核酸包被的颗粒的制作方法

专利名称：核酸包被的颗粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及核酸包被的颗粒，其适于通过无针装置进行核酸的颗粒介导的递送。特别地，本发明涉及用于向体内和来自体内(ex vivo)的哺乳动物组织递送核酸分子的颗粒的应用。
背景技术：
基因治疗和核酸免疫对于获得性和遗传性疾病的治疗和预防均是具有前途的方法。这些技术为将所需核酸转移到受试者中以及随后在体内进行表达作准备。转移可通过转染来自体内的受试者的细胞或组织，再将经转化的物质导入宿主中而完成。可替换地，可将核酸直接在体内施用于受体。然而，体内递送方法必须允许核酸进入受体的细胞以使核酸能被表达。
在这些背景情况下，已发展了许多基因递送方法。在这些基因递送方法中，核酸的经皮递送比口服或肠胃外递送技术提供了许多优势。特别地，经皮递送相对于传统的给药系统提供了一种安全、方便和非侵入性的可选择方法，方便地避免了与以下递送相关的主要问题口服递送(例如可变化的吸收率、胃的降解和代谢、肝脏的首过效应、胃肠刺激和/或苦味或使人厌恶的药物味道)或肠胃外递送(例如针痛、给接受治疗的个体带来感染的风险、由意外的针刺给卫生保健人员带来的污染或感染的风险和对使用过的针的处理)。
然而，核酸的经皮递送也存在许多内在的问题。通过完整皮肤的被动递送使通过许多结构上不同的组织的分子转运成为必需。为能进入血液或淋巴系统，这些结构上不同的组织可包括角质层(主要的屏障)、有活力的表皮、乳头状真皮或毛细血管壁。因此，经皮递送系统必须能克服由各种类型的组织呈现的各种阻力。
因此，针对被动的经皮递送，已经开发了许多可选择的方法。这些可选择方法包括使用皮肤穿透增强剂或“穿透增强物”以增加皮肤的渗透性，也包括使用非化学方式如使用离子电泳、电穿孔或超声。然而，这些可选择的技术经常引起其自身的副作用如皮肤刺激或致敏。
最近，已开发了适于经皮递送核酸的颗粒介导技术。使用颗粒加速装置将携带有感兴趣的核酸的颗粒加速到高速并击入靶组织中。在体内，可将颗粒直接击入受体细胞，不需要细胞吸收乘载的核酸。
适于颗粒介导的递送的各种颗粒加速装置是本领域已知的。现有的装置使用爆发性的放电或放气，以向靶细胞推进包被的载体颗粒。例如，Biolistic装置直接将DNA包被的极小的金珠递送到表皮细胞中(Yang等(1990)PNAS USA 879568～9572)。使用无针注射器装置如Bellhouse等人的美国专利号5,630,796中描述的(“PowderJect无针注射器装置”)也可递送颗粒。
颗粒介导的装置意欲允许安全且容易地递送核酸。然而，需要对颗粒的物理特性进行改造以满足无针施用的要求，其中通常以非常高的速度击发颗粒。颗粒需要具有结构完整性，以使其可在例如注射器的气流或与皮肤或粘膜组织的弹道式碰撞中不被破坏。颗粒具有的密度也是重要的，该密度能使该颗粒获得足够动量以穿透组织。然而，对于核酸递送，颗粒应比细胞的尺寸小，这样其能穿透细胞膜而不使细胞破裂。核酸自身对贮存期间的降解是敏感的。因此，当与颗粒结合时，需要将核酸维持在稳定条件中。然而，核酸与颗粒的结合也应该在递送至靶细胞之后允许核酸进行有效的表达。当核酸编码抗原时，则颗粒结合的方式也应该使该抗原在受试者中具有免疫原性。
根据一种技术，适于颗粒介导的递送的颗粒可通过将核酸分子包被在惰性金属载体颗粒上而形成。载体颗粒选自具有合适密度和大小的物质，如钨或金。已知许多方法用于将DNA或RNA包被或沉淀在金或钨颗粒上。这些方法一般是将预定量的金或钨与质粒DNA、CaCl2和亚精胺混合。在包被过程中，将得到的溶液不断地涡旋以确保反应混合物的均一性。在核酸沉淀后，可将包被的颗粒转移至合适的膜上且使其在使用前干燥，或将其包被在样品模块或盒的表面上，或将其装入递送盒中用于特定的颗粒介导的递送设备中。

发明内容
已开发了一种新的制剂，以优化粘附于载体颗粒的核酸的稳定性而由此增长颗粒的储存期和增加递送给靶细胞的完整核酸量，以及优化递送至靶细胞后核酸的表达和生理活性。具体地，已发现，在核酸凝聚剂和金属离子螯合剂的存在下，可将核酸稳定地粘附于惰性金属载体颗粒上。
因此，在中性而不是碱性pH下可将核酸沉淀在载体颗粒上，从而有助于保持核酸的完整性。此外，然后可将颗粒在水性溶液或醇溶液中洗涤而不损失核酸，从而促进增强剂结合的稳定性。核酸的凝聚与螯合剂的化学作用一起保护核酸免受诸如自由基的氧化或核酸内切酶的消化等物理损伤和化学损伤。通过有效的颗粒介导的递送，可将本发明的颗粒递送至细胞。尽管有核酸颗粒结合的稳定性问题，但已显示了核酸在靶细胞中的有效表达。此外已证明了编码抗原的核酸的免疫效能。
因此，本发明提供了适于由颗粒介导的递送装置进行递送的颗粒，其中该颗粒是在核酸凝聚剂和金属离子螯合剂的存在下，通过将核酸沉淀在惰性金属载体颗粒上而获得的。
通过在颗粒制备中使用一种或多种糖和/或盐，和/或通过用抗氧化剂如乙醇或维生素A、C或E处理颗粒，可进一步改善颗粒制剂。
本发明还提供-一种适于由颗粒介导的递送装置进行递送的颗粒的制备方法，该方法包括以下步骤(i)在核酸凝聚剂和金属离子螯合剂的存在下，将核酸沉淀在惰性金属载体颗粒上；和(ii)收集得到的颗粒；-一种核酸免疫的方法，该方法包括(a)提供适于由颗粒介导的递送装置进行递送的颗粒，其中该颗粒是在核酸凝聚剂和金属离子螯合剂的存在下，通过将编码抗原的核酸沉淀在惰性金属载体颗粒上而获得的；和
(b)给受试者施用有效量的颗粒；一种基因治疗的方法，该方法包括(a)提供适于由颗粒介导的递送装置进行递送的颗粒，其中该颗粒是在核酸凝聚剂和金属离子螯合剂的存在下，通过将编码治疗性多肽的核酸沉淀至惰性金属载体颗粒上而获得的；和(b)给受试者施用有效量的颗粒；和-适于由颗粒介导的递送装置进行递送的颗粒，该颗粒包含惰性金属载体颗粒，在该惰性金属载体颗粒表面上具有核酸、金属离子螯合剂和一种或多种以下成分(i)核酸凝聚剂；(ii)一种或多种二糖和/或三糖；和(iii)一种或多种盐。
本发明还提供一种用于颗粒介导的递送装置的剂量容器，该容器含有本发明的颗粒，以及提供颗粒介导的递送装置，该颗粒介导的递送装置装载有本发明颗粒。
根据本文的公开，本发明的这些和其它目的、方面、具体实施方案和优点对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。
具体实施例方式
在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于特定的示例性分子或方法参数，因为这些当然可以改变。也应理解这里使用的术语只为了描述本发明的具体实施方案，而不是在于限制。此外，除非有其它明示，本发明的实施使用病毒学、微生物学、分子生物学、重组DNA技术和免疫学的常规方法，其所有方法都是在本领域的普通技术人员的知识范围内。这些技术已经在文献中得以充分解释。例如参见Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual(第二版，1989)；DNA CloningA PracticalApproach，第一卷和第二卷(D.Glover编辑)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait编辑，1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；和Fundamental Virology，第二版，第一卷和第二卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编辑)。
无论是上文还是下文，这里引用的所有出版物、专利和专利申请，在此全部引入作为参考。
必须指出的是，如本说明书和附带的权利要求书中使用的，单数形式“一种”、“一个”和“所述的”包括复数指示物，除非内容清楚地指示为其它方面。
除非进行了其它方面的定义，这里使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属技术领域的普通技术人员的一般理解相同。虽然可使用许多与这里描述的方法和物质相似或等效的方法和物质实施本发明，但是这里描述的是优选的物质和方法。
A.定义在本发明的描述中，将使用以下术语，且规定为如下显示的定义。
术语“核酸分子”和“多核苷酸”在这里可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，且可以行使任何已知或未知的功能。非限制性的多核苷酸的例子包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。
多核苷酸通常是由以下四种核苷酸碱基的特定序列组成的腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)(当多核苷酸是RNA时，尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T))。因此，术语核酸序列是多核苷酸分子的依字母顺序的表达。这种依字母顺序的表达可被输入到具有中央处理器的计算机的数据库中，并被用于生物信息学应用如功能基因组和同源性检索。
“编码”选定抗原的核酸序列是当将其置于适当的调控序列的控制下，在体内转录(在为DNA的情况下)并翻译(在为mRNA的情况下)成多肽的核酸分子。编码序列的范围是由5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子决定的。对于本发明的目的，这样的核酸序列可包括但不限于来自病毒、原核生物或真核生物mRNA的cDNA、来自病毒或原核生物DNA或RNA的基因组序列、和甚至合成的DNA序列。转录终止序列可定位于编码序列的3’端。
“载体”能够将核酸序列转移至靶细胞(例如，病毒载体、非病毒载体、颗粒载体和脂质体)。典型地，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”是指任何能指导感兴趣的基因进行表达的核酸构建体，其能将基因序列转移至靶细胞。因此，该术语包括克隆载体和表达载体。“质粒”是一种染色体外遗传元件形式的载体。
“启动子”是启动和调节多核苷酸转录的核苷酸序列。启动子可包括诱导型启动子(其中可操作地连接于启动子的多核苷酸序列的表达是由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导的)、阻抑型启动子(其中可操作地连接于启动子的多核苷酸序列的表达是由分析物、辅因子、调节蛋白等抑制的)和组成型启动子。术语“启动子”或“调控元件”意欲包括全长的启动子区和这些区域的功能性(例如调控转录或翻译)片断。
“可操作性地连接”是指元件的排列，其中所描述的组件被配置成执行它们通常的功能。因此，当存在适当的酶时，给定的可操作性地连接于核酸序列的启动子能影响该序列的表达。只要启动子对指导表达发挥作用，则启动子不必与该序列邻近。因此，例如，可在启动子序列和核酸序列之间存在不被翻译但被转录的间插序列，但启动子序列仍可被认为“可操作性地连接”于编码序列。
这里所用的“重组体”用于描述基因组、cDNA、半合成或合成来源的核酸分子(多核苷酸)，依据其来源或操作，与其天然相关联的多核苷酸的全部或部分不相关联，和/或与不同于其天然相连的多核苷酸相连。当两个包含在单个重组核酸分子内的核酸序列是天然非正常相互关联时，则它们是相互“异源”的。
“多肽”是使用其最宽泛的含义，是指两个或更多亚单位氨基酸、氨基酸类似物或其它肽模拟物的化合物。亚单位可通过肽键或诸如酯、醚等其它键连接。如这里使用的，术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，和氨基酸类似物和肽模拟物。如果肽链是短的，三个或更多氨基酸的肽一般称为寡肽。如果肽链是长的，则该肽通常称为多肽或蛋白质。
“抗原”是指任何物质，通常为大分子，其在个体中能引起免疫应答。该术语可用于指单个大分子或抗原性大分子的同源或异源群体。如这里使用的，“抗原”通常用于指含有一个或多个表位的蛋白质分子或其部分。根据本发明的目的，抗原可获自或源自任何合适的来源。此外，根据本发明的目的，只要蛋白质保持足够的免疫原性，“抗原”包括相对于天然序列具有改变如缺失、添加和取代(通常为天然保守的)的蛋白质。这些改变可以是有目的的，例如通过定点突变，或可以是偶然的，如通过使产生抗原的宿主发生突变。
对感兴趣的抗原的“免疫应答”是在个体内针对该抗原的体液和/或细胞免疫应答的发展。根据本发明的目的，“体液免疫应答”是指由抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”是由T-淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。
术语“核酸免疫”在这里用于指将编码一种或多种选定抗原的核酸分子导入到宿主细胞中以在体内表达一种或多种抗原。可通过经皮颗粒递送，将核酸分子直接导入到受体个体中。可选择地，可将该分子导入到已从受试者中移除的来自体内的细胞中。在该后者情况中，将含有感兴趣的核酸分子的细胞重新导入到受试者中，以至于能针对由核酸分子编码的抗原启动免疫应答。在这样的免疫中使用的核酸分子在这里通常称为“核酸疫苗”。
术语“经皮”递送意指皮内的(例如进入真皮或表皮)、经皮的(例如“经由皮肤的”)和经粘膜的给药，即将物质通过进入或经由皮肤或粘膜组织进行递送。参见，例如Transdermal Drug DeliveryDevelopmentalIssues and Research Initiatives，Hadgraff和Guy(编辑)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；Controlled Drug DeliveryFundamentals and Applications，Robinson和Lee(编辑)，Marcel Dekker Inc.，(1987)；和Transdermal Delivery ofDrugs，第1～3卷，Kydonieus和Berner(编辑)，CRC Press，(1987)。因此，该术语包括如美国专利号5,630,796中描述的从无针注射器的递送，也包括如美国专利号5,865,796中描述的颗粒介导的递送。
“无针注射器”意指一种经皮递送颗粒组合物的设备，不需要借助于常规的针来刺穿皮肤。用于本发明的无针注射器在整个本文中作了讨论。
术语“个体”和“受试者”在这里可交互使用，是指cordata亚门的任何成员，包括但不限于人和包括非人灵长类如黑猩猩和其它猿和猴类等在内的其它灵长类；养殖动物如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物如狗和猫；实验室动物包括啮齿类如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟，包括家养鸟、野生鸟和猎鸟如小鸡、火鸡和其它鹑鸡类的鸟、鸭、鹅等。该术语不限定特定的年龄。因此，意欲包括成体和新生个体。这里描述的方法意欲用于任何上述脊椎动物种类，这是由于所有这些脊椎动物的免疫系统以相似的方式发挥作用。
B.一般方法本发明涉及核酸的颗粒介导的递送。特别地，本发明提供适于由颗粒介导的递送装置进行递送的颗粒，且通过以下方法能获得该颗粒，所述方法包括或在一些实施方案中基本上由以下组成在核酸凝聚剂和金属离子螯合剂的存在下，将核酸沉淀在惰性金属载体颗粒上。
载体颗粒选自具有合适密度和合适颗粒大小的金属以用于由颗粒介导的递送装置进行细胞内递送。优选地，载体颗粒的密度例如为约15g/ml至25g/ml、约15g/ml至23g/ml或约16g/ml至20g/ml。载体颗粒可具有的直径为约0.5μm至10μm，例如约1μm至5μm。特别优选载体颗粒具有的直径为约0.5μm至3μm，例如约1μm至3μm或0.5μm至2μm。
金属载体颗粒是惰性的，因为其在待施用颗粒的来自体内的细胞内或受试者的体内是不反应的。典型地，使用金、钨、铂或铱载体颗粒。优选金或钨颗粒。金颗粒可以是胶体金颗粒。金颗粒提供尺寸方面的一致性(可获自Alpha Chemicals，颗粒大小为约1μm至3μm；或可获自Degussa，South Plainfield，NJ，颗粒大小范围包括0.95μm)和降低的毒性。微晶金(例如金粉A1570，可获自Engelhard Corp.，East Newark，NJ)提供不同的颗粒大小分布，典型地，范围为约0.1μm至5μm。然而，微晶金的不规则表面区域为高效的核酸包被提供了必要的准备。很容易获得平均直径大小约为0.5μm至2μm的钨颗粒。
典型地，核酸分子包括治疗上相关核苷酸序列以用于递送至受试者。优选本发明的颗粒适用于核酸免疫或基因治疗。因此核酸可包含能提供免疫的序列，例如当递送至受试者时，引起体液和/或细胞免疫应答的具有免疫原性的序列。可选择地，核酸可包含一个或多个编码治疗性多肽的基因，所述治疗性多肽例如靶细胞的基因组中具有缺陷或丢失的蛋白质或者具有所需生物学或治疗作用(例如抗病毒功能)的非天然蛋白质。核酸可包含编码具有反义或核酶功能的分子的序列。对于遗传病症的治疗，可将与特定病症中的已知缺陷基因对应的功能性基因施用于受试者。优选地，核酸为DNA。
用于递送的合适核酸包括用于治疗以下疾病的核酸炎性疾病、自身免疫、慢性和感染性疾病包括如AIDS(艾滋病)、癌症、神经疾病、心血管疾病、高胆固醇症；各种血液病症包括各种贫血、地中海贫血和血友病；遗传缺陷如囊性纤维化、高歇氏疾病、腺苷脱氨酶(ADA)缺乏、肺气肿等。许多在治疗癌症和病毒病的反义疗法中有用的反义寡核苷酸(例如与mRNA翻译起始位点(AUG密码子)附近序列互补的短寡核苷酸)已在本领域描述了。参见，例如Han等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 884313；Uhlmann等(1990)Chem.Rev.90543，Helene等(1990)Biochim.Biophys.Acta.104999；Agarwal等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 857079；和Heikkila等(1987)Nature 328445。适于在这里使用的许多核酶也已被描述了。参见，例如Chec等(1992)J.Biol.Chem.26717479和Goldberg等的美国专利5,225,347。
例如，在治疗实体瘤的方法中，可递送以下物质以在肿瘤位点或附近进行表达编码毒性肽(即化疗剂如蓖麻毒蛋白、白喉毒素和眼镜蛇毒因子)的基因、抑瘤基因如p53、编码与转化癌基因反义的mRNA序列、抗肿瘤的肽如肿瘤坏死因子(TNF)和其它细胞因子的基因，或转化癌基因的反式显性的阴性突变体。
同样地，也可施用编码已知显示抗病毒和/或抗菌活性或刺激宿主免疫系统的多肽的核酸。核酸可编码各种细胞因子(或其功能片段)的一种，如白介素、干扰素和集落刺激因子。核酸可编码抗原以用于治疗或预防多种病症，包括但不限于癌症、过敏症、由病原体引起的毒性和感染，所述病原体例如但不限于真菌；病毒包括人乳头状病毒(HPV)、HIV(人免疫缺陷病毒)、HSV2/HSV1(单纯疱疹病毒2/单纯疱疹病毒1)、流感病毒(A、B和C型)、脊髓灰质炎病毒、RSV病毒(Rous肉瘤病毒)、鼻病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、诺沃克病毒群、肠道病毒、星状病毒、麻疹病毒、Par流感病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒(E-B病毒)、腺病毒、风疹病毒、人T细胞淋巴瘤I型病毒(HTLV-I)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒、痘病毒、马尔堡病毒和伊波拉病毒；细菌包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、衣原体属(Chlamydia)、淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)、志贺菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio Cholera)、苍白密螺旋体(Treponema pallidua)、假单胞菌属(Pseudomonas)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、布鲁氏菌(Brucella)、弗朗西丝氏菌(Franciscella tulorensis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、钩端螺旋体(Leptospria interrogaus)、嗜肺军团菌(Legionella pnumophila)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、链球菌(Streptococcus，A和B型)、肺炎球菌(Pneumococcus)、脑膜炎球菌(Meningococcus)、流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza，b型)、弓形体(Toxoplama gondic)、Complybacteriosis、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、腹股沟肉芽肿(Donovanosis)和放线菌病(Actinomycosis)；真菌病原体包括念珠菌病和曲霉病；寄生性病原体包括绦虫、吸虫、线虫、阿米巴病、贾第虫病、隐孢子虫属、血吸虫、卡氏肺孢子虫、毛滴虫病和旋毛虫病。核酸也可用于提供合适的针对许多兽类疾病的免疫应答，所述兽类疾病如口蹄疫、冠状病毒、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、螺杆菌、寻常圆线虫(Strongylus vulgaris)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumonia)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、肺炎克雷白菌(Klebsiellapneumoniae)、大肠杆菌(E.Coli)、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertusssis)和支气管脓毒博德特氏菌(Bordetellabrochiseptica)。因此在一个方面，本发明的颗粒可用作疫苗。
本发明也可用于反义疗法中，例如用于递送能与特定的互补序列杂交的寡核苷酸从而抑制这些序列的转录和/或翻译。因此可靶向编码特定疾病进程所需的蛋白质的DNA或RNA，从而阻断该疾病的进程。反义疗法和许多能特异且可预期与某个核酸靶序列结合以抑制或调节致病基因的表达的寡核苷酸是已知的，且对于本领域的技术人员来说是容易获得的。Uhlmann等(1990)Chem Rev.90543，Neckers等(1992)Int.Rev.Oncogenesis 3，175；Simons等(1992)Nature 359，67；Bayever等(1992)Antisense Res.Dev.2109；Whitesell等(1991)Antisense Res.Dev.1343；Cook等(1991)Anti-cancer Drug Design 6585；Eguchi等(1991)Ann.Rev.Biochem.60631。因此，这里提供在宿主细胞中可选择性地与靶序列结合的反义寡核苷酸以用于反义治疗中。
典型地，以表达载体形式提供核酸。该表达载体可在分子生物学领域中常规地构建，并例如可包括使用质粒DNA和合适的起始密码子、启动子、增强子和其它元件如例如可能必需的聚腺苷酸化信号，且其被置于正确的方向，以允许插入序列的表达。合适的载体对于本领域的技术人员来说是显而易见的。在这方面作为进一步的实例可参考Sambrook等，1989。
合适的表达载体包含本发明中使用的可操作性地连接于调控序列的多核苷酸，所述调控序列典型地为启动子，启动子能为宿主细胞表达该多核苷酸提供必要准备。优选地载体适用于基因治疗方法或核酸免疫方法。可使用来自体内的载体，例如转化宿主细胞，然后将其再导入到受试者中。可选择地，可在体内使用载体以直接递送至受试者。
典型地，载体是一种具有以下元件的质粒复制起点、用于多核苷酸表达的启动子和可选择的该启动子的调节子。载体可含有一个或多个选择性标记基因，例如氨苄青霉素抗性基因。
选择启动子和其它表达调节信号以使其与设计进行表达的宿主细胞相容。可使用诱导型、阻抑型或其它可控制的启动子。为在哺乳动物宿主或哺乳动物宿主细胞中进行表达，可使用真核和噬菌体控制元件。
合适的哺乳动物启动子包括能对重金属如镉发生应答而被诱导的金属硫蛋白启动子和β-肌动蛋白启动子。组织特异性的启动子是特别优选的。合适的病毒启动子包括例如莫洛尼鼠类白血病病毒长末端重复(MMLVLTR)、Rous肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、SV40启动子、人巨细胞病毒(hCMV)立即早期(IE)启动子、腺病毒、HSV启动子(如HSV IE启动子)或HPV启动子，特别是HPV上游调节区(URR)。所有这些启动子是本领域中容易获得的。
典型地，在每一翻译终止密码子的3’端位置，还存在转录终止和聚腺苷酸化序列。优选地，在每一编码序列5’端位置，还存在使翻译起始优化的序列。转录终止/聚腺苷酸化信号的例子包括如Sambrook等所述的源自SV40的那些，也包括牛生长激素终止子序列。此外可包括增强子元件以增强表达水平。合适的增强子的例子包括SV40早期基因增强子(Dijkema等(1985)EMBOJ.4761)、源自Rous肉瘤病毒的长末端重复(LTR)的增强子/启动子(Gorman等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci USA 796777)和源自人或鼠CMV的元件(Boshart等(1985)Cell 41521)，例如包括在CMV内含子A序列中的元件。
本发明中使用的核酸凝聚剂以将核酸凝聚成更紧密结构的方式与核酸发生相互作用。凝聚后的核酸通常比未凝聚的形式更加稳定，且通常具有更加有序的结构，例如环状或杆状。凝聚剂通常是碱性分子，其与核酸发生相互静电反应以中和其负电荷。已报道，例如为发生有效的凝聚需要88％-90％的电荷中和(Deng H.和V.A.Bloomfield(1999)Biophys J 771556～1561)。通常，凝聚剂以相对较高的亲和力与核酸结合。
可使用任何合适的核酸凝聚剂，包括阳离子聚合物和多价阳离子。在一个实施方案中，凝聚剂是阳离子聚合物或其生理学上可接受的盐。这样的药学上可接受的盐包括例如无机酸盐如盐酸盐、氢溴化物、磷酸盐和硫酸盐等；和有机酸盐如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐等。典型地，所述盐为盐酸盐或硫酸盐。
优选地，阳离子聚合物为多胺。可使用的多胺包括精蛋白、腐胺、亚精胺、精胺、海美溴铵(Polybrene)、聚精氨酸和聚赖氨酸，或前述多胺的生理学上可接受的盐。阳离子聚合物可以是含有多胺的肽。
优选地，多胺为碱性氨基酸的阳离子聚合物。典型地，碱性氨基酸选自赖氨酸、精氨酸或组氨酸。该聚氨基酸可很容易从Sigma-Aldrich获得。
聚氨基酸可以是碱性氨基酸的同聚物。例如，聚精氨酸、聚赖氨酸或聚组氨酸。可选择地，聚氨基酸可以是一个或多个碱性氨基酸的聚合物，也可选择性地包含一个或多个非碱性氨基酸。因此聚氨基酸可包含一个或多个碱性氨基酸和选择性地一个或多个其它氨基酸。该共聚物典型地包含占主要部分的碱性氨基酸。例如，共聚物中50％～100％的氨基酸可为碱性，优选地60％～90％或70％～80％为碱性。在一个实施方案中，共聚物中至少75％，例如至少85％、95％、98％或99％的氨基酸为碱性。一般而言，碱性氨基酸包含一个或多个赖氨酸、组氨酸和精氨酸。当共聚物包含一个或多个非碱性氨基酸时，优选这些不为酸性氨基酸，如天冬氨酸或谷氨酸。一个或多个非碱性氨基酸可包括具有脂肪族或芳香族侧链的氨基酸，例如苏氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸或苯丙氨酸。
任何上述聚氨基酸中的氨基酸可以是L或D型氨基酸。优选地，使用L-氨基酸。
在一个优选的实施方案中，多胺为精氨酸的同聚物(Arg)x或赖氨酸的同聚物(Lys)x。优选聚L-精氨酸或聚L-赖氨酸，特别是聚L-精氨酸。典型地，同聚物的分子量约为500至15000，例如为500至10000、500至5000或500至1000。在一个实施方案中，上述式子中的x的范围可为2至100，例如为2至50、2至30或2至20。
特别优选小肽同聚物，例如具有分子量范围为500至1500，如500至1250或700至1000的那些小肽同聚物。典型地，在小肽中，x的取值为2至10，例如4至8。当x＝4或6的同聚物，例如(Arg)4或(Arg)6在本发明中是特别有用的。
凝聚剂可以是蛋白质的精蛋白家族成员，例如硫酸精蛋白。精蛋白是碱性蛋白质，其代替组蛋白与精子DNA结合。因此精子核提供例如以下精蛋白的优良来源来自鲑鱼精子的鲑精蛋白、来自鲱鱼精子的鲱精蛋白、来自鳟鱼精子的鳟精蛋白、来自鲟鱼精子的鲟精蛋白和来自鲭鱼精子的鲭精蛋白。精蛋白、硫酸精蛋白、磷酸精蛋白和精子核可很容易地从Sigma-Aldrich获得。
其它合适的多胺如腐胺、亚精胺和精胺，与其生理学上可接受的盐一起也可很容易地例如从Sigma-Aldrich获得。
凝聚剂也可包含多价阳离子或其生理学上可接受的盐。这样的多价阳离子包括例如乌洛托品钴(III)氯化物(Cohex)、三(乙二胺)钴(III)氯化物(Coen)和钴(III)sepulchrate氯化物(Cosep)。合适的生理学上的盐包括上述列出的与阳离子聚合物相关的盐。
本领域已知许多能用于鉴定核酸凝聚剂的试验。一般测定待测核酸分子特性的改变，其中该改变是与凝聚过程关联的，例如核酸凝缩为固体、核酸分子电荷的中和，或对于诸如核酸内切酶和转录因子等物质先前易接近的识别位点的隐藏或封闭。
指示液态核酸制剂凝聚的测定包括但不限于电子或原子力显微术、颗粒大小、ζ电位、荧光光谱测定、溴乙锭排除测定、凝胶移位、圆二色性和核磁共振。有用的文献引用的例子为J.Mol Biol(1978)121，311～326；Biophysical Journal(1996)，70，2847～2856，Nucleic Acids Res(1999)27(8)，1943～1949；J.Amer.Chem.Soc.，(1998)120(35)，8903～8909；J.PharmSci(1998)87(6)，678～683和Int.J.Pharm(2000)210(1-2)，97～107。
本发明中使用的螯合剂螯合溶液中的金属离子。一般发生螯合作用的金属离子包括Fe2+、Fe3+、Cr3+、Ca2+和Na+离子。优选地，该试剂螯合Ca2+或Na+离子。可选择地，优选该试剂螯合Fe2+或Fe3+离子。该试剂可以是单个或多个齿状。例如，合适的试剂包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、肌醇六磷酸、三聚磷酸盐、多磷酸、琥珀酸钠、琥珀酸钾、琥珀酸锂、苹果酸钠、苹果酸钾、苹果酸锂、除铁灵和乙二胺-二(邻羟基-苯乙酸)(EDDHA)。典型地，使用EDTA、DTPA或除铁灵，特别是EDTA或其盐，例如依地酸二钠。
还优选在一种或多种二糖和/或三糖的存在下，将核酸沉淀至惰性金属载体颗粒上。一种或多种糖有助于增加核酸/金属颗粒的稳定性。
合适的糖包括但不限于蔗糖、蔗糖单月桂酸酯、海藻糖、乳糖、棉子糖和甘露醇。优选地，糖选自海藻糖、蔗糖、乳糖和棉子糖。
在一个实施方案中，使用一种或多种二糖或三糖的混合物。例如，可使用上述列出的一种或多种糖的混合物。特别优选蔗糖/棉子糖的混合物。典型地，蔗糖/棉子糖以3∶1的重量比混合。
也可在一种或多种盐的存在下，将核酸沉淀至惰性金属载体颗粒上。所述一种或多种盐进一步提供稳定性。该盐为除了根据本发明可用作螯合剂的任何盐之外的盐。因此，该盐通常是指非螯合性盐。例如，典型地，该盐不是苹果酸盐或琥珀酸盐。该盐也是除了根据本发明可用作核酸凝聚剂的生理学上可接受的盐之外的盐。
在一个优选的实施方案中，一种或多种盐选自氯化物、醋酸盐、柠檬酸盐、硝酸盐、磷酸盐和硫酸盐。合适的盐包括但不限于醋酸钾、氯化钙、氯化锂、醋酸钠、硝酸镁、柠檬酸钠、磷酸钠、氯化钠、硫酸钠和硫酸钾。优选所述盐为醋酸钾。
在一个优选的实施方案中，携带有核酸的颗粒与抗氧化剂如乙醇或维生素A、维生素C或维生素E接触。典型地，用抗氧化剂处理颗粒增加稳定性。典型的处理可包括用抗氧化剂洗涤颗粒。
在一个实施方案中，一个或多个用于颗粒制备的组分与所得的颗粒合并或结合。因此，本发明提供适于从颗粒介导的递送装置进行递送的颗粒，该颗粒包含或有时基本上由以下组分组成惰性金属载体颗粒，在该惰性金属载体颗粒的表面上具有核酸、金属离子螯合剂和一种或多种以下成分(i)核酸凝聚剂；(ii)一种或多种二糖和/或三糖；和(iii)一种或多种盐。
每一颗粒组分如上面所述。优选地，颗粒至少包含(i)和/或(ii)。
本发明还提供一种本发明颗粒的制备方法。该方法包括或在一些实施方案中基本上由以下步骤组成(i)在核酸凝聚剂和金属离子螯合剂的存在下，将核酸沉淀至惰性金属载体颗粒上；和(ii)收集所得的颗粒；典型地，步骤(i)包括在核酸凝聚剂和金属离子螯合剂的存在下，通过混合使核酸与惰性金属载体颗粒接触。优选在接触过程中不断地涡旋混合物以确保反应混合物的均一性。优选地，核酸和核酸凝聚剂直到凝聚要发生的时候是相互分离的(例如在分离的溶液中)，例如直到也存在载体颗粒和螯合剂的时候是相互分离的。特别优选将凝聚剂加入到已包含有载体颗粒和核酸的混合物中，以避免核酸过早地发生沉淀。那么，金属离子螯合剂可存在于以下两者或之一中凝聚剂制剂，以及载体颗粒和核酸的混合物。可逐步地例如逐滴地加入凝聚剂。
可选择地，凝聚剂和载体颗粒的混合物可与核酸制剂混合。
上面已描述了金属颗粒、核酸、核酸凝聚剂和螯合剂。
在沉淀步骤中该混合物可另外包括一种或多种二糖和/或三糖，例如蔗糖、蔗糖单月桂酸酯、海藻糖、乳糖、棉子糖或甘露醇，或它们的组合。优选地，所述糖选自海藻糖、蔗糖、乳糖和棉子糖或它们的组合。可使用一种或多种二糖和/或三糖的混合物。例如可使用一种或多种上述糖的混合物。蔗糖棉子糖的混合物是特别有用的，特别是重量比为3∶1的蔗糖棉子糖。
沉淀混合物也可包含一种或多种盐。该盐是除了根据本发明可用作螯合剂的任何盐之外的盐。因此，该盐通常是指非螯合性盐。例如，典型地，该盐不是苹果酸盐或琥珀酸盐。该盐也是除了根据本发明可用作核酸凝聚剂的生理学上可接受的盐之外的盐。
在一个优选的实施方案中，一种或多种盐选自氯化物、醋酸盐、柠檬酸盐、硝酸盐、磷酸盐和硫酸盐。合适的盐包括但不限于醋酸钾、氯化钙、氯化锂、醋酸钠、硝酸镁、柠檬酸钠、磷酸钠、氯化钠、硫酸钠和硫酸钾。典型地，该盐不是磷酸铝。优选地，该盐为醋酸钾。
糖和/或盐可存在于待混合的最初制剂例如凝聚剂制剂或载体颗粒/核酸制剂的任一或两者中。
在一个实施方案中，将包含有预定量的核酸凝聚剂、糖和金属离子螯合剂的溶液逐滴加入到包含有预定量的金属载体颗粒、核酸、糖和金属离子螯合剂的溶液中。盐可存在于上述溶液的任一或两者中。
步骤(i)中组分的浓度可以是变化的而基本上不影响所得颗粒中的核酸的稳定性。金属载体颗粒可以任何合适的量存在，例如在悬液中为0.1mg/ml至100mg/ml如0.1mg/ml至10mg/ml或1mg/ml至10mg/ml。优选地，核酸浓度为0.01mg/ml至10mg/ml，如0.1mg/ml至1mg/ml。典型地，凝聚剂的浓度在0.1mg/ml至10mg/ml，例如0.1mg/ml至1mg/ml。优选地，金属离子螯合剂浓度为0.1mM至1M，如1mM至0.1M，例如10mM至50mM。如果存在糖，则糖的浓度可例如为0.1mg/ml至1g/ml，优选1mg/ml至0.1g/ml，例如10mg/ml至50mg/ml。如果存在盐，则盐的浓度典型地在0.1mM至1M如1mM至0.1M，如10mM至50mM。
本发明的方法可另外包括使核酸颗粒与抗氧化剂接触。通常该处理包括用抗氧化剂溶液洗涤颗粒。例如可使用乙醇。优选地，该乙醇是蔗糖饱和的乙醇。其它合适的抗氧化剂包括维生素A、维生素C和维生素E。此外，或可选择地，可用水性溶液或醇溶液如水或异丙醇洗涤核酸颗粒一或多次。
可将包被的、选择性洗涤的颗粒转移至合适的膜且使其在使用前干燥，或将其包被在样品模块或盒的表面上，或将其装入递送盒中以特别用于颗粒介导的递送装置中。可使用任何合适的干燥方法。优选地在氮气流条件下进行干燥。
可将本发明的颗粒包装于单一单位剂量或多剂量容器中。这样的容器可包含封入适量颗粒的密封容器。可将颗粒包装成无菌制剂，因此可对密封容器进行设计以保持该制剂的无菌性直到用于给受试者递送。容器优选适宜直接用于颗粒介导的递送装置中。典型地，这样的容器采用胶囊、箔袋、香袋、盒等形式。也可以含有合适剂量的包被的颗粒的预装载状态提供颗粒递送装置。然后也可将预装载的装置预先包装在密封容器中。
可对其中包装有颗粒的容器进行进一步标记以识别组合物和提供相关的剂量信息。此外，容器可用政府机构例如食品和药品管理部门规定的形式进行标注，其中，标注显示在制造业联邦法律下由该机构批准、其中含有的用于人类施用的核酸制剂的使用或出售。
适于颗粒介导递送的颗粒加速装置是本领域已知的。现有的基因枪装置使用爆发性的放电或放气以向靶细胞推进包被的载体颗粒。包被的载体颗粒可释放性地附着于活动的载体薄片上，或可移动地附着于气流沿着经过的表面，将颗粒从表面提起并使其朝向目标加速。放气装置的例子描述于美国专利号5,204,253。一种爆发式的装置描述于美国专利号4,945,050中。这里适用的放电装置的一个例子描述于美国专利号5,120,657中。另一个放电装置描述于美国专利号5,149,655中。所有这些专利所公开的内容全部引入本文作为参考。
也可使用无针注射器装置施用本发明的包被的颗粒，所述无针注射器装置如描述于Bellhouse等人的美国专利5,630,796(“PowderJect无针注射器装置”)和国际公开号WO 94/24263、WO 96/04947、WO 96/12513和WO 96/20022中的装置，所有这些作为参考引入本文。
可提供如美国专利号5,630,796中描述的装置作为笔形的设备，其以线性顺序从顶端到底部移动，含有气缸、颗粒盒或包、和与消音介质关联的超声波喷嘴。在合适的容器内提供颗粒，所述的合适的容器例如由两个可破裂的聚合物膜形成的盒，所述膜被热密封成垫圈形状的垫片以形成配套的密封单元。可选择膜材料以达到特定类型的打开和爆发压力，其决定启动超声波流的情况。
在操作中，开动装置将压缩气体从气缸中释放到装置内的膨胀室中。释放的气体与颗粒盒相接触，并当增大到足够的压力时，突然突破盒膜，席卷颗粒进入用于随后进行递送的超声波喷嘴中。对喷嘴进行设计以获得特定的气体速度和流动模式以将一些颗粒递送至预定区域的目标表面。使用消音器以减弱超声波气流产生的噪音。
描述于国际公开号WO 96/20022中的递送系统也使用压缩气体来源的能量以加速和递送粉状组合物。然而，其区别于美国专利号5,630,796的系统，其使用冲击波代替气流来使颗粒加速。更具体的，由柔性圆顶后面产生的冲击波提供的瞬间压力增加击打圆顶的背面，导致柔性圆顶在目标表面方向上的突然外翻。该突然外翻以足够的速度例如动量弹射粉末组合物(其位于圆顶的外面)以穿透靶组织例如口腔粘膜组织。在圆顶将要完全外翻的时候释放粉末组合物。该圆顶也用于完全容纳高压气流，因此该高压气体不与组织接触。因为在该递送操作期间不释放气体，所以该系统内在就是安静的。该设计可用于其它封闭的或其它需要灵敏度高的应用例如用于将颗粒递送至最低侵入程度的手术位点。
本发明的包被的颗粒可在体内直接递送至受试者，或递送至取自受试者体内的细胞，然后将转化的细胞再移植到受试者中。对于在体内递送，颗粒注射典型地为经皮下、表皮、皮肤内、粘膜内(例如经鼻、直肠和/或阴道)、腹膜内、静脉内、口或肌肉内施用。优选地，递送是针对终末分化细胞的；然而，也可将颗粒递送给未分化的或部分分化的细胞如造血干细胞和皮肤成纤维细胞。最优选地，递送是针对皮肤表皮细胞的。
包被的颗粒以与剂量制剂相容的方式和预防和/或治疗有效量的方式施用于受试者。本发明颗粒组合物的“治疗有效量”将足以引起疾病或病症症状的治疗或预防，且在可由常规试验测定的相对宽的范围内。一般地，颗粒以0.001μg至1000μg的量递送，更优选地每剂为0.01μg至10.0μg的核酸。然而，精确的所需量将依据被治疗个体的年龄和一般状况及选择的特定核酸序列和其它因素的不同而不同。合适的有效量可很容易地通过临床试验测定。为了测定所需量，“医师用药参考(Physicians DeskReference)”和“Goodman和Gilman的治疗的药理学基础(ThePharmacological Basis of Therapeutics)”是有用的。
C.实验性以下是用于实施本发明方法的具体实施方案的例子。提供这些例子的目的仅用于阐明，而不是旨在以任何方式限制本发明的范围。已尽力保证使用的数字(例如含量、温度等)的准确性，但一些实验误差和偏差当然应该是允许的。
实施例1在三种DNA/金颗粒制剂“DSEP”(实验A)、“聚精氨酸”(实验B)和“修饰的亚精胺”(实验C)中进行了一系列的实验以评价不同的糖、螯合剂和其它赋形剂/添加剂的效果。
根据以下一个或多个标准评价不同的颗粒(i)通过洗脱和A260时分光光度测定法或荧光测定法测定颗粒上的DNA产量
(ii)通过凝胶分析或HPLC(高效液相色谱)评价颗粒上的DNA的物理稳定性；(iii)通过光学显微镜或驱动进入凝胶来评价颗粒的凝聚作用；(iv)将携带有该基因的颗粒导入CHO细胞后，通过测定CHO细胞中荧光素酶报告基因的表达来评价颗粒上的DNA的表达活性；(v)通过测定小鼠血清中抗体的效价来评价颗粒的免疫效能，该小鼠已用携带有DNA的颗粒进行了接种，所述DNA编码与该抗体特异结合的抗原。
对于每一制剂，用上述标准将颗粒按等级排序。
实验ADSEP制剂根据以下配方制备颗粒金颗粒-DNA-糖-盐-其它测试的糖选自蔗糖单月桂酸酯、甘露醇、海藻糖、乳糖、棉子糖和蔗糖单癸酸酯。测试的盐选自醋酸钾、氯化钙、氯化锂、醋酸钠、硝酸镁、柠檬酸钠、磷酸钠、磷酸铝、氯化钠、硫酸钠和氯化镁。
如以下所示使用糖和盐的不同组合。也评价了用蔗糖饱和的乙醇进行洗涤的效果。
结果如下所示，对于每一标准从最大或理想效果到最小效果将不同的糖或盐按等级排序。例如，对于DNA产量，最高等级的糖导致相对高的DNA产量；对于凝聚作用，最高等级的糖导致相对低水平的凝聚作用。
(i)颗粒上的DNA产量糖蔗糖-蔗糖单月桂酸酯～海藻糖～乳糖～棉子糖＞＞＞蔗糖单癸酸酯(无产量)盐醋酸钾～氯化钙～氯化锂～醋酸钠～硝酸镁＞柠檬酸钠～磷酸钠＞＞＞磷酸铝其它用蔗糖饱和的乙醇进行洗涤不会从金粉中除去DNA在缺少任何盐时产量非常低(ii)颗粒上的DNA的物理稳定性糖蔗糖＞海藻糖＞甘露醇～乳糖～棉子糖＞蔗糖单月桂酸酯＞蔗糖单癸酸酯盐醋酸钾～醋酸钠～柠檬酸钠～磷酸钠＞氯化钠＞硫酸钠＞氯化锂其它用蔗糖饱和的乙醇进行洗涤有助于稳定性磷酸铝防止沉淀(iii)凝聚作用糖蔗糖单癸酸酯＜棉子糖～乳糖～蔗糖单月桂酸酯＜蔗糖～海藻糖盐醋酸钾～氯化锂～磷酸钠～柠檬酸钠～氯化钠～硫酸钠＜氯化钙～氯化镁＜硝酸镁(iv)颗粒上的DNA的表达活性蔗糖/醋酸钠～醋酸钾/棉子糖～蔗糖/硝酸镁～醋酸钾/蔗糖单月桂酸酯(v)小鼠的免疫效能对于室温下存储的配方的实时期限3个月时蔗糖/醋酸钠～亚精胺/CaCl2核酸颗粒1个月时棉子糖/醋酸钾～蔗糖单月桂酸酯/醋酸钾～亚精胺/CaCl2核酸颗粒实验B聚精氨酸制剂根据以下配方制备颗粒金颗粒-DNA-糖-螯合剂-聚精氨酸肽。
测试的糖选自海藻糖、蔗糖和棉子糖。测试的螯合剂选自EDTA、DTPA和除铁灵(DFO)。测试的聚精氨酸肽选自分子量(Mw)为13000的聚精氨酸、(Arg)6和(Arg)4。测试了糖、螯合剂和聚精氨酸的不同组合。
结果显示如下，也按最优选组合至最不优选组合或按有效性等级排序。
(i)颗粒上的DNA产量测试的糖海藻糖、蔗糖、棉子糖螯合剂EDTA、DTPA、除铁灵(DFO)其它13,000Mw、(Arg)6、(Arg)4任一的聚精氨酸肽上述所有组合的产量都超过了理论产量的50％。
(ii)颗粒上的DNA的物理稳定性糖蔗糖＞海藻糖＞棉子糖螯合剂EDTA＞DTPA＞除铁灵(DFO)其它所有聚精氨酸肽均给出相似的稳定性(iii)凝聚作用对于该制剂没有问题(iv)颗粒上的DNA的表达活性海藻糖/EDTA/(Arg)4～海藻糖/DTPA/(Arg)4。
使用DNA、金颗粒和亚精胺制备的颗粒显示了与这些制剂相似水平的表达活性。
(v)小鼠的免疫效能蔗糖/EDTA/(Arg)4＞海藻糖/EDTA/(Arg)4～海藻糖/DTPA/(Arg)4～蔗糖/DTPA/(Arg)4用DNA、CaCl2、金颗粒和亚精胺制备的颗粒产生与海藻糖/EDTA/(Arg)4颗粒相似的免疫效能。
实验C修饰的亚精胺制剂根据以下配方制备颗粒金颗粒-DNA-亚精胺-糖-盐-其它。
测试的糖选自蔗糖、海藻糖和棉子糖。测试的盐选自氯化镁、硝酸镁、氯化钙、硫酸钠、硫酸钾和溴化钠。
也测试了亚精胺浓度的作用和用特定水/醇溶液处理颗粒的作用。
结果如下所示。
(i)颗粒上的DNA的产量糖棉子糖＞海藻糖＞蔗糖盐MgCl2～MgNO3～CaCl2＞硫酸钠～硫酸钾～溴化钠其它亚精胺浓度和醇/水％也影响产量。
(ii)颗粒上的DNA的物理稳定性糖棉子糖＞海藻糖＞蔗糖盐MgCl2＞MgNO3＞CaCl2＞硫酸钠～硫酸钾～溴化钠(iii)凝聚作用对于该制剂没有问题实施例2不同的DNA包被的颗粒的稳定性研究使用不同比例的硫酸精蛋白、EDTA、水、和海藻糖、蔗糖或乳糖中的一种制备包被的颗粒。根据10种不同比例制备颗粒，如示于表1的10个配方。在4℃和60℃且在第0、7和14天时间点测试根据每一比例制备的颗粒的稳定性。
方法对于每一比例，根据表1制备试管A和B。将试管A和B的内含物以高速涡旋10秒，或直到每一溶液均很好地混合。当以中等速度涡旋试管A时，用5ml移液管逐滴加入试管B的内含物。将试管A进一步涡旋15秒，然后使内含物静止5分钟。移去试管A中的上清液并将剩余沉淀用1ml的100％异丙醇洗涤一次。将该试管的内含物涡旋并使之沉淀。除去异丙醇并用氮流将沉淀干燥至粉末。
秤取各颗粒制剂3mg～5mg的并放入1.5ml的微量离心管以用于在4℃或60℃孵育。在第0、7和14天时间点，通过琼脂糖凝胶电泳和HPLC测试各颗粒制剂中DNA的稳定性。
结果颗粒制剂在整个测试中显示出相似的稳定性。选择根据“比例4”(配方4，表1)制备的颗粒做进一步工作。
表1.使用实验性DOE来优化制备颗粒用的糖和EDTA的浓度。该表顶部横向的数字为每一试管中糖和EDTA的最终浓度。该表内的数字为以μl为单位加入试管中的各组分。
最终的糖 50 50 50 50 150 150 150 150 100 100 100 100 25 25175 175 100 100 100 100(mg/ml)最终的EDTA 11551155333333 33 0066(mg/ml)

实施例3基于根据“比例4”(配方4)制备的颗粒的进一步稳定性研究根据表1中比例4如实施例2中所述制备颗粒，但以更大规模(350mg金颗粒)，和任一的(a)无二糖(对照)；或(b)海藻糖；或(c)蔗糖；或(d)乳糖。
在4℃和60℃孵育颗粒，8周后通过琼脂糖凝胶电泳评价颗粒上的DNA的稳定性。
实施例4四精氨酸制剂的开发在对一些配方进行试验以验证不同长度的聚精氨酸具有将DNA沉淀在金微粒上的能力之后，通过研究产量和稳定性，建立实验以研究使用什么样的聚精氨酸长度。也研究了糖和螯合剂的选择，其已在先前的配方中显示出能提高稳定性。
结果显示，4和6个单体的聚精氨酸比分子量为13000的聚合物(约80个单体)更有利于稳定性。研究的糖和螯合剂的表现相当。海藻糖和蔗糖都是很好的糖。EDTA和DTPA都是很好的螯合剂。选择精氨酸四聚物，是由于其比6聚物可能更快地与DNA分离，其也可能形成更少的降解产物。将得到的用于进一步研究的配方命名为TA101.1(DNA、蔗糖、EDTA)、TA101.2(DNA、蔗糖、DTPA)、TA101.3(DNA、海藻糖、EDTA)、TA101.4(DNA、海藻糖、DTPA)。
将这四种配方在长期的稳定性方面排序和在4、25和40摄氏度进行相互间和亚精胺/CaCl2对照(其中亚精胺和氯化钙用于将DNA沉淀在金微粒上)的研究。它们的稳定性示于表2中。在小鼠研究和荧光素酶表达实验(DNA编码的荧光素酶)中还测试这些配方的生物学活性。
表2101系列的衰变率(SC带的)

这些活性实验显示，该101系列都是有活性的、表达的，且约与亚精胺/CaCl2相等。配方TA101.1和TA101.3的稳定性比TA101.2和TA101.4的稳定性好。这表明螯合剂EDTA比DTPA更稳定，但当制成粉末时，在海藻糖(3和4)和蔗糖(1和2)之间几乎不存在差别。101系列四精氨酸配方的配方组成示于表3中。
表3101系列的组成

然后，进行两个实验，其中海藻糖和EDTA的饱和水平用作制剂环境。随同这些筛选的为多级乙醇水平。这些制剂利用接近饱和的溶液能将更多<p>

表2

表5在不同温度条件下TA的稳定性

表4加热温度和凝胶性质

表5加热时间和凝胶性质

透明度评价T透明，透光度为10％T或以上T/C半透明，透光度为1％T到小于10％TC白色浑浊，透光度小于1％T实施例1高浓度凝胶用食物切割机将上面制备实施例中所得的酸性可溶的大豆蛋白质切割以制备固体含量按重量计为14％的糊。向糊中加入0.03％蔗糖素(sucralose)(San-Ei Gen F.F.I.，Inc.)和0.2％桔子香料(InternationalFlavors &amp; Fragrances Inc.)并将混合物匀浆并去泡沫。将混合物置于耐热容器中，然后在恒温箱中80℃下加热30分钟。所得凝胶食物是清澈的并且质地是有适当弹性的和所希望的。
这些数据清楚地显示，根据用1mg载体颗粒装载2μg DNA剂量在ND5.5转染的动物上进行的抗体ELISA(酶联免疫吸附测定)和ELISPOT(酶联免疫斑点测定)应答测试中，配方TA201.5与亚精胺/CaCl2是竞争性的。在ELISPOT数据(根据Mann-Whitney标准)中，该配方显示了持续大于或等于亚精胺/CaCl2的性能。
测定了配方TA201.5的最终组成。表7显示从TA201.5粉末测定的全部组成范围。
表7TA201.5的最终全部组成和范围

*在EDTA 4(-)状态中测定EDTA，且报道作为该物质的质量(没有钠、水或氢，如参见容器上的F.W.(分子式质量))。
表8显示了用于制造四精氨酸制剂的原料。
表8原料

随后的过程用于配制35mg金粉规模的TA201.5。
设备天平涡旋器超声波仪离心机2ml的离心(eppendorf)管1ml、200μl移液管空气流试剂的制备11.3mg/ml四精氨酸(批号523352)称重0.8至1.0mg四精氨酸。每mg重量加入88.5μl的H2O。这会交换许多不同的内含物。
海藻糖溶液称重至少30mg海藻糖(供应商示于原料列表中)。每30mg重量加入120μl的H2O，或比海藻糖多4倍量的水(以质量或μl，因为单位为1mg/μl)。
500mM的Na2EDTA溶液形式的该物质可从Sigma预定(见原料列表的产品目录号)。
方法试管B在将乙醇和DNA加入到试管A之前准备好试管B。加入螯合剂溶液、糖溶液、乙醇和四精氨酸溶液。高速涡旋10秒。
试管A将金称重到试管中。加入螯合剂溶液和糖溶液。超声30秒，高速涡旋1分钟。当涡旋时逐滴加入乙醇。加入DNA溶液。加入DNA后，如下所述将试管B加入到试管A。
配制步骤当以中等速度涡旋试管A时(确信金被混合到整个溶液中)，逐滴加入试管B的内含物。当已将试管B的所有物质加入到试管A后，将含有最终的四精氨酸制剂的试管A高速涡旋1分钟。使该制剂静置5分钟。涡旋，然后离心10秒。用移液管移出上清液，并将其保存以用于分析。用250μl乙醇洗涤沉淀。涡旋30秒，超声3秒。将沉淀离心下来10秒并移去乙醇。用250μl乙醇再次洗涤沉淀。涡旋30秒，超声3秒。将沉淀离心下来10秒并移去乙醇。用空气流以0.5L/分钟的流速干燥粉末2小时。
试管A 试管B·金粉，35mg·EDTA，26.25μl ·EDTA，26.25μl·海藻糖，70μl·海藻糖，70μl·超声30秒，涡旋1分钟 ·四精氨酸，70μl·乙醇，183.75μl涡旋时逐滴加入·乙醇，183.75μl·DNA，70μl ·涡旋10秒试管A和试管B 当涡旋时将试管B逐滴加入到试管A中 涡旋1分钟 使静置5分钟 离心10秒并移去上清液 用250μl醇洗涤，涡旋30秒，超声3秒，离心10秒，移去 用250μl醇洗涤，涡旋30秒，超声3秒，离心10秒，移去 在空气或氮气中干燥2小时在配方TA201.5的整个制备过程中，该配制过程是先制备每一成分的单独贮存液，然后将其以一定顺序加入到配制试管中。然而，洁净室内配制该配方将需要无菌过滤步骤。开始进行“主液混合(master mixing)”实验以满足该需要(NB2334-80)。该策略利用试管A(主液A)和试管B(主液B)中所有水性成分的主液混合物。然后将混合物用注射器过滤至无菌，过滤后物质进入制剂试管中。主液混合实验将由主液混合过程和标准过程制备的粉末根据稳定性和全部组成进行相互比较。
表9主液混合实验中的最终的组成

表10主液与标准的稳定性

-表10中的半衰期是通过将两个半衰期计算值进行平均来计算的。一个源自ng SC的衰变率(60℃相对于4℃)，而另一个源自％SC的衰变率(60℃相对于4℃)。
由于两个方法生产出相同的最终产物，因此可认为主液混合策略是没有问题的，且可用于后面TA201.5粉末的粉末制剂。进行进一步的方法实验以决定哪个方法步骤是关键的实验以70mg规模由相同的贮存溶液制备配方1～9。通过以制剂比例混合EDTA、海藻糖和DNA溶液，然后用注射器过滤，来制备试管A的主液混合物。通过以制剂比例混合EDTA、海藻糖和四精氨酸溶液，然后用注射器过滤，获得试管B的主液混合物。然后通过以下过程制备配方1试剂的制备(用于10、70mg制剂)DNA以1mg/ml提供质粒和编码荧光素酶的DNA的储存液。以SC18荧光素酶为9∶1的体积比混合该两种DNA溶液。
1500μl的SC18+166.7μl的荧光素酶DNA。
11.3mg/ml四精氨酸称重约20mg四精氨酸。每mg重量加入88.5μl的H2O。
海藻糖溶液称重至少700mg的海藻糖。每35mg重量加入140μl的H2O，或比海藻糖多4倍量的水(以质量或μl，因为单位为1mg/μl)。
500mM的EDTA溶液形式的该物质可从Sigma预定(产品目录号E-7889)。
主液A体积比1500μl海藻糖、562.5μl的EDTA、1500μl的DNA(1mg/ml)将主液A用注射器过滤主液B体积比1500μl海藻糖、562.5μl的EDTA、1500μl的四精氨酸将主液B用注射器过滤试管A 试管B70mg金332.5μl的主液混合物A 332.5μl的主液混合物B367.5μl的乙醇，在涡旋时逐滴加入 367.5μl的乙醇超声30秒，涡旋10秒涡旋10秒试管A和试管B当涡旋时将试管B逐滴加入到试管A中当加入试管B的所有物质后，高速涡旋1分钟使静置5分钟涡旋5秒，然后离心10秒，*移去上清液用500μl的乙醇洗涤，涡旋30秒，超声3秒，离心10秒，*移去重复最后的步骤1次以0.5L/分钟在空气下将沉淀干燥1小时该过程是对照制剂。下表显示了粉末2～9的方法变化。

剩余的制剂为加入顺序改变的配方，以评价该制剂中1主液混合物的可能性。该方法与对照相似。
主液混合物的体积比400μl海藻糖、150μl的EDTA和200μl四精氨酸将主液混合物用注射器过滤配方1070mg金525μl的主液混合物735μl乙醇，在涡旋时逐滴加入超声30秒，涡旋10秒140μl的DNA，在涡旋时逐滴/慢慢地(两滴之间暂停5秒)加入加入B的所有物质后，高速涡旋1分钟使静置5分钟涡旋5秒，然后离心10秒，*移去上清液用500μl的乙醇洗涤，涡旋30秒，超声3秒，离心10秒，*移去重复最后的步骤1次以0.5L/分钟在空气下干燥沉淀*离心后从沉淀中移去液体是用1000μl移液管移除大部分液体，接着用200μl移液管移去剩余的液体进行的，以尽可能少地留在粉末上。
分析所有的粉末的全部组成、稳定性、CHO细胞中荧光素酶表达和凝胶射击(gel shots)。
表11方法稳健性实验的组成

表1260℃条件下方法稳健性实验的稳定性

-上面的数字是根据从配制日期起至13和20天在纳克的超螺旋DNA中的变化计算的。
比例和半衰期相互很接近。这显示了配制方法在稳定性方面是稳健的。配方5和7具有比其它配方稍好的稳定性，但配方9和10具有显著的稳定性优势(3X)。配方9是没有洗涤的(且不适宜处理)，而配方10是通过加入顺序的变化获得的。
表达数据显示了配方是很相似的(300～400千次计数/秒)。新制备的亚精胺/CaCl2配方表达更多(或在分析细胞时具有更多的表达物质)，而且测得更高的释放质量。配方10和7相对于其它四精氨酸配方具有一些荧光素酶表达优势(450～600千次计数/秒)。总体上，该实验证明该方法是非常稳健的。
稳健性的另一方面是改变用于制备配方的加入和过程顺序的作用。在一个这样的实验(NB2251-124)中，研究用相同的精确原料(量和浓度)制备配方的不同方法。该实验仅考虑设计用于以不同顺序使组分沉淀的配方的稳定性。这大概具有很大的作用，原因在于能将DNA在稳定剂之前、同时或之后直接沉淀在金上。
配制方法1.试管A和B方法。除了A具有DNA，而B具有四精氨酸之外，试管A和B具有相同的组成。将两者都很好地混合，然后将B逐滴加入到A中。
2.另一种试管A和B方法。这次，在试管A(具有金)中，在加入DNA溶液之前加入乙醇，以在DNA加入之前用过量的糖预包被金。然后将DNA加入到试管A中，然后立即将试管B加入到试管A中。
3.该方法被设计成同时沉淀DNA和稳定剂。除了DNA和乙醇之外，将所有组分加入到一个试管中。然后，将DNA和乙醇一起混合并加入。
4.该方法在乙醇加入之前沉淀DNA。除了DNA、四精氨酸和乙醇之外，将所有组分加入到一个试管中。这些最后组分的加入顺序分别为DNA、四精氨酸和乙醇。
5.除了在DNA之前加入四精氨酸之外，该方法与4相同。乙醇仍然为最后。
将这些制剂置于4℃和60℃的孵育箱中，且配制后2周进行分析。通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，虽然粉末4和5(乙醇最后，在乙醇之前DNAARG4络合)稍微更加稳定，这些粉末之间总体上没有区别。
因此，已描述了新的适于由颗粒介导的递送装置进行递送的核酸包被的颗粒、制备该颗粒的方法，和使用该颗粒进行基因治疗和核酸免疫的方法。虽然已对本发明的优选实施方案做了一些详细描述，但应理解，在不脱离所附权利要求中定义的本发明的精神和范围内，可进行显而易见的改变。
权利要求
1.适于由颗粒介导的递送装置进行递送的颗粒，该颗粒是在核酸凝聚剂和金属离子螯合剂的存在下，通过将核酸沉淀在惰性金属载体颗粒上而获得的。
2.如权利要求1所述的颗粒，其中所述的惰性金属载体颗粒选自金、钨、铂或铱颗粒。
3.如权利要求2所述的颗粒，其中所述的惰性金属载体颗粒为直径约为1μm至3μm的金颗粒。
4.如前述任一项权利要求所述的颗粒，其中所述的核酸编码抗原。
5.如权利要求4所述的颗粒，其中所述的抗原选自病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
6.如权利要求1至3任一项所述的颗粒，其中所述的核酸编码治疗性多肽。
7.如前述任一项权利要求所述的颗粒，其中所述的核酸为DNA。
8.如前述任一项权利要求所述的颗粒，其中所述的核酸凝聚剂为阳离子聚合物。
9.如权利要求8所述的颗粒，其中所述的核酸凝聚剂为多胺。
10.如权利要求9所述的颗粒，其中所述的多胺选自精蛋白、亚精胺、精胺、腐胺或它们的生理学上可接受的盐。
11.如权利要求9所述的颗粒，其中所述的多胺为聚精氨酸或聚赖氨酸。
12.如权利要求11所述的颗粒，其中所述的聚精氨酸为(Arg)4或(Arg)6。
13.如前述任一项权利要求所述的颗粒，其中所述的金属离子螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、肌醇六磷酸、三聚磷酸盐、多磷酸、琥珀酸钠、琥珀酸钾、琥珀酸锂、苹果酸钠、苹果酸钾、苹果酸锂、除铁灵或乙二胺-二(邻羟基-苯乙酸)(EDDHA)。
14.如前述任一项权利要求所述的颗粒，其中所述沉淀是在一种或多种二糖和/或三糖的存在下进行的。
15.如权利要求14所述的颗粒，其中所述的一种或多种糖选自海藻糖、蔗糖、乳糖或棉子糖。
16.如权利要求15所述的颗粒，其中所述的一种或多种糖为蔗糖和棉子糖的混合物。
17.如前述任一项权利要求所述的颗粒，其中所述沉淀是在一种或多种盐的存在下进行的。
18.如权利要求17所述的颗粒，其中所述一种或多种盐选自醋酸钾、氯化钙、氯化锂、醋酸钠、硝酸镁、柠檬酸钠、磷酸钠或氯化镁。
19.如前述任一项权利要求所述的颗粒，其中得到的颗粒与抗氧化剂接触。
20.如权利要求19所述的颗粒，其中所述抗氧化剂选自乙醇、维生素A、维生素C或维生素E。
21.如权利要求1所述的颗粒，其中该颗粒是在聚精氨酸、EDTA和蔗糖的存在下，通过将DNA沉淀在金载体颗粒上而获得的。
22.一种用于颗粒介导的递送装置的剂量容器，该容器含有以下颗粒，该颗粒是在核酸凝聚剂和金属离子螯合剂的存在下，通过将核酸沉淀在惰性金属载体颗粒上而获得的。
23.一种颗粒介导的递送装置，该递送装置装载有以下颗粒，该颗粒是在核酸凝聚剂和金属离子螯合剂的存在下，通过将核酸沉淀在惰性金属载体颗粒上而获得的。
24.如权利要求23所述的颗粒介导的递送装置，该递送装置为无针注射器。
25.一种适于由颗粒介导的递送装置进行递送的颗粒的制备方法，该方法包括以下步骤(i)在核酸凝聚剂和金属离子螯合剂存在下，将核酸沉淀在惰性金属载体颗粒上；和(ii)收集所得的颗粒。
26.如权利要求25所述的方法，其中在步骤(i)中将核酸凝聚剂加入到包含有惰性金属载体颗粒和核酸的混合物中。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述的惰性金属载体颗粒选自金、钨、铂或铱颗粒。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述的惰性金属载体颗粒为直径约为1μm至3μm的金颗粒。
29.如权利要求25至28任一项所述的方法，其中所述的核酸编码抗原。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述的抗原选自病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原。
31.如权利要求25至28任一项所述的方法，其中所述的核酸编码治疗性多肽。
32.如权利要求25至31任一项所述的方法，其中所述的核酸为DNA。
33.如权利要求25至32任一项所述的方法，其中所述的核酸凝聚剂为阳离子聚合物。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述的核酸凝聚剂为多胺。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述的多胺选自精蛋白、亚精胺、精胺、腐胺或它们的生理学上可接受的盐。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述的多胺为聚精氨酸或聚赖氨酸。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述的聚精氨酸为(Arg)4或(Arg)6。
38.如权利要求25至37任一项所述的方法，其中所述的金属离子螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、肌醇六磷酸、三聚磷酸盐、多磷酸、琥珀酸钠、琥珀酸钾、琥珀酸锂、苹果酸钠、苹果酸钾、苹果酸锂、除铁灵或乙二胺-二(邻羟基-苯乙酸)(EDDHA)。
39.如权利要求25至38任一项所述的方法，其中步骤(i)进一步在一种或多种二糖和/或三糖的存在下进行。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述一种或多种糖选自海藻糖、蔗糖、乳糖或棉子糖。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述一种或多种糖为蔗糖和棉子糖的混合物。
42.如权利要求25至41任一项所述的方法，其中步骤(i)进一步在一种或多种盐的存在下进行。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述一种或多种盐选自醋酸钾、氯化钙、氯化锂、醋酸钠、硝酸镁、柠檬酸钠、磷酸钠或氯化镁。
44.如权利要求25至43任一项所述的方法，其中由步骤(i)得到的颗粒与抗氧化剂接触。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述抗氧化剂选自乙醇、维生素A、维生素C或维生素E。
46.如权利要求25所述的方法，该方法包括以下步骤(i)在聚精氨酸、EDTA和蔗糖的存在下，将DNA沉淀在惰性金颗粒上；和(ii)收集所得的颗粒。
47.一种核酸免疫的方法，该方法包括(a)提供适于由颗粒介导的递送装置进行递送的颗粒，其中该颗粒是在核酸凝聚剂和金属离子螯合剂的存在下，通过将编码抗原的核酸沉淀在惰性金属载体颗粒上而获得的；和(b)给受试者施用有效量的该颗粒。
48.一种基因治疗的方法，该方法包括(a)提供适于由颗粒介导的递送装置进行递送的颗粒，其中该颗粒是在核酸凝聚剂和金属离子螯合剂的存在下，通过将编码治疗性多肽的核酸沉淀在惰性金属载体颗粒上而获得的；和(b)给受试者施用有效量的该颗粒。
49.如权利要求47或48所述的方法，其中所述的惰性金属载体颗粒选自金、钨、铂或铱颗粒。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述惰性金属载体颗粒为直径约为1μm至3μm的金颗粒。
51.如权利要求47至50任一项所述的方法，其中所述的核酸为DNA。
52.如权利要求47至51任一项所述的方法，其中所述的核酸凝聚剂为阳离子聚合物。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述的核酸凝聚剂为多胺。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述的多胺选自精蛋白、亚精胺、精胺、腐胺或它们的生理学上可接受的盐。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述的多胺为聚精氨酸或聚赖氨酸。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述的聚精氨酸为(Arg)4或(Arg)6。
57.如权利要求47至56任一项所述的方法，其中所述的金属离子螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、肌醇六磷酸、三聚磷酸盐、多磷酸、琥珀酸钠、琥珀酸钾、琥珀酸锂、苹果酸钠、苹果酸钾、苹果酸锂、除铁灵和乙二胺-二(邻羟基-苯乙酸)(EDDHA)。
58.如权利要求47至57任一项所述的方法，其中所述沉淀是在一种或多种二糖和/或三糖存在下进行的。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述一种或多种糖选自海藻糖、蔗糖、乳糖或棉子糖。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述一种或多种糖为蔗糖和棉子糖的混合物。
61.如权利要求47至60任一项所述的方法，其中所述沉淀在一种或多种盐的存在下进行的。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述一种或多种盐选自醋酸钾、氯化钙、氯化锂、醋酸钠、硝酸镁、柠檬酸钠、磷酸钠或氯化镁。
63.如权利要求47至62任一项所述的方法，其中所得的颗粒与抗氧化剂接触。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述抗氧化剂选自乙醇、维生素A、维生素C或维生素E。
65.如权利要求47所述的方法，该方法包括以下步骤(a)提供适于由颗粒介导的递送装置进行递送的颗粒，其中该颗粒是在聚精氨酸、EDTA和蔗糖的存在下，通过将编码抗原的DNA沉淀在金颗粒上而获得的；和(b)给受试者施用有效量的该颗粒。
66.如权利要求48所述的方法，该方法包括以下步骤(a)提供适于由颗粒介导的递送装置进行递送的颗粒，其中该颗粒是在聚精氨酸、EDTA和蔗糖的存在下，通过将编码治疗性多肽的DNA沉淀在金颗粒上获得的；和(b)给受试者施用有效量的该颗粒。
67.适于由颗粒介导的递送装置进行递送的颗粒，该颗粒包含惰性金属载体颗粒，在该惰性金属载体颗粒的表面上具有核酸、金属离子螯合剂和一种或多种以下成分(i)核酸凝聚剂；(ii)一种或多种二糖和/或两种三糖；和(iii)一种或多种盐。
全文摘要
本申请提供一种适于由颗粒介导的递送装置进行递送的颗粒。该颗粒是在核酸凝聚剂和金属离子螯合剂的存在下，通过将核酸沉淀在惰性金属载体颗粒上而获得的。本申请还描述了制备该颗粒的方法，和使用该颗粒的治疗方法，其中包括核酸免疫的方法和基因治疗的方法。
文档编号A61K48/00GK1694721SQ03825135
公开日2005年11月9日 申请日期2003年9月29日 优先权日2002年9月27日
发明者克里斯·罗伯特·莱夫利, 罗伯特·德朗 申请人:磨粉机械研究有限公司