、奎宁环三氢氟酸盐、三亚乙基二胺四氢氟酸盐(参照例如，分子结构期刊(JournalMolecularStructure)，193，247(1989)，Pol.J.Chem,67(2)，281(1993)，欧洲化学期刊(Chemistry-AEuropeanJournal),4(6),1043(1998),氟化学期刊(JournalofFluorineChemistry),118(1-2)，123,(2002))。尤其好的是三乙胺三氢氟酸盐。此外，作为可用于本发明的叔胺和氢氟酸的混合物，可例举例如上述叔胺和氢氟酸在适当的溶剂(例如，THF、乙腈、甲醇、异丙醇、甲苯)中例如以1:11:30(叔胺氢氟酸)的混合比(摩尔比)混合而得的混合物。优选以1:21:15(叔胺氢氟酸)的混合比(摩尔比)混合而得的混合物，更好是以1:31:10(叔胺氢氟酸)的混合比(摩尔比)混合而得的混合物。作为本发明，可例举以下的通式(A)表示的亚磷酰胺化合物(以下称为亚磷酰胺化合物(A))的制造方法，该方法包括通过使以下的通式(2)表示的叔胺和氢氟酸的盐或叔胺和氢氟酸的混合物作用于以下的通式(l)表示的核糖核酸衍生物，将保护核糖的3，位羟基和5'位羟基的硅取代基脱离，从而制造以下的通式(3)表示的核糖核酸衍生物的工序。式(l)、(2)及(3)中，A、Bz、Il7a、R7b、R7c、WG1、x如前所述。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>(A)式(A)中，Bz、WGi如前所述，R2a、R^相同或不同，表示垸基或R2a、R2b表示与邻接的氮原子一起形成的56元的饱和氨基环基，该饱和氨基环基除了氮原子以外可具有1个作为成环原子的氧原子或硫原子，WG2相同或不同，表示吸电子基团，R'表示以下的通式(5)表示的取代基。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>(5)式(5)中，R11、R12、R"相同或不同，表示氢或烷氧基。作为R11、R12、R"的烷基，可例举与上述Bz的修饰体中的垸基相同的基团。作为Rh、R^的垸基，可例举与上述Bz的修饰体中的烷基相同的基团。作为R23、R^的56元饱和氨基环基，可例举例如吡咯烷-1-基、哌啶-l-基、吗啉-l-基、硫代吗啉-l-基。作为WG2的吸电子基团，可例举与上述WG'的吸电子基团相同的基团。亚磷酰胺化合物(A)是核糖的2，位羟基被下述取代基(I)保护、3'位羟基和5'位羟基被硅保护基保护的亚磷酰胺化合物。此外，由于被导入2'位羟基的基团是直链状的取代基，与3'位的羟基结合的磷原子的周围的空间不拥挤，因此与以往使用的亚磷酰胺化合物相比，在合成低聚RNA时具有縮合反应在非常短的时间内进行、縮合收率良好的特点。通过使用亚磷酰胺化合物(A)，用与低聚DNA的制造大致相同的方法可制得高纯度的低聚■。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>(I)式(I)中，WG'如前所述。这里，低聚DNA是指仅由脱氧核糖核酸(DNA)形成的低聚核酸。此外，本发明中的低聚RNA是指由核糖核酸(RNA)及脱氧核糖核酸(DNA)形成的低聚核酸，是含有至少1个核糖核酸(RNA)的低聚核酸。以下对本发明进行详细说明。实施发明的最佳方式以下所示的制法中，在原料具备对反应有影响的取代基(例如，羟基、氨基、羧基)时，预先按照公知的方法用合适的保护基对原料进行保护后再进行反应。最后可通过催化还原、碱处理、酸处理等公知方法将保护基脱离。I.本发明的亚磷酰胺化合物(A)的制法以下，详述本发明的以下通式(A)表示的亚磷酰胺化合物(A)的制造方法(以下称为本发明的亚磷酰胺的制造方法)。亚磷酰胺化合物(A)可由公知化合物或易制备的中间体通过实施例如以下的步骤a步骤f的操作而制得。以下进行详细说明。(l)步骤a:通过使垸基化试剂作用于以下的通式(6)表示的核糖核酸衍生物，制备在2，位羟基导入了中性条件下脱离的醚型保护基的下述通式(1)表示的核糖核酸衍生物的步骤。rw院^l^、o6ho。v。-^、鹏,(6)(1>式(1)及(6)中，Bz、A、WG'如前所述。垸基化试剂可例举例如以下的通式(ll)表示的醚化合物。、0,U1)式(11)中，L表示卤素、芳硫基、院基亚砜基或烷硫基，WG'如前所述。L所表示的卤素、芳硫基中的芳基、垸基亚砜基及垸硫基中的垸基可例举与上述BZ的修饰体中的卤素、芳基、烷基相同的基团。作为醚化合物(ll)的具体例，可例举以下的1.2.的化合物。1.氯甲基2-氰基乙基醚2.2-氰基乙基甲硫基甲基醚醚化合物(11)是可在碱性条件下对2'位羟基导入中性条件下可脱离的醚型取代基的新的垸基化试剂，作为用于制备亚磷酰胺化合物(A)的试剂有用。醚化合物(ll)可通过实施以下的步骤1步骤4来制备。步骤1:将以下的通式(13)表示的醇化合物烷硫基甲基化，制备以下的通式(14)表示的化合物的步骤。(13)(14)式(13)及(14)中，WG'如前所述，R3表示垸基或芳基。化合物(14)是L为烷硫基的醚化合物(11)。R3所表示的烷基可例举与上述Bz的修饰体中的垸基同样的基团。R3为甲基时，作为烷硫基甲基化试剂，可例举例如二甲亚砜、乙酸酐及乙酸的混合溶液。二甲亚砜的用量相对于化合物(13)的摩尔量以10200倍摩尔量为宜，优选20100倍摩尔量。乙酸的用量相对于化合物(13)的摩尔量以10150倍摩尔为宜，优选20100倍摩尔量。乙酸酐的用量相对于化合物(13)的摩尔量以10150倍摩尔量为宜，优选20100倍摩尔量。反应温度优选0"C10(TC。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以148小时为宜。步骤2:将化合物(14)卤化，制备以下的通式(15)表示的化合物的步骤。R3八WG1-^X2、WG1(14)U5)式(14)及(15)中，WG1、R3如前所述，X2表示卤素。化合物(14)是醚化合物(11)中的L为卤素的化合物。X2所表示的卤素可例举与上述Bz的修饰体中的卤素同样的卤素。本步骤可按照公知的方法(例如，T.Benneche等，Synthesis762(1983))实施。所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲垸、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等卤代烃类。作为卤化剂，可例举例如硫酰氯、磷酰氯。卤化剂的用量相对于化合物(14)的摩尔量以0.820倍摩尔量为宜，优选110倍摩尔量。反应温度以0。C10(TC为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以30分钟24小时为宜。步骤3:将化合物(15)芳硫基化，制备以下通式(16)表示的化合物的步骤。X2、WG1_^R3aSA0WGl(16)(15)式(15)及(16)中，WG1、X2如前所述，R3a表示芳基。化合物(16)是醚化合物(11)中的L为芳硫基的化合物。R"所表示的芳基可例举与上述Bz的修饰体中的芳基同样的基团。本步骤可采用公知方法实施。所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、乙腈。作为芳硫基化试剂，可例举例如苯硫酚、4-甲基苯硫醇。芳硫基化试剂的用量相对于化合物(15)的摩尔量以0.820倍摩尔量为宜，优选15倍摩尔量。反应温度以0'C10(TC为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以148小时为宜。步骤4:将化合物(14)氧化，制备下述通式(17)表示的化合物的步骤。R3SA0WG1-^R3S、WG1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>式(14)及(17)中，WG1、R3如前所述。化合物(17)是醚化合物(11)中的L为烷基亚砜基的化合物。R3所表示的烷基可例举与上述Bz的修饰体中的垸基相同的基团。本步骤可采用公知方法实施。所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲垸、氯仿、甲醇。作为氧化剂，可例举例如间氯过苯甲酸、偏高碘酸盐、过氧化氢。氧化剂的用量相对于化合物(14)的摩尔量以0.810倍摩尔量为宜，优选12倍摩尔量。反应温度以0'CIO(TC为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以148小时为宜。烷基化试剂采用化合物(15)时，可如下实施。本步骤可按照公知方法，通过使烷基化试剂和碱作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的核糖核酸衍生物(6)而实施。所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲垸、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙垸等卤代烃类。垸基化试剂的用量相对于核糖核酸衍生物(6)的摩尔量以0.820倍摩尔量为宜，优选110倍摩尔量。本步骤中，也可根据需要使金属试剂和碱作用于核糖核酸衍生物(6)，制得中间体后再使垸基化试剂与之作用。所述金属试剂可例举例如二氯化二丁基锡、氯化叔丁基镁。金属试剂的用量相对于核糖核酸衍生物(6)的摩尔量以0.820倍摩尔量为宜，优选110倍摩尔量。作为碱，可例举吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N，N-二异丙基乙胺、1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一烯等有机碱。碱的用量相对于核糖核酸衍生物(6)的摩尔量以0.820倍摩尔量为宜，优选110倍摩尔量。反应温度以0r12(TC为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以30分钟24小时为宜。垸基化试剂采用化合物(14)或(16)时，可如下实施。本步骤可按照公知方法(例如，M.Matteucci，TetrahedronLetters,31巻，2385(1990))，通过使烷基化试剂、酸和针对于硫原子的卤化剂作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的核糖核酸衍生物(6)而实施。烷基化试剂的用量相对于核糖核酸衍生物(6)的摩尔量以0.85倍摩尔量为宜，优选13倍摩尔量。作为酸，可例举例如三氟甲磺酸、三氟甲磺酸银、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。酸的用量相对于核糖核酸衍生物(6)的摩尔量以0.0120倍摩尔量为宜，优选0.0210倍摩尔量。所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1，2-二氯乙垸、苯、甲苯、二甲苯、四氢呋喃(以下称为THF)、乙腈或它们的任意的混合溶剂。作为本步骤中所用的针对于硫原子的卤化剂，可例举例如N-溴琥珀酰亚胺(NBS)、N-碘琥珀酰亚胺(NIS)。针对于硫原子的卤化剂的用量相对于核糖核酸衍生物(6)的摩尔量以0.810倍摩尔量为宜，优选15倍摩尔量。反应温度以一78"C3(TC为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以5分钟5小时为宜。烷基化试剂采用化合物(17)时，可如下实施。本步骤可按照公知方法，通过使烷基化试剂、酸酐和碱作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的核糖核酸衍生物(6)而实施。烷基化试剂的用量相对于核糖核酸衍生物(6)的摩尔量以0.85倍摩尔量为宜，优选13倍摩尔量。作为酸酐，可例举例如三氟甲磺酸酐、乙酸酐。酸酐的用量相对于核糖核酸衍生物(6)的摩尔量以0.0120倍摩尔量为宜，优选O.0210倍摩尔量。作为碱，可例举例如四甲基脲、三甲基吡啶。碱的用量相对于核糖核酸衍生物(6)的摩尔量以0.0120倍摩尔量为宜，优选0.0210倍摩尔量。所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲垸、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷或它们的任意的混合溶剂。反应温度以一78。C30。C为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以5分钟24小时为宜。(2)步骤b:与步骤a分别进行，通过使二甲亚砜、乙酸和乙酸酐作用于核糖核酸衍生物(6)而制造下述通式(7)表示的核糖核酸衍生物的步骤。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>式(6)及(7)中，A、Bz如前所述。作为R6中的烷基，可例举与上述Bz的修饰体中的垸基相同的基团。本步骤可按照公知方法，通过使二甲亚砜、乙酸和乙酸酐作用于可作为市售品获得或可按照文献记载的方法合成的核糖核酸衍生物(6)而实施。二甲亚砜的用量相对于核糖核酸衍生物(6)的摩尔量以10200倍摩尔量为宜，优选20100倍摩尔量。乙酸的用量相对于核糖核酸衍生物(6)的摩尔量以10150倍摩尔量为宜，优选20100倍摩尔量。乙酸酐的用量相对于核糖核酸衍生物(6)的摩尔量以10150倍摩尔量为宜，优选20IOO倍摩尔量。反应温度以1CTC5(TC为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以30分钟24小时为宜。(3)步骤c:通过使下述通式(8)表示的醇化合物、酸和针对于硫原子的卤化剂作用于步骤b制得的核糖核酸衍生物(7)，制备在2'位羟基导入了中性条件下脱离的醚型保护基的下述通式(l)表示的核糖核酸衍生物的步骤。9、r7hoWG1o<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>式(7)、(8)及(1)中，A、Bz、WG'如前所述。本步骤可按照公知方法，通过使醇化合物(8)、酸和针对于硫原子的卤化剂作用于核糖核酸衍生物(7)而实施。所用溶剂只要不会影响反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙垸、苯、甲苯、二甲苯、THF、乙腈或它们的任意的混合溶剂。醇化合物(8)的用量相对于核糖核酸衍生物(7)的摩尔量以0.820倍摩尔量为宜，优选110倍摩尔量。作为酸，可例举例如三氟甲磺酸、三氟甲磺酸银、三氟甲磺酸三甲基硅烷基酯。作为针对于硫原子的卤化剂，可例举例如N-溴琥珀酰亚胺(NBS)、N-碘琥珀酰亚胺(NIS)。针对于硫原子的囟化剂的用量相对于核糖核酸衍生物(7)的摩尔量以0.l20倍摩尔量为宜，优选0.210倍摩尔量。反应温度以一10(TC2(TC为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以5分钟12小时为(4)步骤d:通过使以下的通式(2)表示的叔胺和氢氟酸的盐或叔胺和氢氟酸的混合物作用于步骤a或步骤c制得的核糖核酸衍生物(1)，将保护核糖的3'位羟基和5'位羟基的硅取代基脱离，藉此制造下述通式(3)表示的核糖核酸衍生物的步骤。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>式(l)、(2)及(3)中，A、Bz、R7a、R7b、R7c、WG1、x如前所述。本步骤可通过将核糖核酸衍生物(1)溶于合适的溶剂，使如上述通式(2)的叔胺和氢氟酸的盐或叔胺和氢氟酸的混合物与之反应而实施。此外，也可根据情况使用在叔胺和氢氟酸的盐或叔胺和氢氟酸的混合物中加入合适的酸而获得的混合试剂来实施本步骤。作为可使用的酸，可例举例如乙酸、盐酸、硫酸。该酸的用量相对于核糖核酸衍生物(l)的摩尔量例如以0.810为宜，优选11.5。作为可使用的溶剂，可例举例如THF、乙腈、甲醇、异丙醇、甲苯。特好为THF、乙腈。可用于本步骤的叔胺和氢氟酸的盐、叔胺和氢氟酸的混合物的用量根据核糖核酸衍生物(1)的种类或叔胺和氢氟酸的盐、叔胺和氢氟酸的混合物、所用溶剂等有所不同，但相对于核糖核酸衍生物(l)的摩尔量，以110倍摩尔量为宜，较好为1.21.5倍摩尔量。反应温度以0'C8(TC为宜。反应时间因核糖核酸衍生物的种类或所用的叔胺和氢氟酸的盐、叔胺和氢氟酸的混合物、所用溶剂、反应温度等而异，通常以30分钟10小时为宜。反应结束后直接冷却或在反应混合物中加入适量的水后冷却，藉此可作为析出物获得核糖核酸衍生物(3)。加入的水的量相对于所用溶剂的量以0.055倍量为宜，较好为O.06l倍量，更好为0.070.1倍量。(5)步骤e:(1)Bz在步骤d制得的核糖核酸衍生物(3)的5'位羟基导入酸性条件下脱离的保护基(R1)的制造核糖核酸衍生物(10)的步骤。式(3)、(9)及(10)中，Bz、R1、WG'如前所述，X3表示卤素。X3所表示的卤素可例举与上述Bz的修饰体中的卤素相同的卤素。本步骤可按照公知的方法，通过使R^3(9)作用于核糖核酸衍生物(3)而实施。R'X3(9)的用量相对于核糖核酸衍生物(3)的摩尔量以0.820倍摩尔量为宜，优选110倍摩尔量。所用溶剂只要对反应没有影响即可，无特别限定，可例举例如乙腈、THF等。作为碱，可例举吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4,6-三甲基吡啶、N-甲基咪唑、三乙胺、三丁胺、N，N-二异丙基乙胺、1,8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一烯等有机碱。碱的用量相对于核糖核酸衍生物(3)的摩尔量以0.820倍摩尔量为宜，优选110倍摩尔量。反应温度以0'C12(TC为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以30分钟24小时为宜。(6)步骤f:通过使亚磷酰胺化试剂和根据需要使用的活化剂作用于步骤e制得的核糖核酸衍生物(IO)，制备3'位羟基被亚磷酰胺化的亚磷酰胺化合物(A)的步骤。式(10)及(A)中，Bz、R1、R2a、R2b、WG1、WG2如前所述。作为亚磷酰胺化试剂，可例举例如下述通式(12a)、(12b)表示的化合物。(A)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>式(12a)及(12b)中，R2a、R2b、WG2如前所述，X'表示卤素。X'所表示的卤素可例举与上述Bz的修饰体中的卤素相同的卤素。本步骤是使亚磷酰胺化试剂作用于核糖核酸衍生物(IO)而将3'位羟基亚磷酰胺化的反应，可按照公知的方法实施。根据需要还可采用活化剂。所用溶剂只要对反应没有影响即可，无特别限定，可例举例如乙腈、THF。亚磷酰胺化试剂的用量相对于核糖核酸衍生物(10)的摩尔量以0.820倍摩尔量为宜，优选110倍摩尔量。作为活化剂，可例举例如1H-四唑、5-乙硫基四唑、5-苯甲基巯基-1H-四唑、4，5-二氯咪唑、4,5-二氰基咪唑、三氟甲磺酸苯并三唑盐、三氟甲磺酸咪唑盐、三氟甲磺酸吡啶镞盐、N，N-二异丙基乙胺、2,4，6-三甲基吡啶/N-甲基咪唑。活化剂的用量相对于核糖核酸衍生物(10)的摩尔量以0.820倍摩尔量为宜，优选110倍摩尔量。反应温度以0'C12(TC为宜。反应时间因所用原料的种类、反应温度等而异，通常以30分钟24小时为宜。如上所制备的亚磷酰胺化合物(A)本身可通过例如浓縮、液相转换、转溶、溶剂萃取、结晶化、重结晶、分馏、层析等公知的方法进行分离精制。II.低聚RNA的制法通过使用亚磷酰胺化合物(A)，可制造以下的通式(B)表示的低聚RNA(以下称为低聚RNA(B))。以下进行详述。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>式(B)中，各B分别独立，表示核酸碱基或其修饰体，各Q分别独立，表示O或S，各R分别独立，表示H、羟基、卤素、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基或烷氧基垸基氧基，但至少l个表示羟基，z表示H、磷酸基或硫代磷酸基，n表示l200的范围内的整数。n较好为10100的范围内的整数，更好为1550的范围内的整数。对B表示的核酸碱基无特别限定，例如可例举胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶等嘧啶碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤等嘌呤碱基。B的修饰体是指核酸碱基被任意的取代基取代而得的基团，作为B的修饰体的取代基，可例举例如卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、氨基、一垸基氨基、二垸基氨基、羧基、氰基、硝基，它们在任意的位置取代有13个。作为B的修饰体中的卤素、酰基、垸基、芳烷基、垸氧基、垸氧基烷基、氨基、一烷基氨基、二烷基氨基，可例举与上述Bz的修饰体中的对应的基团相同的基团。作为R的卣素、烷氧基、烷基氨基或二烷基氨基，可例举与上述Bz的修饰体中的对应的基团相同的基团。作为R的垸氧基垸基氧基、烷硫基的烷基，可例举与上述Bz的修饰体中的烷基相同的基团。作为R的烷氧基烷基氧基的烷氧基，可例举与上述Bz的修饰体中的烷氧基相同的基团。作为R的链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基的链烯基，可例举例如直链状或支链状的碳数26的链烯基。具体可例举例如乙烯基、烯丙基、l-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、1-己烯基等。作为R的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基，可例举例如直链状或支链状的碳数24的炔基。具体可例举例如乙炔基、2-丙炔基、l-丁炔基等。使用亚磷酰胺化合物(A)的低聚RNA(B)的制法可按照公知方法进行，但也可以例如通过实施以下所示的步骤A步骤G的操作，分步骤地由3'至5'的方向縮合核酸单体化合物，藉此制备低聚RNA(B)。由低聚RNA的制法可制得各R中的至少1个为羟基的低聚RNA(B)。例如在后述的步骤B中，作为核酸单体化合物全部使用亚磷酰胺化合物(A)，藉此可制得各R都为羟基的低聚RNA(B)。被用于下述步骤的化合物及试剂中，除亚磷酰胺化合物(A)以外，只要是常用于低聚RNA或低聚DNA的合成的化合物及试剂即可，无特别限定。此外，与使用了现有的核酸合成试剂的情况同样，所有的步骤可采用人工方法或市售的DNA自动合成机来进行。用自动合成机进行反应时操作方法简便，且合成的准确性高，因此优选采用自动合成机的方法。此外，下述步骤A步骤G记载的化合物及试剂中，除核酸单体化合物以外，只要是常用于低聚DNA或低聚RNA的合成的化合物及试剂即可，无特别限定。(l)步骤A:使酸作用于以下的通式(18)表示的(低聚)核酸衍生物，藉此脱离5，位羟基的保护基，制备以下的通式(19)表示的低聚核酸衍生物的步骤。、Bx、？y'〕酸、9xrv1ws3、Bxn-1:§(18)(，9)式(18)及(19)中，各Q分别独立，其含义如前所述，n、R1、WGa如前所述，各Bx分别独立，表示可具有保护基的核酸碱基或其修饰体，各W分别独立，表示H、卤素、烷氧基、垸硫基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、垸氧基烷基氧基或以下的通式(20)表示的取代基，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>式(20)中，WGi如前所述。E表示酰基或以下的通式(21)表示的取代基。€5-连接基固相载体(21)连接基固相载体式(21)中，￡1表示单键或以下的通式(22)表示的取代基(<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>(22)式(22)中，Q、WG2如前所述。T表示H、酰氧基、卤素、垸氧基、垸硫基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、垸氧基烷基氧基、上述通式(20)表示的取代基或上述通式(21)表示的取代基，但E或T的任一方为取代基(21)。Bx的核酸碱基只要是被用于核酸的合成的碱基即可，无特别限定，例如可例举胞嘧啶、尿喷啶、胸腺嘧啶等嘧啶碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤等嘌呤碱基。Bx的核酸碱基可被保护，其中具有氨基的核酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶，其氨基最好被保护。作为该氨基的保护基，只要是作为核酸的保护基使用的基团即可，无特别限定，具体可例举例如苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基。Bx的修饰体是指核酸碱基被任意的取代基取代而得的基团，作为Bx的修饰体的取代基，可例举例如卤素、酰基、垸基、芳烷基、垸氧基、烷氧基烷基、羟基、氨基、一垸基氨基、二垸基氨基、羧基、氰基、硝基，它们在任意的位置取代有13个。作为Bx的修饰体中的卣素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基烷基、一烷基氨基、二垸基氨基，可例举与上述Bz的修饰体中的对应的基团相同的作为W的卤素、垸氧基、垸基氨基及二烷基氨基，可例举与上述Bz的修饰体中的对应的基团相同的基团。作为R4的烷氧基烷基氧基及烷硫基的垸基部分，可例举与上述BZ的修饰体中的垸基相同的基团。作为R4的烷氧基烷基氧基的烷氧基部分，可例举与上述Bz的修饰体中的烷氧基相同的基团。作为w的链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基的链烯基部分，可例举与上述R的链烯基相同的基团。作为w的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分，可例举与上述R的炔基相同的基团。w的烷基氨基、链烯基氨基、炔基氨基可被保护，作为该保护基，只要是作为氨基的保护基使用的基团即可，无特别限定，可例举例如三氟乙酰基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基。特好的是三氟乙酰基。作为E的酰基，可例举与上述Bz的修饰体中的酰基相同的基团。作为T的酰氧基中的酰基部分，可例举与上述Bz的修饰体中的酰基相同的基团。作为T中的卤素、烷氧基、烷基氨基及二烷基氨基，可例举与上述Bz的修饰体中的对应的基团相同的基团。作为T中的烷氧基烷基氧基及烷硫基的垸基部分，可例举与上述Bz的修饰体中的垸基相同的基团。作为T中的烷氧基烷基氧基的烷氧基部分，可例举与上述Bz的修饰体中的烷氧基相同的基团。作为T中的链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基的链烯基部分，可例举与上述R中的链烯基相同的基团。作为T中的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分，可例举与上述R中的炔基相同的基团。T中的烷基氨基、链烯基氨基、炔基氨基可被保护，作为该保护基，只要是作为氨基的保护基使用的基团即可，无特别限定，可例举例如三氟乙酰基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基。特好的是三氟乙酰基。该步骤可通过使酸作用于被负载于固相载体的以下的通式(23a)、(23b)表示的核酸衍生物(11=1的核酸衍生物(18))或通过进行步骤A步骤D的操作而制得的被负载于固相载体的低聚RNA或低聚DNA(n二2100的低聚核酸衍生物(18))(以下称为被负载于固相载体的低聚核酸衍生物)而实施。式(23a)及(23b)中，Bx、Ri如前所述，R2L、1141^表示上述取代基(21)，R2表示酰氧基，R"表示H、酰氧基、卤素、垸氧基、垸硫基、烷基氨基、二烷基氨基、链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基、烷氧基烷基氧基或上述取代基(20)。作为R2、R"的酰氧基的酰基部分，可例举与上述Bz的修饰体中的酰基相同的基团。作为R"的卤素、烷氧基、烷基氨基及二烷基氨基，可例举与上述Bz的修饰体中的各对应的基团相同的基团。作为R4a的烷氧基烷基氧基及烷硫基的烷基部分，可例举与上述Bz的修饰体中的垸基相同的基团。作为R4a的烷氧基烷基氧基的烷氧基部分，可例举与上述Bz的修饰体中的烷氧基相同的基团。作为R"的链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基的链烯基部分，可例举与上述R中的链烯基相同的基团。作为R"的炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基的炔基部分，可例举与上述R中的炔基相同的基团。R"的氨基、烷基氨基、链烯基氨基、炔基氨基可被保护，作为该保护基，只要是作为氨基的保护基使用的基团即可，无特别限定，可例举例如三氟乙酰基、苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基。特好的是三氟乙酰基。作为固相载体，可例举例如可控孔度玻璃(controlledporeglass;CPG)、草酰化-可控孔度玻璃(例如参照Alul等，NucleicAcidsResearch,Vol.19，1527(1991))、TentaGel支承体-氨基聚乙二醇衍生物化支承体(例女口参照Wright等，TetrahedronLetters,Vol.34，3373(1993))、Poros-聚苯乙烯/二乙烯基苯的共聚物。作为连接基，可例举例如3-氨基丙基、琥珀酰基、2，2，-二乙醇磺酰基、长链烷基氨基(LCAA)。核酸衍生物(23a)、核酸衍生物(23b)是按照公知方法制得的或可作为市售品获得的被负载于固相载体的化合物，作为其优选例子，可例举以下的通式(24)、(25)表示的核酸衍生物。式(24)及(25)中，Bx、Q、R1、R4、WG2如前所述。R4为取代基(20)的核酸衍生物(24)、(25)可按照公知方法由亚磷酰胺化合物(A)制得。作为可用于本步骤的酸，可例举例如三氟乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸。该可用于本步骤的酸也可用适当的溶剂将其浓度稀释至15%后再使用。作为溶剂，只要不会对反应有影响即可，无特别限定，可例举二氯甲垸、乙腈、水或它们的任意的混合溶剂。上述反应的反应温度优选2(TC5(TC。反应时间因(低聚)核酸衍生物(18)的种类、所用酸的种类、反应温度等而异，通常以1分钟1小时为宜。所用试剂的量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以0.8100倍摩尔量为宜，更好为110倍摩尔量。(2)步骤B:采用活化剂使核酸单体化合物与步骤A制得的低聚核酸衍生物(19)縮合，制备以下的通式(26)表示的低聚核酸衍生物的步骤。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>核酸单体化合物——————-^-^&活化剂<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>式(19)及(26)中，各Bx、各Q、各R4、各WG2分别独立，其含义如前所述。E、n、R1、T如前所述。本步骤可通过使核酸单体化合物和活化剂作用于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物而实施。作为核酸单体化合物，可例举亚磷酰胺化合物(A)或以下的通式(27)表示的核酸衍生物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>式(27)中，R1、R2a、R2b、R4a、WG2如前所述，By表示可具有保护基的核酸碱基或其修饰体。作为By中的核酸碱基，只要是被用于核酸的合成的碱基即可，无特别限定，可例举例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶等嘧啶碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤等嘌呤碱基。BY中的核酸碱基可被保护，其中具有氨基的核酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶，其氨基最好被保护。作为该氨基的保护基，只要是作为核酸的保护基使用的基团即可，无特别限定，具体可例举例如苯甲酰基、4-甲氧基苯甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、苯基乙酰基、苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、(二甲基氨基)亚甲基。BY的修饰体是指核酸碱基被任意的取代基取代而得的基团，作为By的修饰体的取代基，可例举例如卤素、酰基、烷基、芳烷基、烷氧基、烷氧基垸基、羟基、氨基、一烷基氨基、二垸基氨基、羧基、氰基、硝基，它们可在任意的位置取代有13个。作为BY的修饰体中的卤素、酰基、垸基、芳烷基、烷氧基、垸氧基烷基、一烷基氨基、二垸基氨基，可例举与上述各Bz的修饰体中的对应的基团相同的基团。作为活化剂，可例举与上述相同的试剂。作为反应溶剂，只要不会对反应有影响即可，无特别限定，例如可例举乙腈、THF。上述反应的反应温度以2(TC50。C为宜。反应时间因低聚核酸衍生物(19)的种类、所用活化剂的种类和反应温度等而异，通常以l分钟1小时为宜。所用试剂的量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以0.8100倍摩尔量为宜，更好为110倍摩尔量。(3)步骤C:对在步骤B中未反应的低聚核酸衍生物(19)的5'位羟基进行加帽(capping)步骤。H--0<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>(19)(28)式(19)及(28)中，各Bx、各Q、各R4、各WG'分别独立，其含义如前所述，rS表示甲基、苯氧基甲基，e、n、t如前所述，rs表示甲基、苯氧基甲基、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>叔丁基苯氧基甲基。本步骤是对步骤B中未反应的5'位羟基进行保护的反应，可通过使帽化剂作用于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物而实施。作为帽化剂，可例举例如乙酸酐、苯氧基乙酸酐或叔丁基苯氧基乙酸酐。帽化剂也可用合适的溶剂将其浓度稀释至0.051M后再使用。作为溶剂，只要不会对反应有影响即可，无特别限定，可例举例如吡啶、二氯甲垸、乙腈、THF或它们的任意的混合溶剂。此外，该步骤中可根据需要使用反应促进剂，例如4-二甲基氨基吡啶、N-甲基咪唑。上述反应的反应温度以20°C5(TC为宜。反应时间因低聚核酸衍生物(19)的种类、所用帽化剂的种类、反应温度等而异，通常以l分钟30分钟为宜。所用试剂的量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以0.8100倍摩尔量为宜，较好为110倍摩(4)步骤D:通过使氧化剂作用于步骤B中制备的低聚核酸衍生物(26)而将亚磷酸基转变为磷酸基或硫代磷酸基的步骤。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>式(26)及(29)中，各Bx、各Q、各R4、各\\^32分别独立，其含义如前所述。E、n、R1、T如前所述。本步骤是利用氧化剂将3价磷转换为5价磷的反应，通过使氧化剂作用于被分子于固相载体的低聚核酸衍生物而实施。用氧来氧化磷时，作为氧化剂，例如可使用碘、过氧化氢叔丁基。该氧化剂也可用适当的溶剂将其浓度稀释至0.052M后再使用。作为用于反应的溶剂，只要不会对反应有影响即可，可例举吡啶、THF、水或它们的任意的混合溶剂。例如可米用碘/水/吡啶-THF或碘/吡啶-乙酸和过氧化剂(过氧化氢叔丁基/二氯甲垸等)。用硫来氧化磷时，作为氧化剂，例如可使用硫、Beaucage试剂(3H-苯并-1，2-二噻茂-3-酮-l，1-二氧化物)、3-氨基-l，2，4-二噻唑-5-硫酮(ADTT)。该氧化剂可用适当的溶剂将其浓度稀释至0.052M后再使用。作为用于反应的溶剂，只要不会对反应有影响即可，可例举二氯甲烷、乙腈、吡啶或它们的任意的混合溶剂。反应温度以2(TC5(TC为宜。反应时间因低聚核酸衍生物(26)的种类、所用氧化剂的种类、反应温度等而异，通常为l分钟30分钟。所用试剂的量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以0.8100倍摩尔量为宜，更好为1050倍摩尔量。(5)步骤E:将步骤D制备的低聚核酸衍生物(29)从固相载体切割(cleave)，脱离各核酸碱基部及各磷酸基的保护基的步骤。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>式(29)及(30)中，各B、各Bx、各Q、各R4、各WG2分别独立，其含义如前所述。E、R、R1、n、T、Z如前所述。切割步骤是利用切割试剂将所需链长的低聚RNA从固相载体及连接基切割的反应，可通过向负载有所需链长的低聚RNA的固相载体添加切割试剂而实施。本步骤中可脱离核酸碱基部的保护基。作为切割试剂，可例举例如浓氨水、甲胺等。本步骤中可使用的切割试剂也可用例如水、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、THF或它们的任意的混合溶剂稀释后再使用。其中，优选使用乙醇。o-z反应温度以15"75i:为宜，优选15。C30。C，更好为18°C25°C。脱保护反应时间以10分钟30小时为宜，优选30分钟24小时，更好为14小时。被用于脱保护的溶液中的氢氧化铵的浓度以2030重量％为宜，优选2530重量％，更好为2830重量％。所用试剂的量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以0.8100倍摩尔量为宜，更好为1050倍摩尔量。(6)步骤F:使用于脱离各核糖的2，位羟基的保护基的试剂作用于步骤E制造的低聚核酸衍生物(30)，藉此制备以下的通式(31)表示的低聚核酸衍生物的步骤。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>(30)(31)式(30)及(31)中，各B、各Q、各R、各W分别独立，其含义如前所述，n、R1、Z如前所述。本步骤可通过使脱离2'位羟基的保护基的试剂作用于低聚核酸衍生物(30)而实施。脱离2'位羟基的保护基的步骤可通过使作为脱离2'位羟基的保护基的试剂的例如TBAF、三乙胺三氢氟酸盐等作用而实施。所用的脱离2'位羟基的保护基的试剂的量相对于被脱离的保护基以1500倍摩尔量为宜，较好为510倍摩尔量。作为所用溶剂，只要是不会影响反应的溶剂即可，无特别限定，例如可例举THF、N-甲基吡咯垸酮、吡啶、二甲亚砜或它们的任意的混合溶剂。反应溶剂的用量相对于脱离2'位羟基的保护基的试剂以0.8100倍摩尔量为宜，较好为110倍摩尔量。反应温度以20'C8(TC为宜。反应时间因低聚核酸衍生物(30)的种类、所用脱离2，位羟基的保护基的试剂的种类、反应温度等而异，通常以1小时100小时为宜。此外，根据需要还可添加用于捕集本步骤中作为副产物生成的丙烯腈的试剂，作为丙烯腈的捕集剂，例如有硝基烷、烷基胺、脒、硫醇、硫醇衍生物或它们的任意的混合物。作为硝基烷，可例举直链状的碳数16的硝基垸。具体可例举硝基甲垸。作为烷基胺，可例举直链状的碳数16的烷基胺。具体可例举例如甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺。作为脒，可例举例如苯甲脒、甲脒。作为硫醇，可例举例如直链状的碳数l6的硫醇。具体可例举例如甲硫醇、乙硫醇、l-丙硫醇、1-丁硫醇、1-戊硫醇、l-己硫醇。作为硫醇衍生物，可例举例如具有相同或不同的直链状的碳数16的垸基巯基的醇或醚。具体可例举例如2-巯基乙醇、4-巯基-1-丁醇、6-巯基-1-己醇、巯基甲醚、2-巯基乙醚、3-巯基丙醚、4-巯基丁醚、5-巯基戊醚、6-巯基己醚。丙烯腈的捕集剂的用量因低聚核酸衍生物(30)的种类等而异，相对于保护低聚核酸衍生物(30)的各核糖的2'位羟基的2-氰基乙氧基甲基以0.8500倍摩尔量为宜，较好为110倍摩尔量。可通过使用例如萃取、浓縮、中和、过滤、离心分离、重结晶、硅胶柱色谱法、薄层色谱法、反相ODS柱色谱法、离子交换柱色谱法、凝胶过滤柱色谱法、透析、超滤等通常的分离精制方法，从上述反应混合物分离精制5'位得到了保护的低聚RNA。(7)步骤G:将低聚核酸衍生物(31)的5'位羟基的保护基脱离的步骤。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>式(31)及(B)中，各B、各Q、各R分别独立，其含义如前所述。n、R1.Z如前所述。本步骤是最终脱离低聚核酸衍生物(31)的5'位羟基的保护基的反应，可通过使酸作用于从固相载体切割得到的低聚RNA而实施。作为可用于本步骤的酸，可例举例如三氯乙酸、二氯乙酸、乙酸等。本步骤中可使用的酸也可用适当的溶剂稀释后再使用。作为溶剂，只要是不会对反应有影响的溶剂即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、乙腈、水、pH为25的缓冲液或它们的任意的混合溶剂。作为缓冲液，可例举例如乙酸缓冲液。上述反应的反应温度以2(TC5(TC为宜。反应时间因低聚核酸衍生物(31)的种类、所用酸的种类、反应温度等而异，通常以l分钟1小时为宜。所用试剂的量相对于被负载于固相载体的低聚核酸衍生物以0.8100倍摩尔量为宜，更好为110倍摩尔量。(8)步骤H:分离精制步骤G制备的低聚RNA(B)的步骤。分离精制步骤是指通过单独或组合使用例如萃取、浓縮、中和、过滤、离心分离、重结晶、C8-U的反相柱色谱法、Cs-d8的反相卡套柱(cartridgecolumn)色谱法、阳离子交换柱色谱法、阴离子交换柱色谱法、凝胶过滤柱色谱法、高效液相色谱法、透析、超滤等通常的分离精制方法，从上述反应混合物分离精制所需低聚RNA(B)的步骤。作为洗脱溶剂，可例举例如乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、水的单独溶剂或任意比例的混合溶剂。这种情况下，也可以lmM2M的浓度添加作为添加物的例如磷酸钠、磷酸钾、氯化钠、氯化钾、乙酸铵、乙酸三乙基铵、乙酸钠、乙酸钾、Tris-HC1、乙二胺四乙酸，在l9的范围调整溶液的pH。通过重复实施步骤A步骤D的操作，能够制得所需链长的低聚RNA(B)。作为本制法中用于制造低聚RNA(B)的起始原料，可使用R"为取代基(20)的核酸衍生物(23a)、R4a为H或酰氧基的核酸衍生物(23a)或R2为酰基的核酸衍生物(23b)等。作为起始原料，使用R"为H或酰氧基的核酸衍生物(23a)或R2为酰基的核酸衍生物(23b)时，作为核酸单体化合物的至少1种必须使用本发明的亚磷酰胺化合物。此外，本制法中在实施步骤E的操作前进行步骤F的操作，然后进行步骤E的操作，接着再进行步骤G的操作，也可分离精制低聚RNA(B)。实施例以下，例举参考例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不仅限定于此。参考例1氯甲基2-氰基乙基醚步骤1甲硫基甲基2-氰基乙基醚的制备将32g(450mmo1)3-羟基丙腈溶于450ml二甲亚砜，加入324mL乙酸酐和231mL乙酸，室温下搅拌24小时。将990g碳酸氢钠溶于4.5L水调制成溶液，用1小时的时间将反应液滴入该溶液中，随即搅拌l小时，用乙酸乙酯萃取反应液，用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，用硅胶柱色谱法对所得油状物进行精制，获得41g呈无色油状物的甲硫基甲基2-氰基乙基醚(收率70%)。!H—NMR(CDC13):2.18(s，3H);2.66(t，2H，J=6.3Hz);3.77(t,2H,J=6.3Hz);4.69(s，2H)步骤2氯甲基2-氰基乙基醚的制备使3.3g(25mmol)步骤1获得的甲硫基甲基2-氰基乙基醚溶于70mL二氯甲垸，冰冷下滴加2mL(25mraol)硫酰氯，再于室温反应1小时。反应后蒸除溶剂，在真空中进行蒸馏，获得2.5g呈无色油状物的目标化合物(收率85%)。沸点8485°C(0.3托)'H—NMR(CDC13):2.72(t，2H，J=6.3Hz);3.92(t，2H，J=6.3Hz);5.52(s，2H)参考例25，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3，-0-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)步骤15，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制备将546mg(lmmo1)5,-0-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)尿苷溶于4mL的1,2-二氯乙垸后加入452fflg(3.5ramol)二异丙基乙胺，再加入365mg(1.2腸1)二氯化二丁基锡，然后于室温反应l小时。升温至8(TC后滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，随即搅拌30分钟。反应结束后在饱和碳酸氢钠水溶液中加入反应液，用二氯甲烷萃取，再用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，利用30g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制，获得5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷(197mg,收率34%)。'H-醒R(CDC13):2.47(d，1H，J=7.8Hz);2.69(t，2H，J=6.3Hz);3.55(dd,1H，11.3,2.2Hz);3.62(dd，1H,11.3，2.2Hz);3.83(s，6H);3.87(t，2H，J=6.3Hz);4.07—4.08(m，1H);4.32(dd，1H，J=5.3，1.9Hz);4.54(q，1H，J=5.3Hz);4.94，5.11(2d，2H，J=6.9Hz);5.32(d,1H，J=8.2Hz);6.00(d，1H,J=1.9Hz);6.85-6.88(m,4H);7.29-7.41(m,9H);8.02(d，1H，J=8.2Hz);8.53(br.s，1H)ESI-质谱652[M+Na]+步骤25，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3'-0-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)的制备将209mg(0.332mmol)步骤1获得的5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷和23mg(0.332mmo1)四唑溶于2mL乙腈，再滴加150mg(0.498mmol)的2-氰基乙基N,N,N，，N，-四异丙基亚磷酰胺，于45。C反应1.5小时。反应后加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取，再用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，利用20g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制，获得目标化合物(200mg，收率73%)。ESI-质谱852[M+Na]+参考例32，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷步骤13，，5，-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制备氩气氛下，将150mg(0.3mmol)3'，5'-0-(四异丙基二硅氧烷-l，3-二基)尿苷溶于7mL的THF，加入54mg(0.4誦o1)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和100mg分子筛4A，搅拌10分钟。将温度调整为(TC，加入10mg(0.06mrao1)三氟甲磺酸的THF溶液2mL，搅拌后加入92mg(0.4mmol)N-碘琥珀酰亚胺，搅拌1小时。用硅藻土过滤反应液，用二氯甲垸洗涤后，有机相用1M硫代硫酸氢钠水溶液洗涤，再用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂。用薄层色谱法对所得残渣进行精制，获得3'，5'-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷(150mg，收率85%)。'H-醒R(CDC13):0.97-1.12(m'28H);2.68-2,73(m，2H);3.78-3.86(m，1H);3.96—4.05(m，2H);4.12—4.30(ra，4H);5.0—5.04(m，2H);5.70(d，1H，J=8.2Hz);5.75(s，1H);7.90(d,1H，J=8.2Hz);9.62(br.s，1H)ESI-质谱570[M+H]+步骤22，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制备将200mg(0,35mmol)步骤1获得的3'，5，-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷溶于2mL甲醇，再加入65mg(1.76mmo1)氟化铵，于5(TC加热搅拌5小时。放冷后加入乙腈搅拌，过滤浓缩。用硅胶柱色谱法对所得残渣进行精制，获得目标化合物(108mg，收率94%)。'H-NMR(CD30D):2.72-2.76(t，2H，J=6.2Hz);3.68-3.92(m，4H);4.00-4.03(m，1H);4.26—4.32(m，2H);4.81-4.95(m，2H);5.71(d，1H，J二8.1Hz);6.00(d，1H，J=3.3Hz);8.10(d，1H，J=8.1Hz)ESI-质谱350[M+Na]+参考例45，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷的制备将14g(43mraol)2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分钟。然后，溶于300mL的THF，在氩气氛下加入68g(856mmo1)吡啶和20g分子筛4A，搅拌10分钟。将19.6g(57.8mmo1)4,4，-二甲氧基三苯甲基氯以l小时的间隔分3次加入其中，再搅拌1小时。接着，加入10mL甲醇搅拌2分钟，再用硅藻土过滤，用乙酸乙酯洗涤。浓縮滤液后将残渣溶于乙酸乙酯，再与饱和碳酸氢钠水溶液分液。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂。用硅胶柱色谱法对所得残渣进行精制，获得目标化合物(26.5g，收率98%)。参考例5W-乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3，-0-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)步骤1Nt乙酰基-5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制备将588mg(lmmol)N4-乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)胞苷溶于4mL的1，2-二氯乙垸，加入452mg(3.5mmo1)二异丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基锡，室温下反应l小时。然后，将温度升至8(TC，滴加155.4mg(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，随即搅拌60分钟。反应结束后，在饱和碳酸氢钠水溶液中加入反应液，用二氯甲垸萃取，再用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，利用30g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制，获得N^乙酰基-5'-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷(219mg,收率35%)。'H—丽R(CDC13):2.19(s，3H);2.56(d，1H，J=8.8Hz);2.65(t，2H，J二6.2Hz);3.55(dd，1H,10,5，2.5Hz);3.63(dd,1H，10.5，2.5Hz);3,82(s,6H);3.86(t，2H，J=6.2Hz);4.09—4.14(m，1H);4.28(d，1H，J=5.1Hz);4.44—4.49(m，1H);4.97，5.24(2d，2H，J=6.9Hz);5.96(s，1H);6.86—6.88(m，4H);7.09(d，1H，J=6.9Hz);7.26—7.42(m，9H);8.48(d，1H，J=6.9Hz);8.59(br.s，1H)ESI-质谱693[M+Na]+步骤2W-乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3，-0-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)的制备将205mg(0.306画o1)步骤1获得的N4-乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0_(2-氰基乙氧基甲基)胞苷溶于2mL二氯甲烷，加入105mg(0.812ramol)二异丙基乙胺，再滴加116mg(0.49mmo1)2-氰基乙基N，N-二异丙基氯代亚磷酰胺，室温下反应l小时。反应后蒸除溶剂，利用20g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制，获得目标化合物(242mg，收率91%)。ESI-质谱871[M+H]+参考例6N^乙酰基-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷步骤1^-乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制备混合1.OOg(l.89mmol)N4-乙酰基-3，,5，-0-(四异丙基二硅氧垸-1，3-二基)胞苷和500mg(3.79rarao1)甲硫基甲基2-氰基乙基醚，将混合物溶于10mL甲苯和10mLTHF的混合溶剂。然后，加入975mg(3.79mmol)三氟甲磺酸银，再加入分子筛4A，干燥。冰冷下加入370mg(2.08mmol)N-溴琥珀酰亚胺，将反应容器遮光，搅拌10分钟。再追加70mg(0.39mmol)N-溴琥珀酰亚胺，搅拌25分钟。反应结束后加入二氯甲烷稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液进行洗涤，用无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制，获得N4-乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷(936mg，收率81%)。'H—NMR(CDC13):0.90—1.11(m，28H);2.28(s,3H);2.62—2.79(m，2H);3.78—3.89(m，1H);3.96—4.04(m，2H);4.19—4.23(m，3H);4.30(d，1H，J二13.6Hz);5.00(d,1H，J=6.8Hz);5.09(d，1H'J=6.8Hz);5.77(s,1H);7.44(d,1H，J=7.5Hz);8.30(d,1H，J=7.5Hz);10.13(s，1H)ESI-质谱611[M+H]+步骤2N4-乙酰基-2'-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制备将500mg(0.819mmol)步骤l获得的N4-乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷溶于2.5mLTHF和2.5mL甲醇的混合溶剂，加入150mg(4.10mmol)氟化铵，于5(TC反应4小时。反应结束后，用乙腈稀释，过滤，蒸除溶剂，再用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制，获得目标化合物(210mg，收率70%)。'H—NMR(D20):2.13(s，3H);2.66-2.71(m，2H);3.72—3.78(m，3H);3.90(dd，1H，J=13.0,2.6Hz);4.06—4.11(m，1H);4.20(dd，1H，J=7.1，5.2Hz);4.29(dd，1H，J=5.1,2.9Hz);4.83(d，1H，J=7.2Hz);4.94(d，1H，J=7.2Hz);5.95(d，1H，J=2.9Hz);7.25(d，1H'J=7.6Hz);8.25(d，1H，J二7.6Hz)ESI-质谱:391[M+Na]+参考例7N4-乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷的制备将9.9g(26.8mmo1)2，-0_(2-氰基乙氧基甲基)胞苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分钟。然后，溶于190mLTHF，在氩气氛下加入43g(538mmo1)吡啶和20g分子筛4A，搅拌10分钟。将11.8g(34.9mmol)4,4'-二甲氧基三苯甲基氯以1小时的间隔分3次加入其中，再搅拌1小时。接着，加入2mL甲醇搅拌2分钟，再用硅藻土过滤，用乙酸乙酯洗涤。用蒸发器浓缩滤液后将残渣溶于乙酸乙酯，再与饱和碳酸氢钠水溶液分液。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂。用硅胶柱色谱法对所得残渣进行精制，获得目标化合物(15g，收率83%)。参考例8W-乙酰基-5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2'-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)步骤1N2-乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备将627mg(lmraol)NL乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)鸟苷溶于4mL的1,2-二氯乙烷，加入452mg(3.5mmol)二异丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基锡，室温下反应l小时。然后，将温度升至80。C，滴加155.4mg(1.3mraol)氯甲基2-氰基乙基醚，随即搅拌60分钟。反应结束后，在饱和碳酸氢钠水溶液中加入反应液，用二氯甲垸萃取，再用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，利用30g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制，获得W-乙酰基-5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷(450mg，收率63X)。'H-丽R(CDC13):1.92(s，3H);2.47-2.51(ra，2H);2.68(br.s,1H);3.30(dd，1H,10.7，3.8Hz);3.47(dd,1H，10.7，3.8Hz);3.55—3.60(m，1H);3.65-3.70(m，1H);3.74,3.75(2s，6H);4.22-4.23(m，1H);4.55-4.58(m，1H);4.78，4.83(2d，2H，J=7.0Hz);5.01(t，1H，J=5.1Hz);5.99(d，1H，J=5.1Hz);6.76—6.79(ra，4H);7.17—7.44(m，9H);7.88(s，1H);8.36(br.s，1H);12.06(br.s，1H)步骤2tf-乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)的制备将400mg(0.563匪ol)步骤1获得的N2-乙酰基-5，-0-(4，4,-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷溶于2mL二氯甲烷，加入181mg(1.4mmol)二异丙基乙胺，再滴加161mg(0.68mmo1)2-氰基乙基N，N-二异丙基氯代亚磷酰胺，室温下反应l小时。反应后蒸除溶剂，利用20g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制，获得目标化合物(471mg，收率92%)。参考例9NL乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)步骤1If-乙酰基-5，_0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制备将22.0g(36.0讓ol)N6-乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)腺苷溶于170mL的1，2-二氯乙垸，加入16.3g(126mmol)二异丙基乙胺后加入12.lg(39.7mmol)二氯化二丁基锡，室温下反应1小时。然后，将温度升至8(TC搅拌15分钟，再滴加4.30g(36.0mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，随即搅拌30分钟。反应结束后，在饱和碳酸氢钠水溶液中加入反应液，用二氯甲垸萃取，再用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制，获得N6-乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2,-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷(7.47g，收率33%)。'H-廳R(CDC13):2.51(t，2H，J=6.2Hz);2.58(d，1H，J=5.5Hz);2.61(s，3H);3.45(dd,1H,J=10.7，4.0Hz);3.54(dd，1H，J=10.7，3.2Hz);3.62-3.79(m，2H);3.79(s，6H);4.25(br.q，1H，J=4.6Hz);4.59(q，1H，J=5.2Hz);4.87—4,94(m，3H);6.23(d，1H，J=4.4Hz);6.80-6.83(m，4H);7.22-7.32(m，7H);7.40-7.43(m，2H);8.20(s，1H);8.61(br.s，1H);8.62(s，1H)ESI-质谱695[M+H]+步骤2N6-乙酰基-5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3，-0-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)的制备将10.0g(14.4mmol)步骤1获得的N6-乙酰基-5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于75mL二氯甲垸，加入4.7g(36mmol)二异丙基乙胺，再滴加4.82g(20.3mmo1)2-氰基乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺，室温下反应l小时。反应后剩余30mL左右的溶剂，进行蒸除，再用硅胶柱色谱法对所得反应混合物进行精制，获得目标化合物(12.0g,收率93%)。ESI-质谱:895[M+H]+参考例10W-乙酰基-2'-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷步骤1N6-乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2'-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制备使245mg(1.09mmol)N-碘琥珀酰亚胺和280mg(1.09mmol)三氟甲磺酸银悬浮于8mL二氯甲烷，加入分子筛4A，干燥。冰冷下在其中加入将400mg(O.73mmol)N6-乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧垸-1，3-二基)腺苷和145mg(1.llmmol)甲硫基甲基2-氰基乙基醚溶于4mL二氯甲烷而形成的溶液，随即搅拌3小时。反应结束后加入二氯甲垸稀释，再用硫代硫酸钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液进行洗涤，用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，所得混合物用硅胶柱色谱法精制，获得N6-乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷(201mg，收率45%)。薩R(CDC13):0.98—1.11(m，28H);2.62(s，3H);2.69(td，2H，6.5,J=1.5Hz);3.81—3.89(m，1H);4.02—4.09(m，2H);4.17(d,1H，J=9.4Hz);4.28(d，1H，J=13.4Hz);4.50(d，1H，J=4.5Hz);4.67(dd，1H，J=8.8,4.5Hz);5.02(d，1H，J=7.0Hz);5.08(d,1H，J=7.0Hz);6.10(s，1H);8.34(s，1H);8.66(s，1H);8.67(s,1H)ESI-质谱:636[M+H]+步骤2N6-乙酰基-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制备将300mg(0.47mmol)步骤1获得的N6-乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于0.lmL乙酸和2mL的0.5MTBAF的THF溶液的混合溶液，室温下搅拌2小时。反应结束后用硅胶柱色谱法对所得反应混合物进行精制，获得目标化合物(160mg,收率86%)。'H-騰(DMSO-d6):2.25(s,3H);2.53-2.68(m，2H);3.41-3.46(m，1H);3.56-3.64(m,2H);3.69-3.73(m，1H);4.00-4.01(m，1H);4.36—4.37(m,1H);4.72—4.78(m，3H);5.20(bt，2H);5.41(d'1H，J=5.2Hz);6.17(d,1H，J=5.7Hz);8.66(s，1H);8.72(s'1H);10.72(s，1H)ESI-质谱415[M+Na]+参考例11N6-乙酰基-5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)_2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制备将9.50g(24.2腿ol)I^-乙酰基-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于100mL脱水吡啶，浓缩干燥后，氩气氛下溶于100mL脱水吡啶。冰冷下，加入10，7g(31.2mmo1)4，4，-二甲氧基三苯甲基氯，室温下反应1小时20分钟。反应结束后，用二氯甲垸稀释，再用水洗涤，用无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制，获得目标化合物(13.8g，收率82%)。参考例12Ni苯氧基乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)步骤1!f-苯氧基乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备将720mg(lmmol)N2-苯氧基乙酰基-5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)鸟苷溶于4mL的1，2-二氯乙烷，加入452mg(3.5mmol)二异丙基乙胺后加入365mg(1.2mmol)二氯化二丁基锡，室温下反应1小时。然后，将温度升至8CTC，再滴加155.4rag(1.3mmol)氯甲基2-氰基乙基醚，随即搅拌60分钟。反应结束后，在饱和碳酸氢钠水溶液中加入反应液，用二氯甲烷萃取，再用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂，利用30g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制，获得NL苯氧基乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷(384mg,收率48%)。'H—NMR(CDC13):2.47—2.51(m，2H);2.58(br.s，1H);3.42(dd，1H，10.1，3.8Hz);3.46(dd，1H，10.1，3.8Hz);3.53—3.57(m，1H);3.69一3.73(m，1H);3.77(s，6H);4,24—4.26(m，1H);4.48—4.50(m，1H);4.61-4.65(m，2H);4.83，4.87(2d,2H，J二7.0Hz);4.88(t，1H,J=5.7Hz);6.05(d，1H,J=5.7Hz);6.80—6.82(m，4H);6,92-6.96(m，3H);7.07-7,11(m，2H);7.20-7.42(m,9H);7.84(s，1H);8.99(s，1H);11.81(br.s，1H)ESI-质谱825[M+Na]+步骤2Ni苯氧基乙酰基-5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3'-0-(2-氰基乙基N,N-二异丙基亚磷酰胺)的制备将320mg(0.399誦o1)步骤1获得的N^苯氧基乙酰基-5，-0-(4，4,-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷溶于4raL二氯甲烷，加入128.8mg(0.996mmol)二异丙基乙胺，再滴加141.5mg(0.598mmo1)2-氰基乙基N，N-二异丙基氯代亚磷酰胺，室温下反应l小时。反应后蒸除溶剂，再利用30g的硅胶柱色谱对所得混合物进行精制，获得目标化合物(316mg，收率79%)。ESI-质谱1003[M+H]+参考例13N^苯氧基乙酰基-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷步骤1W-苯氧基乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备将2.0g(3.0mraol)N2-苯氧基乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)鸟苷溶于16mL的THF，加入0.99g(7.6mmo1)甲硫基甲基2-氰基乙基醚和1.0g分子筛4A，氩气氛下于一45。C搅拌IO分钟。然后，加入O.68g(4.5mmol)三氟甲磺酸的5mLTHF溶液，搅拌后加入1.02g(4.5mmo1)N-碘琥珀酰亚胺，搅拌15分钟。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，过滤后用乙酸乙酯萃取，有机相用1M硫代硫酸氢钠水溶液洗涤，再依次用水和饱和氯化钠水溶液洗涤，接着用无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂。所得残渣用硅胶柱色谱法精制，获得N2-苯氧基乙酰基-3',5，-0-(四异丙基二硅氧疾-l,3-二基)-2'-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷(2.0g，收率89X)。'H-NMR(CDC1》0.99—1.11(m,28H);2.59—2.77(m，2H);3.82—4.05(m，3H);4.15(d，1H,J=9.3Hz);4.25—4.35(m，2H);4.52-4.56(dd，1H，J=9,3，4.3Hz);5.00，5.07(2d，2H，J=7.2Hz);5.95(s，1H);6.99-7.12(m,3H);7.35-7.40(ra，2H);8.09(s，1H);9.38(br.s，1H);11.85(br.s，1H)ESI-质谱766[M+Na]+步骤2N2-苯氧基乙酰基-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备在2.83mL(2.83mmo1)的1MTBAF/THF溶液中加入0.14mL(0.14mmo1)乙酸，调制出溶液。将1.0g(1.35腿ol)步骤1获得的NL苯氧基乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧垸-1,3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷溶于2.83mLTHF，在其中加入先前调制的溶液，氩气氛下于室温搅拌1小时。减压下浓縮反应液后将其溶于二氯甲烷，用硅胶柱色谱法精制，获得目标化合物(0.67g，收率99%)。!H—NMR(DMS0—d6):2.59-2.66(m，2H);3.41—3.63(m，4H);3.98(m，1H);4,32(m,1H);4.58—4.62(t，1H，J=5.3Hz);4,71—4.78(dd，2H，J=13.1,6.8Hz);4.87(s,2H);5.12(s，1H);5.37(s，1H);5.97(d，1H，J=6.1Hz);6.96—6.99(m，3H);7.28—7.34(m,2H);8,30(s,1H);11.78(br.s，2H)ESI-质谱:500[M-H]-参考例14N2-苯氧基乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷的制备将660mg(1.32mmol)N2-苯氧基乙酰基-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷以吡啶共沸，用真空泵干燥30分钟。然后，溶于9mLTHF，在氩气氛下加入2.lg(26.4mmol)吡咬和600mg分子筛4A，搅拌10分钟。将540mg(1.58腿o1)4，4，-二甲氧基三苯甲基氯以1小时的间隔分3次加入其中，再搅拌1小时。接着，加入2mL甲醇搅拌2分钟，再用硅藻土过滤，用乙酸乙酯洗漆。用蒸发器浓縮滤液后将残渣溶于乙酸乙酯，再与饱和碳酸氢钠水溶液分液。有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂。用硅胶柱色谱法对所得残渣进行精制，获得目标化合物(800mg，收率75%)。参考例15N6-乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧烷-l,3-二*基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷步骤1N6-乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧垸-1，3-二基)-2'-0-甲硫基甲基腺苷的制备将2.00g(3.62mmol)N6-乙酰基-3，,5，-0-(四异丙基二硅氧烷-1,3_二基)腺苷溶于25mL二甲亚砜，加入17.5mL乙酸酐和12.5mL乙酸，室温下搅拌14小时。反应结束后在200mL水中加入反应液，用乙酸乙酯萃取，用饱和碳酸氢钠水溶液进行洗涤，再用无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，用硅胶柱色谱法对所得混合物进行精制，获得N6-乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2'-0-甲硫基甲基腺苷(l.36g，收率61%)。'H—NMR(CDC1》0.96—1.11(m,28H);2.20(s，3H);2.61(s，3H);4.03(dd,1H,J=13.4，2.4Hz);4.18(d，1H，J二9.1Hz);4.27(d,1H，J=13.4Hz);4.63-4.71(m，2H);5.00(d,1H，J=11.5Hz);5.07(d，1H，J=11.5Hz);6.09(s，1H);8.31(s，1H);8.65(s，1H);8.69(s，1H)ESI-质谱635[M+Na]+步骤2N6-乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷的制备将1.00g(1.63mmol)步骤1获得的N6-乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧烷-1,3-二基)-2，-0-甲硫基甲基腺苷溶于25mLTHF。加入5.88g(82.7mmo1)3-羟基丙腈，再加入分子筛4A，干燥，冷却至一45。C。接着，加入440mg(1.96mmol)N-碘琥珀酰亚胺，再加入490mg(3.26mmo1)三氟甲磺酸，于一45t:搅拌15分钟。反应结束后，在冷却的状态下加入三乙胺进行中和，用二氯甲烷稀释，再用硫代硫酸钠水溶液和饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂，所得混合物用硅胶柱色谱法精制，获得目标化合物(722mg，收率71%)。参考例16胞苷酰-[3'—5']-尿苷酰-[3'—5']-尿苷酰-[3'—5']-腺苷酰-[3'—5']-胞苷酰-[3'—5']-鸟苷酰-[3'—5']-胞苷酰-[3'—5']-尿苷酰-[3,—5，].-鸟苷酰-[3，—5，]-腺苷酰-[3,—5，]--鸟苷酰-[3，—5,]-尿苷酰-[3，一5，].-腺苷酰-[3,—5，].-胞苷酰-[3，—5，]-尿苷酰-[3，—5，]-尿苷酰_[3,—5，]'-胞苷酰-[3，—5,]'-鸟苷酰-[3，—5，]-腺苷酰-[3，—5，]-尿苷的制造将负载有市售的2，/3，-0-苯甲酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)尿苷的CPG固相载体(37mg，lumol)装入带玻璃滤器的柱子中，使用核酸自动合成机(Expedite:美国应用生物系统公司(AppliedBiosystems))进行作为标题化合物的低聚RNA的合成。作为核酸单体化合物使用5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)尿苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)、N4-乙酰基-5，-0-(4,4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)、N6-乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)、N2-苯氧基乙酰基-5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯甲基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷3，-0-(2-氰基乙基N，N-二异丙基亚磷酰胺)，作为縮合催化剂使用5-乙硫基四唑，作为氧化剂使用碘溶液，作为加帽剂溶液使用苯氧基乙酸酐和N-甲基咪唑溶液。使核酸单体化合物縮合19次后，在固相上进行5'末端的羟基的保护基的除去，然后，作为切割试剂使用浓氨水-乙醇混合液(3:l)，于4(TC用4小时实施从CPG固相载体的切割和各磷酸部位的保护基的脱离反应及碱基的保护基的除去。减压下浓縮反应混合物后，用含10%正丙胺、0.6%双(2-巯基乙基)醚的1M氟化四丁基铵的THF溶液于室温反应1小时，除去2'位羟基的保护基。进行溶液的脱盐处理后，用DEAE-离子交换树脂(TOYOPEARLDEAE-650)精制，获得高纯度的目标化合物(1120D26。，收率58%)。这里，作为目标化合物的收量，采用了波长260nm的紫外线吸光度(0D26。)。以下，同样地将吸光度(OD，)作为目标化合物的收量。MALDI-T0F-MS:计算值6305.9[M+H]+实测值6304.8[M+H]+试验例1W-乙酰基-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)胞苷将50g(95mmo1)的N4-乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧垸-1，3-二基)胞苷溶于500mL(142mmol)THF，加入18.64g甲硫基甲基2-氰基乙基醚和40g分子筛4A，氮气氛下于一45。C搅拌30分钟。滴加21.41g(142mmol)三氟甲磺酸后，加入31.97g(142mmol)N-碘琥珀酰亚胺，搅拌30分钟。在反应液中加入三乙胺80ml，过滤后用乙酸乙酯萃取，有机层依次用1M硫代硫酸氢钠水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和氯化钠水溶液洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂。将所得残渣溶于300mL的THF，加入18.3g(110mmo1)三乙胺三氢氟酸盐，于45。C搅拌2小时。通过吸滤回收生成的析出物，用冷却的THF洗涤，干燥，获得目标化合物(27g，收率78%)。ESI-质谱:391.3[M+Na]+<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>对于核糖的2，位羟基被l-(2-氰基乙氧基)乙基保护、3'位羟基和5，羟基被二硅氧垸基保护的胞苷衍生物，如果使用三乙胺三氢氟酸盐，将保护3，位羟基和5'位羟基的二硅氧烷基脱保护，则无需进行硅胶柱精制就能够作为析出物获得目标化合物。试验例2N2-苯氧基乙酰基-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷将47g(63mmo1)的N2-苯氧基乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧垸-1，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)鸟苷溶于280itiL乙腈，加入15.3g(95mmol)三乙胺三氢氟酸盐，于35'C搅拌2小时。用100ml对反应液萃取2次，在剩余的乙腈层中加入30ml水，室温下搅拌5分钟。通过吸滤回收生成的析出物，用冷却的混合溶剂(水乙腈=1:1)洗涤，干燥，获得目标化合物(22g，收率69%)。ESI-质谱:500[M—H]一<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>对于核糖的2'位羟基被1-(2-氰基乙氧基)乙基保护、3'位羟基和5，羟基被二硅氧垸基保护的鸟苷衍生物，如果使用三乙胺三氢氟酸盐，将保护3，位羟基和5，位羟基的二硅氧烷基脱保护，则无需进行硅胶柱精制就能够作为析出物获得目标化合物。试验例3N6-乙酰基-2'-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷将44g(69誦o1)的N6-乙酰基-3，，5，-0-(四异丙基二硅氧烷-l，3-二基)-2，-0-(2-氰基乙氧基甲基)腺苷溶于150mL的THF，将13.4g(83mmo1)的三乙胺三氢氟酸盐溶于50mL的THF形成的溶液，加入该溶液，于45。C搅拌1小时。反应结束后，加入50mL己垸，冰冷下搅拌。通过吸滤回收生成的析出物，获得目标化合物(29g,定量)。ESI-质谱415.4[M+Na]+<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>对于核糖的2'位羟基被1-(2-氰基乙氧基)乙基保护、3'位羟基和5，羟基被二硅氧垸基保护的腺苷衍生物，如果使用三乙胺三氢氟酸盐，将保护3，位羟基和5'位羟基的二硅氧垸基脱保护，则无需进行硅胶柱精制就能够作为析出物获得目标化合物。产业上利用的可能性利用本发明，在将保护核糖核酸衍生物(l)的核糖的3'位羟基和5'位羟基的硅取代基脱离的工序中，使叔胺和氢氟酸的盐或叔胺和氢氟酸的混合物作用，藉此无需硅胶柱精制操作，就能够以低成本高纯度地作为析出物获得核糖核酸衍生物(3)。因此，如果采用本发明，则能够以低成本制造可用于低聚RNA(B)的制造的亚磷酰胺化合物(A)。权利要求1.以下的通式(3)表示的核糖核酸衍生物的制造方法，其特征在于，使以下的通式(2)表示的叔胺和氢氟酸的盐或叔胺和氢氟酸的混合物作用于以下的通式(1)表示的核糖核酸衍生物，将保护核糖的3’位羟基和5’位羟基的硅取代基脱离，式(1)、(2)及(3)中，Bz表示可具有保护基的核酸碱基或其修饰体，R7a、R7b、R7c分别相同或不同，表示烷基，或者R7a、R7b、R7c表示与邻接的氮原子一起形成的2环性饱和氨基环基，x表示1～30的范围内的数，WG1表示吸电子基团，A表示以下的通式(4a)或(4b)表示的硅取代基，式(4a)及(4b)中，R6表示烷基。2.如权利要求1所述的核糖核酸衍生物的制造方法，其特征在于，x表示215的范围内的数。3.如权利要求1或2所述的核糖核酸衍生物的制造方法，其特征在于，叔胺和氢氟酸的盐是三乙胺三氢氟酸盐。4.如权利要求13中任一项所述的核糖核酸衍生物的制造方法，其特征在于，WG'为氰基。5.以下的通式(A)表示的亚磷酰胺化合物的制造方法，R1iOBzWG2R"N、R2b(A)式(A)中，Bz表示可具有保护基的核酸碱基或其修饰体，R'表示以下的通式(5)表示的取代基，(5)式(5)中，R11、R12、R"相同或不同，表示氢或烷氧基，R2a、R^相同或不同，表示垸基或R23、R2b表示与邻接的氮原子一起形成的56元的饱和氨基环基，该饱和氨基环基除了氮原子以外可具有1个作为成环原子的氧原子或硫原子，WG1、WG2相同或不同，表示吸电子基团，其特征在于，包括下述工序通过使以下的通式(2)表示的叔胺和氢氟酸的盐或叔胺和氢氟酸的混合物作用于以下的通式(l)表示的核糖核酸衍生物，将保护核糖的3'位羟基和5'位羟基的硅取代基脱离而制造以下的通式(3)表示的核糖核酸衍生物，xHF(2)WG1、WG1(3)式(l)、(2)及(3)中，Bz、WGi如前所述，R7a、R7b、R"分别相同或不同，表示烷基，或者R7a、R7b、R^表示与邻接的氮原子一起形成的2环性饱和氨基环基，x表示l30的范围内的数，A表示以下的通式(4a)或(4b)表示的硅取代基，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式(4a)及(4b)中，R6表示烷基。6.如权利要求5所述的亚磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，x表示215的范围内的数。7.如权利要求5或6所述的亚磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，叔胺和氢氟酸的盐是三乙胺三氢氟酸盐。8.如权利要求57中任一项所述的亚磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，WG'为氰基。9.以下的通式(A)表示的亚磷酰胺化合物的制造方法，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式(A)中，Bz表示可具有保护基的核酸碱基或其修饰体，W表示以下的通式(5)表示的取代基，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式(5)中，R11、R12、R"相同或不同，表示氢或烷氧基，R2a、R^相同或不同，表示烷基或R23、R2b表示与邻接的氮原子一起形成的56元的饱和氨基环基，该饱和氨基环基除了氮原子以外可具有1个作为成环原子的氧原子或硫原子，WG1、WG2相同或不同，表示吸电子基团，其特征在于，包括以下的步骤af，步骤a:通过使烷基化试剂作用于以下的通式(6)表示的核糖核酸衍生物，制备在2，位羟基导入了中性条件下脱离的醚型保护基的下述通式(1)表示的核糖核酸衍生物的步骤，、，取烷基化试剂<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式(1)及(6)中，Bz、W&如前所述，A表示以下的通式(4a)或(4b)表示的硅取代基，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式(4a)及(4b)中，R6表示垸基，步骤b:与步骤a分别进行，通过使二甲亚砜、乙酸和乙酸酐作用于核糖核酸衍生物(6)而制造下述通式(7)表示的核糖核酸衍生物的步骤，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式(6)及(7)中，A、Bz如前所述，步骤c:通过使下述通式(8)表示的醇化合物、酸和针对于硫原子的卤化剂作用于步骤b制得的核糖核酸衍生物(7)，制备在2'位羟基导入了中性条件下脱离的醚型保护基的下述通式(l)表示的核糖核酸衍生物的步骤，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式(l)、(7)及(8)中，A、Bz、WG工如前所述，步骤d:使以下的通式(2)表示的叔胺和氢氟酸的盐或叔胺和氢氟酸的混合物作用于步骤a或c制得的以下的通式(l)表示的核糖核酸衍生物，将保护核糖的3'位羟基和5，位羟基的硅取代基脱离而制造下述通式(3)表示的核糖核酸衍生物的步骤，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式(l)、(2)及(3)中，A、Bz、WG'如前所述，R7a、R7b、R7e分别相同或不同，表示垸基，或者R73、R7b、R"表示与邻接的氮原子一起形成的2环性饱和氨基环基，x表示l30的范围内的数，步骤e:在步骤d制得的核糖核酸衍生物(3)的5'位羟基导入酸性条件下脱离的保护基(R1)的制造核糖核酸衍生物(10)的步骤，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式(3)、(9)及(10)中，Bz、R1、WG^口前所述，X3表示卤素，步骤f:通过使亚磷酰胺化试剂和根据需要使用的活化剂作用于步骤e制得的核糖核酸衍生物(IO)，制备3，位羟基被亚磷酰胺化的以下的通式(A)表示的亚磷酰胺化合物的步骤，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式(10)及(A)中，Bz、R1、WG'如前所述，R2a、！^b相同或不同，表示烷基或R23、R2b表示与邻接的氮原子一起形成的56元的饱和氨基环基，该饱和氨基环基除了氮原子以外可具有l个作为成环原子的氧原子或硫原子，WG2表示吸电子基团。10.如权利要求9所述的亚磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，垸基化试剂为以下的通式(ll)表示的醚化合物，(11)式(11)中，L表示卤素、芳硫基、垸基亚砜基或垸硫基，^W^^表示吸电子基团。11.如权利要求9或10所述的亚磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，x表示215的范围内的数。12.如权利要求911中任一项所述的亚磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，叔胺和氢氟酸的盐是三乙胺三氢氟酸盐。13.如权利要求912中任一项所述的亚磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，^\^}1为氰基。14.如权利要求913中任一项所述的亚磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，亚磷酰胺化试剂为以下的通式(12a)或(12b)表示的化合物，t2aR2b，1(12a)(12b)式(12a)及(12b)中，R2a、R^相同或不同，表示烷基或R23、R"表示与邻接的氮原子一起形成的56元的饱和氨基环基，该饱和氨基环基除了氮原子以外可具有l个作为成环原子的氧原子或硫原子，WG2表示吸电子基团，X'表示卤素。15.如权利要求914中任一项所述的亚磷酰胺化合物的制造方法，其特征在于，步骤f中使用的活化剂为1H-四唑、5-乙硫基四唑、5-苯甲基巯基-lH-四唑、4，5-二氯咪唑、4，5-二氰基咪唑、三氟甲磺酸苯并三唑盐、三氟甲磺酸咪唑盐、三氟甲磺酸吡啶镜盐、N,N-二异丙基乙胺或2,4，6-三32:-Rb2RN-R甲基吡啶/N-甲基咪唑。16.以下的通式(B)表示的低聚RNA的制造方法:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式(B)中，各B分别独立，表示核酸碱基或其修饰体，各Q分别独立，表示O或S，各R分别独立，表示H、羟基、卤素、烷氧基、垸硫基、垸基氨基、二垸基氨基、链烯氧基、链烯硫基、链烯基氨基、二链烯基氨基、炔氧基、炔硫基、炔基氨基、二炔基氨基或烷氧基烷基氧基，但至少l个表示羟基，Z表示H、磷酸基或硫代磷酸基，n表示l200的范围内的整数，其特征在于，使用由权利要求515中任一项所述的制造方法制备的亚磷酰胺化合物。全文摘要本发明的目的是提供对于核糖的2’位羟基被所述取代基(I)保护、3’位羟基和5’位羟基被硅取代基保护的核糖核酸衍生物，以低成本大量且高效地将保护核糖的3’位羟基和5’位羟基的硅取代基脱离的方法，式(I)中，WG1表示吸电子基团。通过使通式(2)表示的叔胺和氢氟酸的盐或叔胺和氢氟酸的混合物作用于通式(1)表示的核糖核酸衍生物，将保护核糖的3’位羟基和5’位羟基的硅取代基脱离，藉此制造通式(3)表示的核糖核酸衍生物。文档编号C07H19/00GK101421289SQ20078001378公开日2009年4月29日申请日期2007年2月26日优先权日2006年2月27日发明者北川英俊,增田博文申请人:日本新药株式会社