Nonratt021972小干扰rna在制备糖尿病并发心脏自主神经疾病药物的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及糖尿病并发心脏自主神经病变药物用途发明领域。
【背景技术】
[0002] 糖尿病（DiabetesMellitus，DM)是一组代谢性临床综合征，随着社会的发展和人 们生活水平的提高糖尿病的患病率逐年升高，在发达国家糖尿病患病率已达3 % -7 %，成 为仅次于癌症、艾滋病、心脑血管病之后第4位需要优先考虑的疾病，已成为世界第5位死 亡主因。糖尿病分为1型（胰岛素依赖性）和2型（非胰岛素依赖性）糖尿病。据估计，全 球六个人里面就有一个人处于患糖尿病并发症的危险中。我国糖尿病人群的构成以2型糖 尿病为主，占糖尿病人群的90%以上，严重影响着人民健康和社会发展。糖尿病自主神经病 变（Diabeticautonomicneuropathy,DAN)是一组由自主神经功能和（或）结构受损引发 的征候群，主要累及心血管、胃肠道和泌尿生殖系统，具有起病隐匿、逐渐进展、可于症状出 现前发生、甚少自行缓解的临床特征。其中，糖尿病心脏自主神经病变（Diabeticcardiac autonomicneuropathy,DCAN)危害尤为严重，可以引起无痛性心肌缺血、心肌梗死及恶性 心律失常甚至心源性猝死。自主神经包括交感和副交感神经，从中枢下行的交感或副交感 神经通过外周自主神经节换神经元后支配心脏等内脏器官等。心率和血压的变化直接受到 自主神经系统（交感神经和副交感神经）活动的影响。
[0003] Pannexin-Ι基因是2000年发现的缝隙连接蛋白家族新成员，研究表明 Pannexin-Ι蛋白可以在细胞膜上组成半通道或在细胞间形成缝隙连接通道，参与多种重要 的生理病理过程。缝隙连接半通道（hemichannels)是缝隙连接通道的亚单位，在脊椎动物 体内每一个半通道都是由Connexin或Pannexin蛋白组成的跨膜六聚体所构成，相邻细胞 的两个半通道两两对接形成中空管道，介导小分子物质的流动，实现了细胞间信息和物质 的快速交流与沟通。病理情况下Pannexin-Ι半通道的异常激活，细胞外ATP显著增加，并 作用于嘌呤受体，从而激活Pannexin-Ι半通道介导的ATP诱导的ATP释放，并形成恶性循 环，导致细胞外大量ATP的聚集，引起各种离子的异常流动，从而导致细胞内离子的紊乱及 能量的缺失，出现细胞的肿胀及细胞膜的崩溃，从而涉及炎症、免疫系统以及神经系统的多 种功能紊乱与疾病。
[0004] IRS1是胰岛素信号通路中的关键蛋白，参与细胞的生长和代谢。IRS的磷酸化对 于胰岛素信号途径的转导很重要，其酪氨酸位点磷酸化可使信号正常传导，但是IRS异常 丝氨酸的磷酸化，常导致IRS的降解从而干扰了胰岛素信号的传导，可能是引起胰岛素抵 抗的重要的分子机制。敲除IRS1的小鼠出现2型糖尿病的一系列表现：周围组织的胰岛素 抵抗，高血糖以及β细胞分泌功能障碍，β细胞数目减少。有报道文献IRS异常丝氨酸磷 酸化可介导的背根神经节神经元胰岛素抵抗，并涉及糖尿病周围神经病变的发病机理。
[0005] 大量研究证实，糖尿病高糖高脂毒性时，体内产生过多的自由基不能被清除，即 可产生氧化应激增强。本研究实验结果表明糖尿病大鼠空腹血糖和餐后血糖明显升高， 血清氧化应激指标丙二醛（MDA)增多，谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX)和总一氧化氮合酶 (T-NOS)的活性下降，提示糖尿病大鼠颈上交感神经节存在明显的氧化应激。氧化应激可 诱导大量促炎因子合成释放，引发炎症反应，从而影响神经细胞的功能，改变神经细胞的微 环境，参与或加速糖尿病及其心脏自主神经病变的发生、发展。炎症细胞因子如肿瘤坏死因 子-a(TNF-α)通路的激活，与包括神经病变在内的糖尿病慢性并发症的发生有关。
[0006] 人类和其他高等真核生物的遗传物质只有极小一部分编码蛋白质，而超过97%的 转录产物是功能多样的核糖核酸（RNA)分子，它们无编码蛋白质的功能，统称为非编码核 糖核酸（noncodingRNA，ncRNA)。非编码RNA以RNA形式调苄基因表达。非编码RNA大致分 为2类："看家RNA"与"调控RNA"。"看家RNA"一般都属于组成型表达，是细胞生存以及基 本功能的必需成份。"调控RNA"可分为转录调控子、转录后调控因子、RNA分布调控因子、蛋 白功能调节因子等。"调控RNA"包括微小核糖核酸（miRNA)、小干扰核糖核酸（siRNA)、可转 录的假基因、反义RNA、核调节子等。调节ncRNA又可以分为小非编码核糖核酸（如miRNA、 siRNA)、长于200nt到超过100kb的长非编码核糖核酸（LongnoncodingRNA，LncRNA)。随 着越来越多非编码基因及其功能被识别和揭示，人们逐渐认识到IncRNA虽无编码蛋白质 的功能，但和蛋白质分子一样重要，甚至是主要的功能性分子，在细胞正常生命活动中发挥 重要而广泛的调节作用。研究提示IncRNA表达的变化和影响IncRNA的因素改变均与疾病 有关。我们实验室前期SOLiD高通量大鼠转录组数据库筛选和分子生物学验证确定颈部交 感神经节存在长非编码核糖核酸N0NRATT021972 [http://www.noncode,org]，在糖尿病模 型大鼠颈上交感神经节长非编码核糖核酸N0NRATT021972表达明显增加。本研究通过糖尿 病模型大鼠长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰核糖核酸（RNA)抑制其表达，观察长 非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA在糖尿病并发心脏自主神经病变中的作用及其 调控机制，这对探寻糖尿病神经病变的发病机理及防治的新靶点具有重要意义。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一个目的在于提供长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA的第 一个新用途，即长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA在制备治疗糖尿病并发心脏 自主神经疾病药物中的应用。
[0008] 本发明的第二个目的在于提供长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA的第 二个新用途，即长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA在制备治疗交感神经相关疾 病药物中的应用。
[0009] 本发明的第三个目的在于提供长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA 的第三个新用途，即长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA在制备泛连接蛋 白-l(Pannexin-l)半通道介导的相关疾病的药物中的应用。
[0010] 本发明的第四个目的在于提供长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA 的第三个新用途，即长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA在制备胰岛素受体底 物-l(IRSl)功能异常介导的相关疾病的药物中的应用。
[0011] 本发明通过2型糖尿病大鼠模型，观察长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰 RNA处理后2型糖尿病并发心脏自主神经病变中的作用及其调控机制，为长非编码核糖核 酸N0NRATT021972小干扰RNA用于糖尿病并发并发心脏自主神经病变的预防和治疗提供帮 助。
[0012] 本发明通过建立2型糖尿病大鼠模型，并对前期筛选出的颈上交感神经节高表达 长非编码核糖核酸N0NRATT021972进行小干扰RNA，采用基因芯片技术分析长非编码核糖 核酸N0NRATT021972小干扰RNA处理后引起颈上交感神经节细胞功能相关基因的改变，进 一步通过免疫荧光双标、Real-timePCR和蛋白印迹法对长非编码核糖核酸N0NRATT021972 小干扰RNA后改变最明显的基因进行验证，观察长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰 后血糖、血清白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子（TNF-α)、去甲肾上腺素（NE)以及氧化 应激指标丙二醛（MDA)、谷胱甘肽过氧化氢酶（GSH-PX)和总一氧化氮合酶（T-N0S)的变 化，结合长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA后大鼠血压、心率、心电图指标、心 率变异性和动脉血压压力敏感性等心脏自主功能表现出的差异，评价长非编码核糖核酸 N0NRATT021972小干扰RNA在颈上交感神经节介导糖尿病自主神经功能损伤中的作用及可 能的机制。通过本实验研究以期进一步了解长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA 在糖尿病治疗中的作用及其可能作用的新靶点，并为糖尿病及其并发症的防治提供新的实 验依据。
[0013] 本发明研究显示糖尿病模型大鼠血糖明显升高，并存在明显的氧化应激， Pannexin-Ι表达上调和炎症因子释放增多，IRS1异常丝氨酸磷酸化及IRS1的表达下调，心 脏自主神经功能受损；长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA后，降低大鼠血糖以及 氧化应激水平，抑制糖尿病颈上交感神经节Pannexin-Ι表达的上调和炎症因子的释放，降 低糖尿病颈上交感神经节IRS1异常丝氨酸磷酸化，改善IRS1表达下调并促进颈上交感神 经节细胞生长，对糖尿病受损的心脏自主神经功能产生保护作用。
[0014] 长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA在防治糖尿病及并发疾病的作 用机理涉及：抑制与高糖高脂毒性引发颈上交感神经节/交感PC12细胞长非编码核 糖核酸N0NRATT021972高表达相关的缝隙连接蛋白Pannexin-Ι半通道、胰岛素受体底 物-1(insulinreceptorsubstrate-1,IRS-1)的表达，对糖尿病并发疾病及其它相关疾病 产生防治作用。
[0015] 为了更好地理解本发明的实质，下面以长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干 扰RNA对2型糖尿病模型大鼠交感神经、心血功能异常的作用，及对颈上交感神经节上的缝 隙连接蛋白Pannexin-Ι半通道、胰岛素受体底物-1表达的影响实验和相关结果来证明长 非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA的用途。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明实验各周期各组大鼠血清IL-6的变化图。其中图1 (a)为实验第5 周末，图1 (b)为实验第8周末。实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非 编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA组和糖尿病模型NCsi组；
[0017] 图2为本发明实验第8周末各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的变化图。 实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972小 干扰RNA组和糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组；其中、〈0. 01表示和正常组比 较，##P〈〇. 01表示与糖尿病模型组比较。
[0018] 图3为本发明实验第8周末各组大鼠血清去甲肾上腺素（NE)的变化图。实验分 组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA组和糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性（NCsi)对照组；其中、〈0. 01表示和正常组 比较，##P〈〇. 01表示与糖尿病模型组比较。
[0019] 图4为本发明颈上交感神经节细胞泛连接蛋白一 1 (Pannexin-Ι)和神经元标志物 (NeuN)抗体免疫荧光双标结果图。糖尿病模型组大鼠Pannexin-Ι表达明显高于正常对照 组，长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA处理后模型大鼠的Pannexin-Ι表达降 低。实验分组：正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972 小干扰RNA组和糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组；
[0020] 图5为本发明颈上交感神经节细胞胰岛素受体底物-1 (IRS-1)IRS1受体和神经元 标志物（NeuN)抗体免疫荧光双标结果图。糖尿病模型组大鼠颈上交感神经节IRS1受体表 达显著低于正常对照组，长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA处理后模型大鼠颈