iRNA)处 理组（DM+长非编码核糖核酸N0NRATT021972si)，糖尿病模型+scrambledsiRNA(乱序小 干扰核糖核酸）阴性对照（negativecontrolsiRNA，NCsi)组（DM+NCsi)。DM+长非编码 核糖核酸N0NRATT021972si和DM+NCsi的大鼠分别给予舌下静脉注射长非编码核糖核酸 N0NRATT021972siRNA和NCsiRNA。前期的Ctrl和DM组舌下静脉注射生理盐水，分别成为 生理盐水对照组（Ctrl+NS)和糖尿病模型+生理盐水组（DM+NS)。1周后测血糖后取材（背 根神经节）。
[0022] 2.药物与试剂。
[0023] 链脲佐菌素（Sigma公司），动物体内转染试剂（Entranster?-invivo)。
[0024] 3.主要仪器。
[0025] 罗康全活力型血糖仪（德国罗氏公司）；S〇ftr〇n智能无创血压计-鼠记测仪 (Gene&I公司）；消毒纱布、手巾、棉签等，碘酒及75%酒精，手术器械包：剪刀、眼科小弯镊、 血管钳、丝线、有齿镊等。
[0026] 4.体重测定。
[0027] 分别于第1，5,7,8周末测量各组大鼠体重，每次测量的时间及其他条件保持一 致。
[0028] 5.血糖的测定。
[0029] 分别于第1，5,7,8周末测量各组大鼠空腹血糖和餐后血糖，每次测量的时间及其 他条件保持一致。测血糖时，先将大鼠固定，用酒精棉球擦拭大鼠尾巴，然后用消毒剪刀剪 去尾尖2-3cm，将尾巴上的血直接滴在已准备好的安装在血糖仪上的血糖试纸上。采血结束 后，用碘伏消毒大鼠尾巴伤口。
[0030] 6.大鼠行为学测定。
[0031] 分别于第1，5,7,8周末测量各组大鼠机械缩足反射阈值（MWT)和热缩足反射潜伏 期（TWL)，每次测量的时间及其他条件保持一致。
[0032] (1)机械缩足反射阈值的检测：采用的装置为VonFrey细丝。将大鼠置于长宽高 为20cmX10cmX30cm的透明有机玻璃盒中，并放在铁丝网上，此装置高于实验台，以便能 够清楚地观察大鼠足底，适应半个小时后进行检测。VonFrey的折力分别为0.008、0. 02、 0· 04、0· 07、0· 16、0· 4、0· 6、1· 0、1· 4、2· 0、4· 0、6· 0、8· 0、10· 0、15· 0、26· 0。用细丝刺激大鼠 右足底，每只大鼠每个力度试验10次，相邻两次测试的间隔时间至少为30秒，刺激引起的 反应（如舔足、甩腿等）完全消失后才可以进行下次试验。测量时从最小力度开始，直到某 个力度刺激大鼠引起反应的次数大于5次时，记下此力度，即为机械缩足反射阈值。大于 26.0g时记为26.0g。
[0033] (2)热痛敏缩足反射阈值的检测：本测试采用的仪器是BME-410C型全自动热痛刺 激仪。将与上述相同的玻璃盒放在3mm厚的玻璃板上，大鼠置于玻璃盒中，待适应30分钟 后进行测试。采用热辐射照射大鼠右足底，记录从照射到出现抬腿的时间，即TWL。为防止 组织损伤，切断时间为30s。
[0034]7、大鼠尾神经感觉传导速度的测定。
[0035] 分别于第1，5,7,8周末测量各组大鼠尾神经感觉传导速度。测定前用10%水合氯 醛300mg/kg腹腔注射麻醉，俯卧固定，顺向法测定尾神经感觉传导速度。刺激环状电极位 于尾巴远端，刺激电极阴极（黑色）置于尾神经近端、阳极电极（红色）置于远端，两者相 距lcm;记录环形电极位于刺激点近端10cm处。接地电极置于刺激电极与记录电极之间，刺 激强度固定为1. 2mA。感觉神经传导速度（m/s)=记录电极与刺激电极间距离（10cm)X10/ 潜伏期（ms)，波幅测定取峰-峰值。统计分析比较各组结果。
[0036] 8、逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)。
[0037] (1)提取总RNA并逆转录成cDNA:所有器械均经DEPC处理。在第8周末取材，分 别取各组大鼠背根神经节，用DEPC处理过的PBS冲洗，置于RNAStore液中-20°C保存， 提取RNA时将神经节取出移至加有lmlTrizol匀浆器中，研磨后转移到1. 5ml的无核酶 离心管中，加入0. 2ml氯仿，剧烈震荡15s，静置3min,，低温离心12000gX15min,收集上 层无色液相，加入与液相等体积的异丙醇，混匀，常温静置25min，沉淀RNA，之后4°C离心 12000gX10min，弃上清，在管底可见少许白色沉淀为RNA，加入lml无核酶水配置的75%乙 醇，充分洗涤RNA。4°C离心5000gX3min后，吸弃上清液，倒置2分钟，略干燥（切勿过分干 燥，否则RNA不溶于水），加20μ1无RNase水溶解沉淀。采用50μ1逆转录反应体系：无核 酶水11.75卩1，5父1311打6『10卩1，(1犯133卩1，0118〇丁2卩1，111^2卩1，1?仙81111.25卩1， RNA样本20μ1，共50μ1，离心，恒温37°C水浴1小时。
[0038] (2)设计引物：参考文献设计长非编码核糖核酸N0NRATT021972引物序列。本发 明选用β-actin作为标准内参，引物序列分别为：
[0044] (5)琼脂糖凝胶电泳：制备1. 5 %琼脂糖凝胶，用移液枪取PCR产物按10μL/孔进 行上样，电泳缓冲液为1ΧΤΑΕ，电压100V，电流300mA，电泳时间40min，采用凝胶成像系统 拍照，分析数据。用β-actin作为内参对长非编码核糖核酸N0NRATT021972的密度进行标 化。
[0045] 9、酶联免疫吸附剂测定（Elisa)测定血清TNFa水平。
[0046] (1)血清准备：在第8周末，大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，仰卧位固定经颈动 脉取血，离心管收集血液后室温静置30min，3000g离心lOmin，取上清（即血清），分装 后-20 °C保存；
[0047] (2)检测前20分钟从冰箱取出试剂盒和血清，平衡至室温。并取出所需的板条，剩 余的板条密封后放于4°C保存；
[0048] (3)标准曲线的建立：设立8个标准孔，每孔设立3个复孔作为取平均值。每孔中 加入试剂盒中的样品稀释液100y1，之后弟一孔加入标准品100μ1，混勾后取出100y1加 入到第二个孔中，如此反复对半稀释到第7孔，混匀后，从第7孔中吸取100μ1弃去，每孔 体积均为100μ1，第8个孔为空白对照；
[0049] (4)加样：在剩下的干净板条孔中加入待测血清100μ1，并设立3个复孔作为对 昭. ，
[0050] (5)反应板置于37°C反应120min;
[0051] (6)洗板：用试剂盒中的洗涤液充分洗涤反应板4-6次，最后在滤纸上印干液体。
[0052] (7)在每孔中加入100μ1第一抗体工作液；
[0053] (8)反应板充分混匀后置于37°C作用60min;
[0054] (9)洗板：用试剂盒中的洗涤液充分洗涤反应板4-6次，最后在滤纸上印干液体；
[0055] (10)在每孔中加入100μ1酶标抗体工作液；
[0056] (11)反应板充分混匀后置于37°C作用60min;
[0057] (12)洗板：同上；
[0058] (13)在每孔中加入100μ1底物液，置于37°C避光作用lOmin;
[0059] (14)在每孔中加入150μ1终止液混匀；
[0060] (15)测 450nm处吸光度。
[0061]10、氧化应激水平测定。
[0062] 10. 1、过氧化氢酶（CAT)活性测定。
[0063] CAT分解H202的反应可以通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的Η202与钼酸铵作用 可以生成一种淡黄色的络合物，于405nm处测定其生成量，可以计算出CAT的活力，以每毫 升血清每秒钟分解的1μmol的H202的量为一个活力单位。由南京建成公司提供的CAT试 剂盒中包含以下试剂：
[0064] 试剂一：液体100ml1瓶，4°C保存；
[0065] 试剂二：底物液体10ml1瓶，4°C保存；
[0066] 试剂三：显色粉剂1瓶，临用前加双蒸水至100ml溶解，4°C保存；
[0067] 试剂四：液体10ml1瓶，4°C保存。
[0068] 操作步骤如下：
[0069]
[0070] CAT活力计算公式为：
[0071]
[0072] 10. 2、超氧化物歧化酶（SOD)活性测定。
[0073] 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统生成超氧阴离子自由基（02 ·)，后者氧化羟 胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈紫红色，测定其吸光度。当被检样品中含有S0D时， 其对超氧阴离子自由基有专一的抑制作用，使其形成的亚硝酸盐减少。通过公式可计算求 出被检样品的S0D活力。由南京建成公司提供的S0D试剂盒中包含以下试剂：
[0074] 试剂一 备液10ml1瓶，用时加双蒸水稀释到100ml，4°C保存；
[0075] 试剂二：液体10ml1瓶，4°C保存；
[0076] 试剂三：液体10ml1瓶，4°C保存；
[0077] 试剂四：液体350μ1x2支，4°C保存；4号稀释液10ml1瓶，用时二者按1:14稀 释；
[0078] 试剂五：粉剂1支，用时加70_80°C双蒸水75ml溶解备用；
[0079] 实际六：粉剂1支，用时加双蒸水75ml溶解备用；
[0080] 显色剂的配制：按试剂五：试剂六：冰乙酸=3:3:2的体积比配显色剂。