专利名称：核酸靶分子选择及扩增方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸靶分子选择及扩增方法。
遗传诊断或分子检测的基本方法是测定核酸序列的碱基组成或变化。核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，核酸的基本单位是核苷酸，它们通过磷酸二脂键连成链状结构，核苷酸的特征决定于其碱基，DNA中的四种碱基由A、C、G、T表示，RNA中的四种碱基为A、C、G、U。核酸中的碱基A与T(或U)配对(互补)，G与C配对(互补)，因为它们之间能形成稳定的氢键结构。有连续配对碱基的两条核酸链能结合(杂交)成双链结构，双链核酸结构在高温(90℃-100℃)下会分裂(变性)成单链核酸分子。核酸中的自然产碱基或核苷酸可被非自然产的类碱基或非自然核苷酸取代。非自然核苷酸包括双脱氧核苷酸(ddNTP)、双环核苷酸(LNA)、生物素标记脱氧核苷酸(Biotin-dNTP)、荧光素标记的双脱氧核苷酸(F-ddNTP)及不具核苷酸结构特征的分子链，含有由非典型磷酸二酯键组成的核酸包括肽键核酸(PNA)和硫代磷脂键脱氧核糖核酸(S-DNA)。含有非自然类碱基或类核苷酸的核酸可具有荧光性、高稳定性、抗酶降解性，并能终止聚合酶反应等。对核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)进行分子检测时，需把核酸样品中的靶分子筛选出来并加以扩增(复制出多个同一分子)。靶分子是须检测的核酸片段，其结构特征可以代表所属生物体的遗传特征。靶分子可以是DNA、RNA或是在体外由RNA转录成的DNA。筛选扩增得到高纯度的大量的靶分子后，用分子生物学技术可以测定靶分子的结构特征，从而得知生物体(病人)的遗传特征。目前，对核酸中的靶分子进行选择和扩增采用聚合酶链反应(PCR)。对一个双链DNA靶分子进行聚合酶链反应时，要有二个对靶分子具专一性的、方向相反的单链核酸小分子，即引物。引物是由化学方法合成的单链的DNA分子，能与靶分子在末端进行分子杂交，其长度为10-50碱基。一个引物与靶分子中的一条分子链在3′末端进行杂交，并在聚合酶的作用下有选择性地复制靶分子，反复此过程可得到大量的靶分子。现已经知道，造成一种遗传病的基因位点变化可以是不止一个，也就是说要检测一种或多种遗传病时，所需选择和扩增的靶分子种数可达数百以上。所述的基因位点是指核酸结构中特定的碱基位置或具多态性的碱基位置。基因是核酸功能性的划分或具一定功能的核酸片段，具一定的结构特征。进行分子检测时，如用常规的PCR方法，需要合成大量的引物，并用大量的反应分别对靶分子进行选择和扩增。这种做法所需要的人力物力、费用都很大。如把多个引物组合在一个PCR反应中，这些引物之间的相互作用会产生副产物，因而影响靶分子的筛选和扩增。另一种分子扩增的方法是使双链的DNA分子与启动子连接，然后用核糖核酸聚合酶把DNA转录成单链的核糖核酸(RNA)。用转录的方法可以把DNA分子平衡扩增成大量的RNA分子，同时可对RNA进行分子内标记，但转录方法的扩增能力一般在数百倍左右，因此单用转录的方法也难以把极微量的核酸扩增至可用的量。从生物体中提取的DNA分子一般为双链的大分子结构，由数千个以上的碱基单位组成。用物理方法如超声波或生物化学方法如限制性内切酶，脱氧核糖核酸酶可使DNA降解为短小的分子片段，这一由大分子转化为多个小分子的过程叫片段化。在适当的条件下连接酶可把多个DNA片段连接在一起达到末端延伸的目的，DNA分子片段也可在末端转移酶的作用下使3′末端延伸，DNA聚合酶也可利用DNA链作为模板对与其杂交的分子链进行3′末端的延伸，此外DNA外切酶还可以除去部分DNA分子序列，因此末端修饰包括末端切除和末端延伸。用聚合酶对专一引物进行单碱基延伸是分析多态性的常用方法，经末端修饰后可用数量较少的引物对多个靶分子进行PCR扩增，但这种扩增缺少选择性，现已知可用与靶分子互补的核酸分子即选择分子进行杂交，把杂交分子选出，然后进行扩增，这样可达到选择的效果，但常用的选择分子往往与靶分子形成双链结构，这不利多态性靶分子的选择，此外选择分子本身也易被扩增，可能造成假阳性反应。
本发明的目的是提供一种对多个不同的核酸靶分子进行选择和扩增的方法，它能克服现有技术的上述缺点。
一种核酸靶分子选择和扩增的方法，包括使靶分子片段化并与选择分子杂交，再对靶分子进行末端修饰和扩增，其特征是选择分子具有非自然核苷酸单位，在选择分子与靶分子形成的杂交序列中有部分单链结构。
本发明的优点是能同时对大量的靶分子进行选择性修饰，然后用少量几种通用引物对大量种类的靶分子进行扩增，能简化分子检测过程，节省人力物力，降低利用核酸进行分子检测的成本。用本方法对靶分子进行扩增后，靶分子的结构特征可以通过杂交、序列测定、分子质量、分子大小、电荷量、分子量比值等进行测定，特别适用于生物芯片使用过程中的样品制备。本方法可用于测定动物、植物、微生物及病毒的基因型或其核酸量的多少。应用本方法可以制造有商业价值的试剂盒或从事分子诊断服务。
下面通过实施例说明本发明。
对一病人DNA样品中与遗传病相关的1000个多态性靶分子片段进行扩增，扩增前把DNA提纯，用限制性内切酶把DNA切成平均200碱基对的DNA分子片段，使这些分子片段变性成单链分子，然后与1000个选择分子杂交。选择分子为60碱基长，它们的5′末端有40核酸单位与相应的靶分子配对，但其第20位为缺少碱基的非自然核苷酸单位，并与靶分子的多态位点相对应，其3′端的第20个核苷酸单位为一共同序列，不与靶分子配对。在杂交分子形成以后，用具3′→5′外切酶活性的DNA聚合酶对靶分子及选择分子的3′末端进行修饰，其结果使靶分子的3′末端通过复制在选择分子的5′末端而延伸出一个共同序列，在选择分子的3′末端复制出靶分子的5′末端。此后用连接酶在靶分子5′末端延伸出另一共同序列。在以上过程中，单链的非靶分子及多余的选择分子被外切酶活性除去，经修饰后的杂交分子两端具有共同的序列，可用PCR进行扩增，由于选择分子有去碱基位点，因而能筛选出具多态性的靶分子但本身不被PCR扩增，所以扩增后的产物可用于遗传诊断。诊断前先对扩增的靶分子进行标记，然后对其进行基因芯片杂交分析，最后根据分析的结果推断病人的遗传特征。
本方法所用的靶分子分析方法包括单碱基延伸法、基因芯片方法、质谱方法、电泳方法、荧光法或放射性方法。
本方法所用的选择分子所含的非自然核苷酸单位为肽键核苷酸单位、硫代磷脂核苷酸单位、去碱基核苷酸单位以及不能形成碱基配对的类核苷酸单位。
根据本方法原理可制成试剂盒，该试剂盒包括所述的选择分子、PCR扩增所用的引物、所需的酶及缓冲剂。
本方法可用于动植物和微生物的核酸鉴定、包括物种鉴定、多态性测定，核酸分子数量测定，遗传特征测定。
本方法所用的扩增方法包括聚合酶反应，转录反应及这些反应的组合。
本方法所用的修饰反应包括连接酶反应，末端转移酶反应，外切酶反应，聚合酶反应及这些反应的组合。
权利要求
1.一种核酸靶分子选择和扩增的方法，包括使靶分子片段化并与选择分子杂交，再对靶分子进行末端修饰和扩增，其特征是选择分子具有非自然核苷酸单位，在选择分子与靶分子形成的杂交序列中有部分单链结构。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的选择分子所含的非自然核苷酸单位为肽键核苷酸单位、硫代磷脂核苷酸单位、去碱基核苷酸单位以及不能形成碱基配对的类核苷酸单位。
全文摘要
一种核酸靶分子选择和扩增的方法,包括使靶分子片段化并与选择分子杂交,再对靶分子进行末端修饰和扩增,其特征是选择分子具有非自然核苷酸单位,在选择分子与靶分子形成的杂交序列中有部分单链结构。本发明的优点是能同时对大量的靶分子进行选择性修饰,然后用少量几种通用引子对大量种类的靶分子进行扩增,能简化分子检测过程,节省人力物力,降低利用核酸进行分子检测的成本。
文档编号C12P19/00GK1344803SQ0112751
公开日2002年4月17日 申请日期2001年9月27日 优先权日2001年9月27日
发明者吴昌, 吴明 申请人:吴昌, 吴明