Nonratt021972小干扰rna在制备神经组织其功能异常及相关疾病药物中应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及制备治疗神经组织长非编码核糖核酸N0NRATT021972功能异常及相 关疾病的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 随着基因组测序计划的完成以及新一代深度测序技术的应用，人们发现哺乳动物 细胞中多于95%的转录序列为非编码核糖核酸（noncodingRNA，ncRNA)。非编码RNA是一 类不编码蛋白质但具有生物学调控功能的RNA分子，它可通过参与mRNA的稳定和翻译水平 的调节、蛋白质的运输、RNA的加工和修饰以及影响染色体的结构等机制，调控生物体的基 本生命活动，同时与一些重要疾病的病理生理过程相关。非编码RNA包括短非编码核糖核 酸（包括siRNA、miRNA、piRNA)和长非编码核糖核酸（longnon-codingRNA,IncRNA)。长 度大于200个碱基（200nt)为长链非编码RNA(lncRNA)。目前长度小于50个核苷酸的非编 码RNA(如microRNA、siRNA和piRNA)等的研究已取得突破性进展，但对具有功能的长非编 码RNA的研究不多。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA的新用 途，长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA在制备神经组织长非编码核糖核酸 N0NRATT021972功能异常及相关疾病药物中的应用。
[0004] 本发明用SOLiD高通量测序并通过生物信息学预测和分子生物学验证确定大鼠 背根神经节（DRG)存在长非编码核糖核酸N0NRATT021972[http://www·noncode·org]，并 发现糖尿病模型大鼠背根神经节长非编码核糖核酸N0NRATT021972表达较对照组明显增 加，提示背根神经节的长非编码核糖核酸N0NRATT021972与神经功能与病理变化有关。
[0005] 本发明通过观察长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA处理后2型糖尿病 大鼠神经功能的改善，为长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA在制备神经组织长 非编码核糖核酸N0NRATT021972功能异常及并发疾病的的诊断、预防和治疗提供帮助。
[0006] 在注射长非编码核糖核酸N0NRATT021972的小干扰核糖核酸后，2型糖尿病模 型组DRG中长非编码核糖核酸N0NRATT021972的表达降低，同时在注射干扰试剂后糖尿 病大鼠的机械痛和热敏痛阈值升高，且尾神经感觉传导速度增加，表明长非编码核糖核酸 N0NRATT021972小干扰RNA可对神经组织长非编码核糖核酸N0NRATT021972功能异常及 并发疾病产生作用，改善神经的损伤现象。长非编码核糖核酸N0NRATT021972的小干扰核 糖核酸处理后同时可下调降低糖尿病大鼠血清中细胞炎性因子一肿瘤坏死因子（TNF-α) 的含量，增加糖尿病大鼠血清中过氧化氢酶（CAT)和超氧化物歧化酶（SOD)的活性。因 此，长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA具有对神经组织长非编码核糖核酸 N0NRATT021972功能异常及相关疾病的改善作用。
【附图说明】
[0007]图1为2型糖尿病大鼠制模过程中的机械缩足反射阈值变化图。长非编码核糖核 酸N0NRATT021972的小干扰RNA处理后对2型糖尿病大鼠的机械痛行为具有抑制作用。实 验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972的 小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性（NCsi)对照组。其中\〈0.05， wp〈0. 01表示和正常组比较，##p〈0. 01表示与糖尿病模型组比较。
[0008]图2为2型糖尿病大鼠制模过程中的热缩足反射阈值变化图。长非编码核糖核酸 N0NRATT021972的小干扰RNA处理后对2型糖尿病大鼠的热敏痛行为具有抑制作用。其中 实验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972 的小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组。其中\〈0.05， wp〈0. 01表示和正常组比较，##p〈0. 01表示与糖尿病模型组比较。
[0009]图3为2型糖尿病大鼠制模过程中的尾神经感觉传导速度变化图。长非编码核糖 核酸N0NRATT021972的小干扰RNA处理后可改善2型糖尿病大鼠的尾神经感觉传导速度。 实验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972 的小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组。其中\〈0.05， wp〈0. 01表示和正常组比较，##p〈0. 01表示与糖尿病模型组比较。
[0010] 图4为2型糖尿病大鼠背根神经节（DRG)长非编码核糖核酸N0NRATT021972的逆 转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)检测结果图。长非编码核糖核酸N0NRATT021972的小干扰 RNA处理后可降低2型糖尿病大鼠DRG上调的长非编码核糖核酸N0NRATT021972水平。实 验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972的 小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组。图4 (a)为RT-PCR实 验结果图，图4(b)为实验数据分析比较柱状图，其中#p〈0. 01表示和正常组比较，##p〈0. 01 表示与糖尿病模型组比较。
[0011] 图5为2型糖尿病大鼠血清TNF-α变化检测结果图。长非编码核糖核酸 N0NRATT021972的小干扰RNA处理后可降低2型糖尿病大鼠上调的血清TNF- a变化水平。 实验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972 的小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组。其中wp〈0. 01表 示和正常组比较，##p〈0. 01表示与糖尿病模型组比较。
[0012] 图6为2型糖尿病大鼠血清过氧化氢酶活性测定结果图。长非编码核糖核酸 N0NRATT021972的小干扰RNA处理后可增加2型糖尿病大鼠下调的血清过氧化氢酶（CAT) 活性水平。实验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核糖核酸 N0NRATT021972的小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组。其 中#p〈0. 01表示和正常组比较，##p〈0. 01表示与糖尿病模型组比较。
[0013]图7为2型糖尿病大鼠血清超氧化物歧化酶活性测定结果图。长非编码核糖核酸 N0NRATT021972的小干扰RNA处理后可升增加2型糖尿病大鼠下调的血清超氧化物歧化酶 (S0D)活性水平。实验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核糖核 酸N0NRATT021972的小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组。 其中#p〈0. 01表示和正常组比较，##p〈0. 01表示与糖尿病模型组比较。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。
[0015] 实施例1。
[0016] 用本技术领域公知的方法，制成适用于制备神经组织长非编码核糖核酸 N0NRATT021972功能异常及并发疾病的诊断、预防、治疗的口服、注射、含片或其它局部或全 身用药剂型的含长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA制剂。
[0017] -、材料和方法。
[0018] 1.动物和分组。
[0019] 健康Sprague-DaWley(SD)大鼠，南昌大学医学院实验动物科学部提供。健康SD 雄性大鼠60只，体重200g左右，适应性饲养1周后，随机分成2组，对照组（Ctrl)8只，喂 以基础饲料；其余大鼠（52只）为糖尿病造模组，喂以高糖高脂饲料（高糖高脂饲料配方： 基础饲料66. 5%，蔗糖20%，猪油10%，胆固醇2. 5%，胆酸钠1 %，做成球状放在恒温鼓风 干燥箱中80°C干烤2天）。第5周末，所有大鼠测体重、空腹血糖和餐后血糖后，造模组大 鼠空腹腹腔注射STZ30mg/kg(STZ溶液的配制：临用前将STZ溶解于4°C冰箱预冷的pH为 4. 2的0.lmol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液中，配制成2. 5g/L的STZ溶液），对照组大鼠腹腔 注射相同体积的〇.lmol/L，pH为4. 2柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。第6周末测血糖，空腹血 糖<7. 8mmol/L且餐后血糖< 11.lmmol/L的造模组大鼠再次给予空腹腹腔注射STZ30mg/ kg。第7周末测血糖，空腹血糖大于7. 8mmol/L，或餐后血糖> 11.lmmol/L为成模标准。
[0020] 长非编码核糖核酸N0NRATT021972小RNA干扰（siRNA)序列由 Invitrogen(Carlsbad,CA)公司提供，靶序列为 5' -GAATGTTGGTCATATCAAA-3'；阴性对 照scrambledsiRNA(CNsi)购至Invitrogen(Carlsbad,CA)公司。在体转染试剂由 Entranster?公司提供。根据Entranster?在体转染说明书，实验第7周末对糖尿病造模 成功的大鼠进行长非编码核糖核酸N0NRATT021972-siRNA在体小干扰实验。
[0021] 在第7周末将糖尿病造模成模的大鼠随机分成3组，S卩：糖尿病模型+生理盐水 组（DM+NS)，糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰核糖核酸（s